Name: Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj bezkomórkową syntezę białek z ekstraktów E. coli z niedoborem egzonukleazy V. Ta metoda umożliwia bezpośrednie wykorzystanie liniowych matryc DNA bez klonowania, przyspieszając prototypowanie białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ACB i JLF potwierdzają wsparcie finansowe w postaci grantu ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF i JB potwierdzają wsparcie finansowe w postaci grantu ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA i JLF potwierdzają wsparcie finansowe w ramach grantu ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB dziękuje za wsparcie ze strony ERBN, która rozpoczyna projekt "COMPUCELL" (grant numer 657579). Centre de Biochimie Structurale dziękuje za wsparcie ze strony Francuskiej Infrastruktury na rzecz Zintegrowanej Biologii Strukturalnej (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK dziękuje za wsparcie finansowe ze strony departamentu MICA INRAe, Université Paris-Saclay, DIM-RFSI regionu Ile-de-France (IdF) oraz ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Prace te zostały sfinansowane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (European Research Council Consolidator Award, 865973 CLB).

<ol><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).</li>
<li>McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+use+of+linear+DNA+in+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effective use of linear DNA in cell-free expression systems.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328(2021).</li>
<li>Schinn, S. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+directly+from+PCR%3A+progress+and+applications+of+cell-free+protein+synthesis+with+linear+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA.</a> New Biotechnology. 33 (4), 8(2016).</li>
<li>Prell, A., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+linear+and+circular+DNA+with+gaps+by+the+recBC+enzyme+of+Escherichia+coli.+Effects+of+gap+length+and+the+presence+of+cell-free+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts.</a> European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).</li>
<li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li>
<li>Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+containing+%CF%87+sites+enhances+DNA+stability+and+gene+expression+in+E.+coli+cell-free+transcription-translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).</li>
<li>Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+linear+DNA+templates+in+cell-free+expression+systems+from+diverse+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).</li>
<li>Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+protection+of+linear+DNA+in+cell-free+extracts+from+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).</li>
<li>Zhu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell-free+gene+expression+yields+from+linear+templates+in+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens+extracts+by+using+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).</li>
<li>Batista, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+optimized+cell-free+buffer+enables+robust+expression+from+unprotected+linear+DNA+in+exonuclease-deficient+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).</li>
<li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%3A+protocols+for+a+robust%2C+flexible%2C+and+accessible+platform+technology%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> JoVE. (144), e58882(2019).</li>
<li>Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), 8663(2015).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+reduce+variability+in+E.+Coli-based+cell-free+protein+expression+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li>
<li>Cole, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+interlaboratory+cell-free+protein+synthesis+variability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).</li>
</ol>

Tutaj pokazujemy, że lizat komórkowy przygotowany z E. coli BL21 Rosetta2 z nokautem genomowym dla operonu recB lub recBCD wspiera wysoką ekspresję białka z liniowych matryc DNA. Protokół ten opracowuje krok po kroku procedurę kalibracji lizatu specyficzną dla liniowych matryc DNA (ryc. 2), co jest krytycznym krokiem, który prowadzi do wysokiej ekspresji promotorów σ70 w liniowym DNA, osiągając poziomy bliskie plazmidowi dla równomolowych stężeń DNA. Protokół ten p...

