Name: Kwantyfikacja immunologicznie barwionej kaspazy-9 w tkance siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Naucz się kwantyfikacji kaspazy-9 w siatkówce metodą immunohistochemiczną z użyciem mikroskopii konfokalnej. Ta technika pozwala badać funkcje apoptyczne i nieapoptyczne kaspaz w tkankach nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 oraz National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) of the National Institutes of Health (NIH), numer nagrody F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (do CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (do AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 do CMT) oraz Departament Obrony Wojsk Lądowych/Sił Powietrznych (DURIP do CMT).

Ten protokół jest zgodny z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Eksperymenty na gryzoniach były zatwierdzone i monitorowane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Columbia.
1. Przygotowanie tkanki siatkówki i kriosekcja
<ol>
	<li>Poddaj zwierzęta eutanazji poprzez podanie znieczulenia dootrzewnowego (ketamina (80-100 mg/kg) i ksylazyna (5-10 mg/kg)), a myszy poddane RVO poddaj perfuzji (zobacz8, aby uzyskać szczegółowe informacje) z 4% paraformaldehydem (PFA) za pomocą pompy perystaltycznej. 
	UWAGA: Uszczypnij zwierzę w palec u nogi, aby potwierdzić głębokość znieczulenia przed przystąpieniem do eutanazji i perfuzji. Szczegółowe informacje na temat perfuzji można znaleźć w16.</li>
	<li>Zbierz oczy przez staranne enukleację za pomocą kleszczy i umieść kulę ziemską w 1 ml 4% PFA. Pozostawić oczy na noc w temperaturze 4 °C. Przemyć oczy trzy razy przez 10 minut, dodając 1 ml 1x PBS i umieszczając je w shakerze.</li>
	<li>Zanurz oczy w 1 ml 30% sacharozy na 3 dni, aż osiądą na dnie probówki, wskazując na wchłanianie sacharozy.</li>
	<li>Napełnij oczy środkiem o optymalnej temperaturze cięcia za pomocą strzykawki 30 G, aż oko będzie miało zaokrąglony wygląd (około 50 μl).</li>
	<li>Zanurz oczy w krioformie ze związkiem o optymalnej temperaturze cięcia, aż oczy zostaną zakryte i zamroź w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do kriosekcji.</li>
	<li>Sekcja osadza oczy pod kątem 20 μm na szkiełkach za pomocą kriostatu.
	<ol>
		<li>Usunąć blok związku o optymalnej temperaturze cięcia z krioformy.</li>
		<li>Umieść go na uchwycie kriostatu, dodając związek o optymalnej temperaturze cięcia i umieszczając blok na uchwycie. Pozostaw go w kriostatu, aż zamarznie.</li>
		<li>Przystąp do cięcia bloku z prędkością 20 μm, aż tkanka siatkówki będzie widoczna. 
		UWAGA: Można to potwierdzić za pomocą mikroskopu świetlnego o 30-krotnym powiększeniu (3x obiektyw, 10x okulary). Tkanki można odróżnić od pożywek OCT na podstawie koloru i kształtu.</li>
		<li>Zebrać tkankę siatkówki na szkiełkach mikroskopowych w serii czterech sekcji na szkiełko. 
		UWAGA: Zobacz Rysunek 1A, aby zapoznać się z sugerowanym rozmieszczeniem odcinków siatkówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz szkiełka identyfikatorem, który deidentyfikuje leczenie i genotyp</li>.
	<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu zabarwienia.</li>
</ol>
2. Immunohistochemia
UWAGA: Użyj stałej kriokonserwowanej tkanki do immunohistochemii, aby utrzymać morfologię komórki. Wybierz sekcje, które znajdują się na poziomie obrazów optycznej tomografii koherentnej (OCT) uzyskanych in vivo7. Użyć pierwszych dwóch serii szkiełek pobranych z kriostatu lub skrawków ze 150 μm do tkanki siatkówki.
<ol>
