Kwantyfikacja immunologicznie barwionej kaspazy-9 w tkance siatkówki

Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół immunohistochemiczny do identyfikacji, walidacji i celowania w funkcjonalnie istotne kaspazy w złożonych tkankach.

Protokół ten zapewnia szczegółową metodę immunohistochemiczną do identyfikacji, walidacji i celowania w funkcjonalnie istotne kaspazy w złożonych tkankach. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia badanie specyficznych dla typu komórki funkcji apoptozy i nieapoptozy kaspazy-9 i może być stosowana do innych złożonych tkanek i kaspaz będących przedmiotem zainteresowania. Zrozumienie funkcji kaspaz może pomóc w poszerzeniu obecnej wiedzy w dziedzinie biologii komórki, a także może być korzystne w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych ze względu na ich udział w chorobie.

Rozpocznij ilościowe określanie poziomów kaspazy za pomocą obrazów mikroskopii konfokalnej barwionych skrawków siatkówki. Aby to zrobić, przeciągnij pliki obrazów kanałów 405, 470, 555 i 640 do konsoli Fidżi. Kliknij karty obrazu, koloru i scalania kanałów, aby przypisać kolory do plików.

Następnie skompresuj stos Z, klikając stos obrazów i projekt Z. Wybierz typ projekcji jako maksymalną intensywność. Otwórz interfejs kanału, klikając obraz, a następnie narzędzie kanału koloru.

Następnie otwórz interfejs jasności i kontrastu. Aby wybrać parametry dla każdego kanału, przejdź do zakładki kanału i wybierz jeden kanał. Umieść kursor na tle i dodaj adnotację do wartości pikseli.

Następnie umieść kursor na komórce wyrażonej przez kaspazę i dodaj adnotację do wartości piksela. Aby przetestować parametry, przejdź do interfejsu jasności i kontrastu i kliknij wybierz. Podłącz minimalną wyświetlaną wartość lub wartość piksela komórki wyrażonej kaspazą.

Następnie podłącz maksymalną wyświetlaną wartość lub wartość pikseli tła przed kliknięciem OK. Wybierz losowe obrazy z zaślepionej tkanki i powtórz wybór parametrów dla każdego kanału, aby przetestować parametry dla wszystkich kanałów. Po ustawieniu parametrów otwórz pliki obrazów i skompresuj stos Z.

Dodaj parametry jasności i kontrastu dla kanału kaspazy i izolektyny dla kanału znacznika naczyniowego. Użyj narzędzia punktowego i określ ilościowo liczbę dodatnich obszarów naczyniowych za pomocą kolokalizacji markera naczyniowego z ekspresją kaspazy jako odczytem obszarów dodatnich. Następnie, używając haczyków jako markera dodatnich obszarów neuronalnych, określ ilościowo liczbę dodatnich obszarów naczyniowych.

Dodaj adnotacje do wartości w arkuszu kalkulacyjnym dla każdego obrazu i uśrednij wartości według sekcji. Uśrednij wartości przekroju, które będą odczytem na oko. W protokole zidentyfikowano lokalizację komórkową kaspaz i neuronalnych warstw siatkówki, w których kaspazy są wyrażane.

Przekrój poprzeczny siatkówki pozwolił na wizualizację jąder siatkówki w warstwie zwoju siatkówki lub RGL, warstwie międzyjądrowej lub INL oraz zewnętrznej warstwie jądrowej lub ONL w przypadku barwienia haczykami. W przekroju poprzecznym naczynia krwionośne siatkówki wydawały się rozłączone i oddzielone, zaopatrując warstwy splotowate między RGL i INL oraz między INL i ONL. Przekroje poprzeczne siatkówki zidentyfikowały również wysoce regulowaną kaspazę-9, jeden dzień po niedrożności żyły siatkówki.

Hamowanie kaspazy-9 było bardziej skuteczne w zmniejszaniu neuronalnej ekspresji kaspazy-7 u myszy z nokautem komórek śródbłonka, co potwierdziło funkcjonalne znaczenie kaspazy śródbłonka-9. Reprezentatywna analiza wykazała, że hamowanie aktywności kaspazy-9 farmakologicznie blokowało ekspresję kaspazy-7 po niedrożności żyły siatkówki. Sukces tej techniki opiera się na starannym przygotowaniu tkanek, a także na IHC i obrazowaniu mikroskopowym w celu zapewnienia spójności, trafności i wiarygodności danych.

Metodę tę można połączyć z analizą western blot w celu półilościowego porównania sygnalizacji kaspazy. Technika ta pozwoliła na zbadanie skuteczności podejścia terapeutycznego ukierunkowanego na aktywną kaspazę-9 w RVO. Podejście to można również zastosować do innych tkanek, w tym mózgu.