Systemy bezkomórkowej syntezy białek (CFPS) są coraz częściej używane jako szybka, prosta i efektywna metoda inżynierii biosensorów, zdecentralizowanej produkcji i prototypowania obwodów genetycznych1. Ze względu na swój ogromny potencjał, systemy CFPS są regularnie stosowane w dziedzinie biologii syntetycznej. Jednak do tej pory systemy CFPS opierają się na kolistych plazmidach, które mogą ograniczać osiągnięcie pełnego potencjału technologii. Przygotowanie plazmidowego DNA zależy od wielu czasochłonnych etapów podczas klonowania i dużej ilości izolacji DNA. Z drugiej strony, amplifikacja PCR z plazmidu lub zsyntetyzowanej matrycy DNA może być wykorzystana do prostego przygotowania matryc CFPS w ciągu kilku godzin2,3. W związku z tym zastosowanie liniowego DNA stanowi obiecujące rozwiązanie dla CFPS. Jednak liniowe DNA jest szybko degradowane przez egzonukleazy naturalnie obecne w ekstraktach komórkowych4. Istnieją rozwiązania, które rozwiązują ten problem, takie jak użycie białka λ-faga GamS class5 lub DNA zawierającego miejsca Chi6 jako środków ochronnych, lub bezpośrednia ochrona liniowego DNA poprzez chemiczną modyfikację jego końców2,7,8,9. Wszystkie te metody wymagają suplementacji ekstraktu komórkowego, co jest kosztowne i czasochłonne. Od dawna wiadomo, że kompleks egzonukleazy V (RecBCD) degraduje liniowe DNA w lizatach komórkowych4. Ostatnio wykazaliśmy, że liniowe DNA może być znacznie lepiej chronione w lizatach z komórek znokautowanych przez geny egzonukleazy (recBCD)10.
W tym protokole, kroki przygotowania bezkomórkowych lizatów ze szczepu E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD metodą lizy sonikacyjnej są szczegółowo opisane. Liza sonikacji jest powszechną i niedrogą techniką stosowaną przez kilka laboratoriów11,12. Ekstrakty wyprodukowane z tego szczepu nie wymagają dodawania żadnego dodatkowego składnika ani modyfikacji matrycy DNA, aby wspomóc ekspresję z liniowych matryc DNA. Metoda opiera się na podstawowym etapie optymalizacji buforu dla ekstraktów komórkowych specjalnie pod kątem liniowej ekspresji DNA z natywnych promotorów E. coli. Wykazano, że ta specyficzna optymalizacja buforu dla liniowej ekspresji DNA jest kluczem dla natywnych promotorów σ70 do uzyskania wysokiej produkcji białka bez suplementacji białka GamS lub Chi DNA, unikając nawet oczyszczania produktów PCR10. Stwierdzono, że optymalne stężenie Mg-glu dla liniowej ekspresji DNA jest podobne do stężenia plazmidowego DNA. Jednak optymalne stężenie K-glu wykazało znaczną różnicę między liniowym a plazmidowym DNA, prawdopodobnie ze względu na mechanizm związany z transkrypcją10. Funkcjonalność białek eksprymowanych za pomocą tej metody została wykazana w kilku zastosowaniach, takich jak szybkie badania przesiewowe przełączników toehold i ocena aktywności wariantów enzymów10.
Ten protokół zapewnia proste, efektywne i opłacalne rozwiązanie do korzystania z liniowych matryc DNA w systemach bezkomórkowych E. coli, po prostu używając zmutowanych ekstraktów komórkowych ΔrecBCD i specyficznej kalibracji dla liniowego DNA jako szablonu.