	<li>Umieść szkiełka w ciemnej i wilgotnej komorze szkiełkowej.</li>
	<li>Permeabilizacja i blokowanie: Przemyj przekroje siatkówki 300 μl 1x PBS przez 5 minut, aby usunąć OCT i wyrzucić później.</li>
	<li>Przepuszczalność tkanki należy dodać 300 μl 1x PBS z 0,1% Triton X-100 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) i wyrzucić później.</li>
	<li>Zablokuj tkankę, dodając 300 μl buforu blokującego (10% normalnej surowicy koziej (NGS), 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS, przefiltrowany) i pozostaw na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przeciwciała pierwszorzędowe: Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w buforze blokującym. Stosowane przeciwciała pierwszorzędowe obejmują anty-cl-kaspazę-9 w 1:800, anty-CD31 w 1:50 i anty-kaspazę-7-488 (przeciwciało znakowane bezpośrednio) w 1:150, 
	UWAGA: Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi odpowiedniego rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych.
	<ol>
		<li>Wylej bufor blokujący z odcinków i nałóż 100 μl koktajlu przeciwciał pierwotnych na szkiełka siatkówkowe.</li>
		<li>Inkubować przekroje przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj sekcje cztery razy przez 5 minut 300 μl 1x PBS. 
	UWAGA: Jeśli skrawki tkanek są bardzo delikatne, płyny do płukania należy usunąć za pomocą działania kapilarycznego, przykładając chusteczkę do rogu szkiełka, aby uniknąć przemieszczenia skrawków siatkówki.</li>
	<li>Aby uniknąć znakowania krzyżowego przeciwciał pierwszorzędowych wyhodowanych u tego samego gatunku gospodarza, przed zastosowaniem przeciwciał znakowanych bezpośrednio należy zakończyć barwienie przeciwciałami drugorzędowymi.</li>
	<li>Przeciwciała drugorzędowe: Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w buforze blokującym w stężeniu 0,1%. Na przykład, aby wykryć anty-cl-kaspazę-9, przeciwciało wyhodowane u królika, użyj koziego anty-królika-568 wtórnego.
	<ol>
		<li>Nałóż 200 μl wtórnego koktajlu przeciwciał na siatkówkę.</li>
		<li>Inkubować tkankę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj sekcje cztery razy przez 5 minut 300 μl 1x PBS.</li>
		<li>Barwieć jądra przez 5 minut 300 μl DAPI w rozcieńczeniu 0,02%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyć raz przez 5 minut 300 μL 1x PBS.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na odcinkach siatkówki za pomocą 500 μl podłoża fluoromount-G, które zachowuje sygnał fluorescencyjny, i ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na górze szkiełka, unikając pęcherzyków.</li>
</ol>
3. Obrazowanie konfokalne
<ol>
	<li>Uzyskaj obrazy barwionych skrawków za pomocą mikroskopii konfokalnej.
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop konfokalny.</li>
		<li>Umieść slajd na stole montażowym.</li>
		<li>Dostosuj ostrość, aby wyraźnie widzieć przekrój siatkówki. 
		UWAGA: Zrób co najmniej cztery zdjęcia na sekcję i cztery sekcje na siatkówkę. Zobacz schemat obrazowania siatkówki, aby zapoznać się z sugerowanymi obszarami obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B, C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie kaspazy, barwienia naczyniowego i jądrowego za pomocą mikroskopu konfokalnego z akwizycją stosu Z, przy użyciu obiektywu 20x lub 40x. 
	UWAGA: Parametry obrazowania i konfiguracja oprogramowania powinny być stałe dla wszystkich obrazowań w eksperymencie. Obiektyw 20x zapewnia przegląd warstw siatkówki, które są dobrze zdefiniowane przez barwienie jądrowe. Obiektyw o powiększeniu 40x zapewnia większą szczegółowość połączeń komórkowych.
