Kwantyfikacja immunologicznie barwionej kaspazy-9 w tkance siatkówki
25 lipca 2022
Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół immunohistochemiczny do identyfikacji, walidacji i celowania w funkcjonalnie istotne kaspazy w złożonych tkankach.
Protokół ten zapewnia szczegółową metodę immunohistochemiczną do identyfikacji, walidacji i celowania w funkcjonalnie istotne kaspazy w złożonych tkankach. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia badanie specyficznych dla typu komórki funkcji apoptozy i nieapoptozy kaspazy-9 i może być stosowana do innych złożonych tkanek i kaspaz będących przedmiotem zainteresowania. Zrozumienie funkcji kaspaz może pomóc w poszerzeniu obecnej wiedzy w dziedzinie biologii komórki, a także może być korzystne w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych ze względu na ich udział w chorobie.
Rozpocznij ilościowe określanie poziomów kaspazy za pomocą obrazów mikroskopii konfokalnej barwionych skrawków siatkówki. Aby to zrobić, przeciągnij pliki obrazów kanałów 405, 470, 555 i 640 do konsoli Fidżi. Kliknij karty obrazu, koloru i scalania kanałów, aby przypisać kolory do plików.
Następnie skompresuj stos Z, klikając stos obrazów i projekt Z. Wybierz typ projekcji jako maksymalną intensywność. Otwórz interfejs kanału, klikając obraz, a następnie narzędzie kanału koloru.
Następnie otwórz interfejs jasności i kontrastu. Aby wybrać parametry dla każdego kanału, przejdź do zakładki kanału i wybierz jeden kanał. Umieść kursor na tle i dodaj adnotację do wartości pikseli.
Następnie umieść kursor na komórce wyrażonej przez kaspazę i dodaj adnotację do wartości piksela. Aby przetestować parametry, przejdź do interfejsu jasności i kontrastu i kliknij wybierz. Podłącz minimalną wyświetlaną wartość lub wartość piksela komórki wyrażonej kaspazą.
Następnie podłącz maksymalną wyświetlaną wartość lub wartość pikseli tła przed kliknięciem OK. Wybierz losowe obrazy z zaślepionej tkanki i powtórz wybór parametrów dla każdego kanału, aby przetestować parametry dla wszystkich kanałów. Po ustawieniu parametrów otwórz pliki obrazów i skompresuj stos Z.
Dodaj parametry jasności i kontrastu dla kanału kaspazy i izolektyny dla kanału znacznika naczyniowego. Użyj narzędzia punktowego i określ ilościowo liczbę dodatnich obszarów naczyniowych za pomocą kolokalizacji markera naczyniowego z ekspresją kaspazy jako odczytem obszarów dodatnich. Następnie, używając haczyków jako markera dodatnich obszarów neuronalnych, określ ilościowo liczbę dodatnich obszarów naczyniowych.
Dodaj adnotacje do wartości w arkuszu kalkulacyjnym dla każdego obrazu i uśrednij wartości według sekcji. Uśrednij wartości przekroju, które będą odczytem na oko. W protokole zidentyfikowano lokalizację komórkową kaspaz i neuronalnych warstw siatkówki, w których kaspazy są wyrażane.
Przekrój poprzeczny siatkówki pozwolił na wizualizację jąder siatkówki w warstwie zwoju siatkówki lub RGL, warstwie międzyjądrowej lub INL oraz zewnętrznej warstwie jądrowej lub ONL w przypadku barwienia haczykami. W przekroju poprzecznym naczynia krwionośne siatkówki wydawały się rozłączone i oddzielone, zaopatrując warstwy splotowate między RGL i INL oraz między INL i ONL. Przekroje poprzeczne siatkówki zidentyfikowały również wysoce regulowaną kaspazę-9, jeden dzień po niedrożności żyły siatkówki.
Hamowanie kaspazy-9 było bardziej skuteczne w zmniejszaniu neuronalnej ekspresji kaspazy-7 u myszy z nokautem komórek śródbłonka, co potwierdziło funkcjonalne znaczenie kaspazy śródbłonka-9. Reprezentatywna analiza wykazała, że hamowanie aktywności kaspazy-9 farmakologicznie blokowało ekspresję kaspazy-7 po niedrożności żyły siatkówki. Sukces tej techniki opiera się na starannym przygotowaniu tkanek, a także na IHC i obrazowaniu mikroskopowym w celu zapewnienia spójności, trafności i wiarygodności danych.
Metodę tę można połączyć z analizą western blot w celu półilościowego porównania sygnalizacji kaspazy. Technika ta pozwoliła na zbadanie skuteczności podejścia terapeutycznego ukierunkowanego na aktywną kaspazę-9 w RVO. Podejście to można również zastosować do innych tkanek, w tym mózgu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół immunohistochemiczny służący do identyfikacji, walidacji i celowania w funkcjonalnie istotne kaspazy w złożonych tkankach. Metoda ta umożliwia specyficzną analizę funkcji apoptotycznych i nieapoptotycznych kaspazy-9, poszerzając wiedzę na temat biologii komórki oraz potencjalnych celów terapeutycznych w kontekście chorób.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Patologia
Wstęp
- Kaspazy odgrywają krytyczną rolę w apoptozie i różnych funkcjach komórkowych.