<table><tbody><tr><td>2-YT Bulion</td><td>Invitrogen</td><td>22712020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1,5 ml mikroprobówka 1,5 ml</td></tr><tr><td>384-dołkowa mikropłytka z kwadratowym dnem</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>3PGA (disodium kwasu D-(-)-3-fosfoglicerynowego)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>uszczelka na płytkę samoprzylepną</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td></td><td></td>232701</tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>ATP (hydrat soli disodowej adenozyno-5'-trifosforanu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2</td><td>Merck Millipore</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 &Delta; recB</td><td>Addgene</td><td>176582</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 i Delta; recBCD</td><td>Addgene</td><td>176583</td><td></td></tr><tr><td>cAMP (Adenozyno-3' 5'-cykliczny monofosforan)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>CoA (hydrat koenzymu A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 ml probówki wirówkowe PP, stojak pakowany z nasadką CentriStar, sterylna</td> probówka <td>Corning</td><td>430790</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Corning 50 ml PP probówki wirówkowe, stożkowe dno z nasadką CentriStar, sterylna</td> probówka <td>Corning</td><td>430828</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>CTP (cytydyna 5'-trifosforan, sól disodowa hydrat)</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp; J62238</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Kwas folinowy (stała sól wapniowa kwasu folinowego)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>GTP (5?-trifosforan guanozyny,&nbsp; Sól disodowa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>371701</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; H3375</td><td></td></tr><tr><td>K fosforan dwuzasadowy (K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>231-834-5</td><td></td></tr><tr><td>K fosforan jednozasadowy (H2KO4P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>K-glutaminian</td><td>Alfa</td><td>Aesar A17232</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutaminian&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; m, polieterosulfon</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>filtr membranowy 0,22 i mikro; m</td></tr><tr><td>Monarch PCR & Zestaw do oczyszczania DNA</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td>PCR & Zestaw do oczyszczania DNA</td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania plazmidu Monarch NEB</td><td></td><td>T1010S</td><td>Zestaw do miniprzygotowania plazmidu</td></tr><tr><td>NAD (hydrat dinukleotydu B-nikotynamidoadeninowego)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>Zgodny z NIST standard FITC</td><td>Invitrogen</td><td>F36915</td><td>Zestaw NIST-FITC</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740414.1</td><td>Zestaw Plasmid Maxiprep</td></tr><tr><td>PEG 8000</td> Czytnik płytek <td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biotek&nbsp;</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone rekombinowane białko EGFP</td><td>Chromotek</td><td>egfp-250</td><td>Rekombinowany eGFP</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>Polimeraza DNA</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix New</td><td>England Biolabs</td><td>M0492L</td><td>Zestaw</td></tr><tr><td>testowy Qubit dsDNA BR</td> Test fluorometryczny <td>Thermo</td><td>Q32850</td><td>z barwnikiem wiążącym DNA</td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>biotechrabbit BR1401801</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td></td><td></td><td>Oczyszczona woda z systemu Millipore RiOs 8, sterylizowana w autoklawie.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Produkty Life Science Cytiva</td><td>17-1321-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Procesor ultradźwiękowy Komórka wibracyjna VC-505</td><td>SONICS</td><td>VC505</td><td>sonikator</td></tr><tr><td>UTP Na3 (5'-trifosforan urydyny, hydrat soli trisodowej)</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td></td><td></td>226310010</tr><tr><td>Woda, bez nukleaz</td><td>Thermo</td><td>R0581</td><td>woda bez nukleaz</td></tr></tbody></table>

bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc dna

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

Bezkomórkowa synteza białek (CFPS) stała się ostatnio bardzo popularna w dziedzinie biologii syntetycznej ze względu na swoje liczne zalety. Wykorzystanie liniowych matryc DNA dla CFPS pozwoli technologii osiągnąć pełny potencjał, skracając czas eksperymentu poprzez wyeliminowanie etapów klonowania, transformacji i ekstrakcji plazmidu. Liniowe DNA można szybko i łatwo amplifikować metodą PCR w celu uzyskania wysokich stężeń matrycy, unikając potencjalnej toksyczności ekspresji in vivo. Jednak liniowe matryce DNA są szybko degradowane przez egzonukleazy, które są naturalnie obecne w ekstraktach komórkowych. Istnieje kilka strategii, które zostały zaproponowane w celu rozwiązania tego problemu, takie jak dodawanie inhibitorów nukleaz lub chemiczna modyfikacja liniowych końców DNA w celu ochrony. Wszystkie te strategie kosztują dodatkowy czas i zasoby i nie pozwalają jeszcze uzyskać poziomów ekspresji białek bliskich plazmidowi. Szczegółowy protokół alternatywnej strategii przedstawiono tutaj dotyczący stosowania liniowych matryc DNA dla CFPS. Dzięki zastosowaniu ekstraktów komórkowych z komórek nokautujących z niedoborem egzonukleazy, liniowe matryce DNA pozostają nienaruszone bez konieczności jakichkolwiek modyfikacji końcowych. Przedstawiamy etapy przygotowania lizatu komórkowego ze szczepu Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD metodą lizy sonikacyjnej i kalibracji buforu dla Mg-glutaminianu (Mg-glu) i K-glutaminianu (K-glu) specjalnie dla liniowego DNA. Metoda ta jest w stanie osiągnąć poziomy ekspresji białek porównywalne do tych z plazmidowego DNA w CFPS E. coli.