	<ol>
		<li>Ustaw odpowiednie czasy ekspozycji i intensywności lasera na kanał, klikając przycisk Uzyskaj ustawienia.</li>
		<li>Ustaw stos Z, aby wizualizować całą sekcję, klikając Z-series i ustaw parametry w górę iw dół, aby pokryć głębokość tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz obrazy zgodnie z zamaskowanym identyfikatorem przypisanym podczas kriosekcji.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja poziomów kaspazy
<ol>
	<li>Przeciągnij pliki obrazów kanałów 405, 470, 555 i 640 do konsoli FIDŻI.</li>
	<li>Kliknij opcję Obraz > Kolor > Scal kanały.</li>
	<li>Przypisz kolory do plików w następujący sposób: czerwony do 555, zielony do 470, szary do 405, cyjan do 640.</li>
	<li>Skompresuj stos Z, klikając opcję Obraz > stos > Projekt Z.</li>
	<li>Kliknij opcję Typ projekcji: Maksymalna intensywność.</li>
	<li>Otwórz interfejs kanałów, klikając Obraz > narzędzie Kanały kolorów.</li>
	<li>Otwórz interfejs Jasność i kontrast.</li>
	<li>Wybierz parametry dla każdego kanału.
	<ol>
		<li>Przejdź do sekcji Kanały i wybierz jeden kanał.</li>
		<li>Umieść kursor na górze komórki wyrażonej kaspazy i dodaj adnotację do wartości piksela.</li>
		<li>Umieść kursor na tle i dodaj adnotację do wartości pikseli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parametry testowe
	<ol>
		<li>Przejdź do interfejsu Jasność i kontrast.</li>
		<li>Kliknij przycisk Select (Wybierz).</li>
		<li>Podłącz minimalną wyświetlaną wartość (wartość piksela z adnotacją w komórce wyrażonej kaspazą).</li>
		<li>Podłącz maksymalną wyświetlaną wartość (wartość pikseli tła z adnotacją).</li>
		<li>Kliknij przycisk OK.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 4.8-4.9 dla wszystkich kanałów.</li>
	<li>Przetestuj parametry, wybierając losowe obrazy z zaślepionej tkanki. 
	UWAGA: Parametry jasności i kontrastu należy edytować tylko wtedy, gdy wartość tła nie jest odpowiednia dla innych obrazów.</li>
	<li>Po ustawieniu parametrów otwórz pliki obrazów i skompresuj stos Z.</li>
	<li>Dodaj parametry jasności i kontrastu dla kanału kaspazy i izollektyny, kanału znacznika naczyniowego.</li>
	<li>Użyj narzędzia punktowego, aby określić ilościowo liczbę dodatnich obszarów naczyniowych przy użyciu kolokalizacji markera naczyniowego z ekspresją kaspazy jako odczytu obszarów dodatnich.</li>
	<li>Powtórz krok 4.14, ale używając Hoechsta jako markera neuronalnych obszarów dodatnich.</li>
	<li>Dodawaj adnotacje do wartości w arkuszu kalkulacyjnym dla każdego obrazu.</li>
	<li>Uśrednij wartości według sekcji.</li>
	<li>Uśrednij wartości przekroju - będzie to odczyt na oko.</li>
</ol>
5. Genetyczne potwierdzenie znaczenia kaspazy komórek śródbłonka-9
<ol>
	<li>Użyj siatkówki uzyskanej od myszy Casp9FL/FL-VECad-CreERT2, które zostały poddane działaniu RVO7.</li>
	<li>Barwienie immunologiczne siatkówki w kierunku kaspazy-9 (kaspaza usunięta), kaspazy-7 (kaspaza efektorowa w dół strumienia), markerów naczyniowych i DAPI, jak opisano powyżej w punkcie 2.</li>
	<li>Zobrazować i określić ilościowo zgodnie z powyższym opisem w sekcjach 3 i 4.</li>
</ol>
6. Celowanie w kaspazę-9 w RVO
<ol>
	<li>Uzyskaj oczy od myszy poddanych RVO, a następnie zastosuj miejscowo inhibitor kaspazy-9 Pen1-XBir3 do oczu, jak w7.</li>
	<li>Barwienie immunologiczne siatkówki pod kątem kaspazy-7 (kaspazy efektorowej niższego szczebla), markerów naczyniowych i DAPI, jak opisano powyżej w sekcji 2.</li>
	<li>Zobrazować i określić ilościowo zgodnie z powyższym opisem w sekcjach 3 i 4.</li>
</ol>