- Zrozumienie ich specyficznych ról jest kluczowe dla identyfikacji celów terapeutycznych w chorobach.
- Immunohistochemia zapewnia szczegółową wizualizację ekspresji białek w tkankach.
- Niniejsze badanie koncentruje się na lokalizacji kaspaz w warstwach siatkówki, w szczególności kaspazy-9.
Cel badania
- Opracowanie protokołu identyfikacji i kwantyfikacji ekspresji kaspaz.
- zbadanie znaczenia funkcjonalnego kaspaz w złożonych tkankach, w szczególności w siatkówce.
- Walidacja wyników pod kątem potencjalnych implikacji terapeutycznych.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano mikroskopię konfokalną do obrazowania przekrojów siatkówki barwionych pod kątem obecności kaspaz oraz markerów naczyniowych.
- Analiza obejmuje ilościowe określenie poziomu kaspaz za pomocą obrazowania wielokanałowego i kompresji stosu Z (Z stack).
- Podkreślono znaczenie starannego przygotowania tkanek oraz technik obrazowania w celu zapewnienia wiarygodności wyników.
- Sugeruje się możliwość połączenia tej metody z analizą western blotting w celu przeprowadzenia oceny półilościowej.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na identyfikację specyficznej lokalizacji i ekspresji kaspaz w różnych warstwach siatkówki.
- Hamowanie kaspazy-9 wykazało istotny wpływ na ekspresję kaspazy-7 w specyficznych modelach knockout.
- Wyniki potwierdzają funkcjonalną istotność kaspazy-9 w kontekście zakrzepicy żyły środkowej siatkówki.
- Technika ta potwierdza wysoką spójność i wiarygodność w pozyskiwaniu danych.
Wnioski
- Metoda ta stanowi niezawodne narzędzie do badania funkcji kaspaz w złożonych tkankach.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów neuronalnych zaangażowanych w apoptozę oraz potencjalnych interwencji.
- Wnioski wyciągnięte z tego protokołu mogą pomóc w opracowaniu przyszłych strategii terapeutycznych celujących w szlaki związane z apoptozą.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe barwienie immunohistochemiczne kaspazy-9 w tkance siatkówki umożliwia precyzyjną analizę szlaków apoptycznych i nieapoptycznych, wspierając redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu oraz dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju projektów w portfelach chorób neurodegeneracyjnych i naczyniowych, z uwzględnieniem analizy ryzyka. Możliwość adaptacji tej metody do innych tkanek czyni ją reużywalnym narzędziem dla programów odkrywania leków w różnych wskazaniach terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną kaspazy-9 jako celu terapeutycznego istotnego dla choroby w kontekstach neuronalnym i naczyniowym.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie apoptycznej od nieapoptycznej aktywności kaspazy-9 na poziomie typu komórek.
- Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczenie ilościowych dowodów na związanie z celem oraz swoistość szlaku.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane modele tkanki siatkówki do późniejszego screeningu związków oraz oceny ich skuteczności.
- Standaryzuje kwantyfikację immunohistochemiczną w celu uzyskania powtarzalnych, ilościowych wyników w różnych eksperymentach.
- Umożliwia wiarygodną ocenę potencjalnych inhibitorów celujących w kaspazę-9 lub pokrewne szlaki sygnałowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami poszukiwania biomarkerów translacyjnych poprzez mapowanie lokalizacji kaspazy-9 w warstwach siatkówki istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w modelach zakrzepicy żyły środkowej siatkówki oraz neurodegeneracji.
- Umożliwia predykcyjną redukcję ryzyka w przypadku podejść terapeutycznych celujących w szlaki zależne od kaspaz.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół immunobarwienia i kwantyfikacji integruje etapy od wczesnego odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając walidację celu, identyfikację związku wiodącego oraz rozwój biomarkerów translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących funkcji kaspazy-9 oraz zaangażowania jej szlaku sygnałowego w siatkówce i innych złożonych tkankach.
- Screening: Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki immunohistochemiczne do oceny związków.
- Analityka: Dostarcza kwantyfikację opartą na pikselach oraz wskaźniki kolokalizacji w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Łączy dane o lokalizacji komórkowej z modelami chorób i strategiami biomarkerów.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Adaptowalny protokół dla różnych typów tkanek i członków rodziny kaspaz w programach B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji, powtarzalności i skalowalności testów immunohistochemicznych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie istotności celu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów dotyczących szlaków naczyniowo-mózgowych i apoptotycznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie immunohistochemii, obrazowania konfokalnego oraz ilościowej analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do wielokanałowej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania do przetwarzania obrazów, takiego jak Fiji.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja parametrów barwienia, obrazowania i kwantyfikacji.
- Metoda może zostać dostosowana do innych tkanek i celów kaspaz po optymalizacji protokołu.
- Niezawodność danych zależy od starannego przygotowania tkanek i spójności procesu obrazowania.