Przedstawione są tutaj reprezentatywne wyniki po kalibracji lizatu w celu uzyskania optymalnych poziomów glutaminianu Mg i glutaminianu K oddzielnie dla liniowego i plazmidowego DNA (Rysunek 1). Optymalne stężenie glutaminianu Mg jest podobne dla ekstraktów ΔrecB i ΔrecBCD i wynosi 8 mM (Rysunek 1B). Jednakże optymalne stężenie glutaminianu K dla plazmidowego DNA wynosi 140 mM, podczas gdy optymalne stężenie glutaminianu K dla liniowego DNA dla...

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania i kalibracji buforu ekstraktów komórkowych z egzonukleazy V nokautujących szczepów Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD i ΔrecB). Jest to szybkie, łatwe i bezpośrednie podejście do ekspresji w bezkomórkowych systemach syntezy białek przy użyciu liniowych matryc DNA.

Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA ...

Protokół jest bardzo istotny, ponieważ umożliwia szybkie, łatwe i bezpośrednie wykorzystanie liniowych matryc DNA w bezkomórkowych systemach syntezy białek, nawet z natywnych parametrów E. coli. Główne zalety to oszczędność czasu dzięki unikaniu klonowania, chemicznym modyfikacjom liniowych końcówek DNA oraz suplementom ochronnym, takim jak gamma lub chi DNA. Ponieważ samoraportujące ekstrakty syntezowe są opracowywane dla różnych organizmów będących przedmiotem zainteresowania, nasza metoda przedstawia sposób na przyspieszenie prototypowania w tych ekstraktach przy użyciu liniowego DNA.Na początek odcedź BL21 Rosetta-2 delta recBCD z bulionu glicerolowego o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 2x płytkę agarową YTP, która zawiera 10 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zaszczepij pojedynczą kolonię z płytki agarowej w nieco ponad 40 mililitrach 2x YTP uzupełnionych 10 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem 200 obr./min. Następnie stwórz subkulturę, rozcieńczając kulturę przez noc 100 razy w czterech litrach świeżej pożywki 2x YTP zawierającej 10 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu.Podzielić cztery litry pożywki na cztery oddzielne kolby. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 200 obr./min, przez około trzy do czterech godzin wzrostu, aby osiągnąć gęstość optyczną od 1,5 do 2,0. Umieścić kulturę na lodzie, odwirować komórki w temperaturze 5 000 G przez 12 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odrzucić supernatant przez dekantację.Następnie ponownie zawieś granulki ogniw w 800 mililitrach schłodzonego S30A za pomocą naziemnej telewizji cyfrowej. Ponownie odwirować komórki w temperaturze 5 000 G przez 12 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jak wykazano wcześniej, i odrzucić supernatant przez dekantację. Po ponownym wymieszaniu granulek ogniw w 160 mililitrach schłodzonego S30A za pomocą naziemnej telewizji cyfrowej, przenieś ogniwa do schłodzonych i wstępnie zważonych probówek o pojemności 50 mililitrów.Wirować komórki w temperaturze 2000 G przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odrzucić supernatant przez dekantację. Ponownie wirować komórki w temperaturze 2000 G przez cztery minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie ostrożnie usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety. Następnie ponownie zmierz wagę probówki, aby obliczyć wagę osadu komórkowego i utrzymuj granulki komórkowe w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Po pobraniu granulek komórkowych od minus 80 stopni Celsjusza, rozmrozić je na lodzie przez jedną do dwóch godzin i ponownie zawiesić granulki komórkowe w 0,9 mililitra S30A z buforem DTT na gram masy ogniwa. Następnie powoli pipetować, aby ponownie zawiesić komórki, unikając w jak największym stopniu piany wierzchniej. Umieść jednomililitrowe porcje zawieszonych komórek w 1,5-mililitrowych mikroprobówkach i trzymaj je na lodzie lub wstępnie schłodzonym zimnym