<ol><li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+cell+death%2C+inflammation%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li>
<li>Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamirez%2C+MLG+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22">Seminars in Cell & Developmental Biology</a>. 82, Academic Press. 79-85 (2018).</li>
<li>Troy, C. M., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+therapeutic+targets+in+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Caspases: therapeutic targets in neurologic disease.</a> Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).</li>
<li>Avrutsky, M. I., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-9%3A+a+multimodal+therapeutic+target+with+diverse+cellular+expression+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 1728(2021).</li>
<li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147 (4), 742-758 (2011).</li>
<li>Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+caspases+in+the+nervous+system%3A+implications+for+functions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).</li>
<li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173(2020).</li>
<li>Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+retinal+vein+occlusion+mouse+model+to+limit+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62980(2021).</li>
<li>Tisch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-8+modulates+physiological+and+pathological+angiogenesis+during+retina+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).</li>
<li>Chi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB1+promotes+the+activation+of+NLRP3+and+caspase-8+inflammasomes+via+NF-kappaB+pathway+in+acute+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 137(2015).</li>
<li>Thomas, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-2+mediates+site-specific+retinal+ganglion+cell+death+after+blunt+ocular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).</li>
<li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon%2Fneuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li>
<li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence%2C+incidence%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).</li>
<li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon%2Fneuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases%3A+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).</li>
<li>Kuida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+apoptosis+and+cytochrome+c-mediated+caspase+activation+in+mice+lacking+caspase+9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9.</a> Cell. 94 (3), 325-337 (1998).</li>
<li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+in+the+balance%3A+alternative+participation+of+the+caspase-2+and+-9+pathways+in+neuronal+death+induced+by+nerve+growth+factor+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).</li>
</ol>