bloku w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie, poddaj sonikacji każdą probówkę w sonikatorze o amplitudzie 20% przez trzy cykle i odwiruj lizat przy 12 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zebraniu supernatantu za pomocą pipety przenieść do 50-mililitrowej probówki. Inkubować lizat komórkowy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy mieszaniu 200 obr./min przez 80 minut.Po odwirowaniu lizatu i zebraniu supernatantu we wstępnie schłodzonych mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra, podwielokrotność 30 mikrolitrów we wstępnie schłodzonych probówkach z 8 paskami PCR, trzymając wszystkie probówki na lodzie. Błyskawiczne zamrożenie porcji lizatu na suchym lodzie i przechowywanie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z zakładką przygotowania buforu, zgodnie z opisem w manuskrypcie.Aby uzyskać objętość reakcji 10,5 mikrolitra, dodaj 1,05 mikrolitra o różnych stężeniach podstawowych Mg-glutaminianu i 9,45 mikrolitra mieszanki głównej i delikatnie wymieszaj. Odpipetować 10 mikrolitrów powyższych reakcji do mikropłytki o kwadratowym dnie z 384 dołkami i przykryć ją za pomocą samoprzylepnej uszczelki płytkowej. Zmierz ekspresję genów jako wyjście fluorescencji, rejestrując dane fluorescencji za pomocą czytnika płytek w regularnych odstępach czasu przez osiem godzin inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza z ciągłym wytrząsaniem orbitalnym z prędkością 307 cykli na minutę.Po zidentyfikowaniu stężenia Mg-glutaminianu, które daje najwyższą wartość fluorescencji w punkcie końcowym, przystąp do kalibracji K-glutaminianu. Przeprowadź eksperyment i zidentyfikuj najwyższą wartość fluorescencji spośród badanych stężeń K-glutaminianu, identyfikując w ten sposób optymalny skład buforowy dla Mg-glutaminianu i K-glutaminianu dla tego lizatu. Po ustaleniu wartości Mg-glutaminianu i K-glutaminianu należy przygotować probówki podstawowe o zoptymalizowanym składzie buforowym zgodnie z uzyskaną objętością partii.Po obliczeniu liczby potrzebnych probówek buforowych, porcję 38 mikrolitrów na probówkę i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Najpierw oznacz mikroprobówkę o pojemności 1,5 mililitra, aby uzyskać optymalne przygotowanie mieszanki głównej. Dodaj odpowiednie objętości buforu i lizatu i delikatnie je wymieszaj.Następnie najpierw pipetuj próbki DNA, następnie wodę wolną od nukleaz, a na końcu optymalną mieszankę główną. Reakcję bezkomórkową należy delikatnie wymieszać pipetą tuż przed dodaniem do czytnika płytek i unikać pęcherzyków. Po ustawieniu reakcji w czytniku płytek, przebiegi kinetyczne rejestrowały dane fluorescencji w regularnych odstępach czasu przez osiem godzin inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza z ciągłym wytrząsaniem orbitalnym z prędkością 307 cykli na minutę.Po kalibracji lizatu optymalne stężenie Mg-glutaminianu było podobne i wynosiło osiem milimoli w ekstraktach zarówno dla liniowego, jak i plazmidowego DNA. Jednak optymalne stężenie K-glutaminianu dla plazmidowego DNA wynosi 140 milimolów, podczas gdy optymalne stężenie K-glutaminianu dla liniowego DNA wynosi 20 milimolów. Po etapach kalibracji porównano poziomy ekspresji GFP między liniowym i plazmidowym DNA w ekstraktach typu dzikiego, delta recB i delta recBCD.Ekspresja GFP z liniowego DNA osiągnęła 102% i 138% ekspresji z plazmidowego DNA w ekstraktach ze szczepów delta recB i delta recBCD, odpowiednio. Najważniejszymi elementami protokołu są sonikacja, liza komórki i etapy kalibracji buforu oddzielnie dla DNA liniowego i plazmidowego, szczególnie w przypadku stosowania parametrów natywnych. Technika ta pomogłaby przyspieszyć testowanie projektów biologicznych w systemach bezkomórkowych, na przykład badania przesiewowe bioczujników, enzymów i szlaków lub prototypowanie syntetycznych obwodów genetycznych.