Autorzy deklarują następujące konkurencyjne interesy: C.M.T. posiada następujące zgłoszenia patentowe US20200164026, US20190142915 i US20150165061. C.M.T. i S.S. posiadają zgłoszenie patentowe w USA 20140024597. C.M.T., A.M.P. i M.I.A. mają zgłoszenie patentowe US2020058683. C.M.T. i Y.Y.J. mają zgłoszenie patentowe WO2018013519. M.I.A. i CMT są wymienieni jako wynalazcy w zgłoszeniu patentowym WO/2020/223212 przez Trustees of Columbia University w Nowym Jorku. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Kaspazy to wieloczłonmowa rodzina proteaz, najlepiej zbadana pod kątem ich roli w śmierci komórki i zapaleniu; Jednak ostatnio odkryto różne funkcje niezwiązane ze śmiercią u niektórych członków rodziny 4,5. Duża część naszej wiedzy na temat funkcji kaspazy pochodzi z prac nad hodowlą komórkową i z danych wnioskowanych dotyczących chorób u ludzi. Chociaż uznaje się, że w chorobie występuje nieprawidłowa indukcja, aktywacja lub inaktywacja kaspaz, trudno było funk...

Kaspazy to rodzina proteaz, które regulują rozwojową śmierć komórki, reakcje immunologiczne i nieprawidłową śmierć komórek w chorobie1,2. Chociaż dobrze wiadomo, że członkowie rodziny kaspazy są indukowani w różnych chorobach neurodegeneracyjnych, zrozumienie, która kaspaza napędza patologię choroby, jest trudniejsze3. Takie badania wymagają narzędzi do identyfikacji, scharakteryzowania i walidacji funkcji poszczególnych członków rodziny kaspazy. Analizowanie odpowiednich poszczególnych kaspaz jest ważne zarówno z mechanistycznego, jak i terapeutycznego punktu widzenia, ponieważ literatura zawiera wiele badań dostarczających dowodów na różnorodne role kaspaz4,5. Tak więc, jeśli celem jest celowanie w kaspazę w chorobie w celu uzyskania korzyści terapeutycznych, bardzo ważne jest, aby mieć konkretne ukierunkowanie na odpowiedniego członka rodziny (członków rodziny). Tradycyjne techniki wykrywania poziomów kaspazy w tkankach obejmują western blotting oraz podejścia enzymatyczne i fluorometryczne3,6. Jednak żaden z tych pomiarów nie pozwala na specyficzne dla komórki wykrywanie poziomów kaspazy, a w niektórych scenariuszach rozszczepione kaspazy często nie mogą być wykryte przez tradycyjne środki analizy białek. Wiadomo, że kaspazy mogą odgrywać różne role apoptotyczne i nieapoptotyczne w tej samej tkance7, dlatego potrzebna jest dokładna charakterystyka poziomów kaspazy specyficznych dla komórki, aby dokładnie zrozumieć szlaki rozwojowe i chorobowe.
To badanie pokazuje aktywację i funkcję kaspazy w modelu niedotlenienia nerwowo-niedokrwiennego - niedrożność żył siatkówki (RVO)7,8. W złożonej tkance, takiej jak siatkówka, istnieje wiele typów komórek, na które może wpływać niedotlenienie-niedokrwienie wywołane w RVO, w tym komórki glejowe, neurony i naczynia krwionośne7. W siatkówce dorosłej myszy występuje bardzo mała ekspresja kaspaz widoczna w zdrowej tkance, mierzona za pomocą immunohistochemii (IHC)7, ale nie ma to miejsca podczas rozwoju9 lub w modelach choroby siatkówki10,11. IHC to technika, która jest dobrze ugruntowana w badaniach biomedycznych i umożliwiła walidację celów chorobowych i patologicznych, identyfikację nowych ról poprzez lokalizację przestrzenną i kwantyfikację białek. W przypadkach, gdy rozszczepione produkty kaspazy nie mogą być wykryte za pomocą western blot lub analizy fluorometrycznej, ani specyficznej lokalizacji komórek odrębnych kaspaz lub badania szlaków sygnałowych kaspazy poprzez lokalizację, należy zastosować IHC.
W celu określenia kaspazy (kaspaz) funkcjonalnie istotnych w RVO, IHC zostało użyte z zatwierdzonymi przeciwciałami dla kaspaz i markerów komórkowych. Poprzednie badania przeprowadzone w laboratorium wykazały, że kaspaza-9 była szybko aktywowana w modelu udaru niedokrwiennego i hamowania kaspazy-9 za pomocą wysoce specyficznego inhibitora chronionego przed dysfunkcją neuronów i śmiercią12. Ponieważ siatkówka jest częścią ośrodkowego układu nerwowego (OUN), służy jako system modelowy do badania i dalszego badania roli kaspazy-9 w uszkodzeniach nerwowo-naczyniowych13. W tym celu mysi model RVO wykorzystano do zbadania specyficznej dla komórki lokalizacji i dystrybucji kaspazy-9 oraz jej wpływu na uszkodzenie nerwowo-naczyniowe. RVO jest częstą przyczyną ślepoty u pracujących dorosłych, która wynika z uszkodzenia naczyniowego14. Stwierdzono, że kaspaza-9 ulega ekspresji w sposób nieapoptotyczny w komórkach śródbłonka, ale nie w neuronach.
Jako tkanka, siatkówka ma tę zaletę, że jest wizualizowana albo jako płaski uchwyt, co pozwala na docenienie sieci naczyniowych, albo jako przekroje, które uwydatniają warstwy siatkówki neuronalnej. Kwantyfikacja ekspresji białka kaspazy w przekrojach poprzecznych zapewnia kontekst, w odniesieniu do którego kaspaza jest potencjalnie krytyczna w łącznościach neuronalnych siatkówki i funkcji widzenia, identyfikując lokalizację kaspazy (kaspaz) w siatkówce. Po identyfikacji i walidacji, ukierunkowanie na badaną kaspazę uzyskuje się za pomocą indukowalnej specyficznej dla komórki delecji zidentyfikowanej kaspazy. W przypadku potencjalnych zapytań terapeutycznych badano znaczenie interesujących nas kaspaz przy użyciu specjalnych narzędzi do hamowania aktywowanej kaspazy. Dla kaspazy-9 komórka przenikała wysoce selektywny inhibitor7,15, użyto Pen1-XBIR3. W tym raporcie wykorzystano 2-miesięczny męski szczep C57BL/6J i indukowany tamoksyfenem szczep kaspazy śródbłonka-9 z nokautem (iEC Casp9KO) o tle C57BL/6J. Zwierzęta te poddano działaniu mysiego modelu RVO, a C57BL/6J leczono selektywnym inhibitorem kaspazy-9, Pen1-XBir3. Opisana metodologia może być zastosowana do innych modeli chorób w systemie centralnym i peryferyjnym7,15.