cell-free-protein-synthesis-from-exonuclease-deficient-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Źródło: Wiegand, D. J., et al. Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje zastosowanie bakteryjnego, bezkomórkowego systemu ekspresji białek opartego na surowym lizacie Vibrio natriegens do przeprowadzenia sprzężonej transkrypcji i translacji in vitro. Skupia się na przygotowaniu głównej mieszanki z niezbędnymi składnikami i stopniowej syntezie funkcjonalnych białek z matrycy DNA.

Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu ekstraktu z surowych komórek bakteryjnych

Ten artykuł przedstawia czułą metodę o nazwie Circle-Seq do oczyszczania pozachromosomalnego kolistego DNA (eccDNA). Metoda obejmuje oczyszczanie kolumny, usuwanie pozostałego liniowego chromosomalnego DNA, amplifikację w okręgu toczonym i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Circle-Seq ma zastosowanie do badań przesiewowych eukariotycznego eccDNA w skali genomu oraz badania niestabilności genomu i zmienności liczby kopii.

Oczyszczanie całego genomu pozachromosomalnego kolistego DNA z komórek eukariotycznych

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Bezkomórkowe systemy ekspresji są potężnymi i opłacalnymi narzędziami do wysokoprzepustowej syntezy i badań przesiewowych ważnych białek. W tym miejscu opisujemy przygotowanie bezkomórkowego systemu ekspresji białek przy użyciu natriegenów Vibrio do szybkiej produkcji białek przy użyciu plazmidowego DNA, liniowego DNA i matrycy mRNA.

Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens

Klonujemy i analizujemy geny reporterowe generujące koliste RNA. Te geny reporterowe są większe niż konstrukty do analizy splicingu liniowego i zawierają elementy Alu. Aby zbadać koliste RNA, konstrukty są transfekowane do komórek, a otrzymany RNA jest analizowany za pomocą RT-PCR po usunięciu liniowego RNA.

Wykorzystanie pierwiastka aluminiowego zawierającego minigeny do analizy kolistych RNA

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Ten protokół opisuje szybką i prostą metodę produkcji lizatu bakteryjnego do ekspresji genów bez komórek, przy użyciu zmodyfikowanego szczepu Escherichia coli i wymagającego jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego

Dobrze scharakteryzowane części genetyczne są niezbędne do projektowania nowych obwodów genetycznych. W tym miejscu opisujemy ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę szybkiego charakteryzowania części genetycznych. Nasza metoda zmniejsza koszty i czas dzięki połączeniu lizatów bezkomórkowych, liniowego DNA w celu uniknięcia klonowania oraz akustycznej obsługi cieczy w celu zwiększenia przepustowości i zmniejszenia objętości reakcji.

Szybka charakterystyka części genetycznych za pomocą systemów bezkomórkowych

Ta praca opisuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Escherichia coli (E. coli), po którym następują reakcje syntezy białek bez komórek (CFPS) w czasie krótszym niż 24 godziny. Wyjaśnienie protokołu autoindukcji bezkomórkowej (CFAI) zawiera szczegółowe informacje o ulepszeniach wprowadzonych w celu zmniejszenia nadzoru badaczy i zwiększenia ilości uzyskiwanego ekstraktu komórkowego.

Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Poznaj bezkomórkową syntezę białek z ekstraktów E. coli z niedoborem egzonukleazy V. Ta metoda umożliwia bezpośrednie wykorzystanie liniowych matryc DNA bez klonowania, przyspieszając prototypowanie białek.

Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA

Przeglądaj więcej filmów