<table><tbody><tr><td>anty-kaspaza-7 488</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB-56529AF488</td><td>zastosowanie w 1:150</td></tr><tr><td>anty-cl-kaspaza-9</td><td>sygnalizacja komórkowa</td><td>9505-S</td><td>zastosowanie w 1:800</td></tr><tr><td>anty-CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>zastosowanie w 1:50</td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem</td><td>Biovision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI 2.3.0</td><td>open source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluormount G</td><td>Fisher</td><td>50-187-88</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>iCasp9FL / FL X VECad-CreERT2 myszy wygenerowane</td><td></td><td>laboratoryjnie</td><td>zobacz Avrutsky 2020</td></tr><tr><td>Izolektyna (594, 649)</td><td>Wektor</td><td>DL-1207</td><td>zastosowanie w 1:200</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna&nbsp;</td><td>Masterflex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen1-XBir3</td><td>wygenerowany</td><td></td> laboratoryjnie<td>, patrz Avrutsky 2020</td></tr><tr><td>Prism 9.1</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>Fisher</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Vis-a-View 4.0</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja immunologicznie barwionej kaspazy-9 w tkance siatkówki

Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue

Rodzina kaspaz znana jest z pośredniczenia w wielu szlakach komórkowych poza śmiercią komórki, w tym różnicowaniu komórek, odnajdywaniu ścieżek aksonalnych i proliferacji. Od czasu zidentyfikowania rodziny proteaz śmierci komórkowej poszukuje się narzędzi do identyfikacji i rozszerzania funkcji określonych członków rodziny w stanach rozwojowych, zdrowotnych i chorobowych. Jednak wiele z obecnie dostępnych na rynku narzędzi kaspazy, które są szeroko stosowane, nie jest specyficznych dla docelowej kaspazy. W tym raporcie przedstawiamy podejście, które zastosowaliśmy do identyfikacji, walidacji i celowania w kaspazę-9 w układzie nerwowym przy użyciu nowatorskiego inhibitora i podejść genetycznych z odczytami immunohistochemicznymi. W szczególności wykorzystaliśmy tkankę neuronalną siatkówki jako model do identyfikacji i walidacji obecności i funkcji kaspaz. Podejście to umożliwia badanie specyficznych dla typu komórki funkcji apoptozy i nieapoptozy kaspazy-9 i może być stosowane do innych złożonych tkanek i kaspaz będących przedmiotem zainteresowania. Zrozumienie funkcji kaspaz może pomóc w poszerzeniu obecnej wiedzy z zakresu biologii komórki, a także może być korzystne w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych ze względu na ich udział w chorobie.

Opisany protokół pozwala użytkownikowi na analizę i kwantyfikację poziomu kaspazy-9 w tkance siatkówki. Dodatkowo przedstawia on narzędzia do dalszej identyfikacji, walidacji i specyficznego celowania w kaspazę-9 oraz jej substraty w dolnym biegu szlaku. Podsumowane kroki umożliwiają ilościową analizę poziomu kaspaz oraz specyficzności komórkowej na fluorescencyjnych mikrofotografiach. Wszystkie rysunki przedstawiają reprezentatywne mikrofotografie i kwantyfikację wskazanych poziomów kaspaz w całej siatkówce, komórkach ś...

Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół immunohistochemiczny do identyfikacji, walidacji i celowania w funkcjonalnie istotne kaspazy w złożonych tkankach.

Kwantyfikacja immunologicznie barwionej kaspazy-9 w tkance siatkówki

The family of caspases is known to mediate many cellular pathways beyond cell death, including cell differentiation, axonal pathfinding, and ...

Protokół ten zapewnia szczegółową metodę immunohistochemiczną do identyfikacji, walidacji i celowania w funkcjonalnie istotne kaspazy w złożonych tkankach. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia badanie specyficznych dla typu komórki funkcji apoptozy i nieapoptozy kaspazy-9 i może być stosowana do innych złożonych tkanek i kaspaz będących przedmiotem zainteresowania. Zrozumienie funkcji kaspaz może pomóc w poszerzeniu obecnej wiedzy w dziedzinie biologii komórki, a także może być korzystne w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych ze względu na ich udział w chorobie.Rozpocznij ilościowe określanie poziomów kaspazy za pomocą obrazów mikroskopii konfokalnej barwionych skrawków siatkówki. Aby to zrobić, przeciągnij pliki obrazów kanałów 405, 470, 555 i 640 do konsoli Fidżi. Kliknij karty obrazu, koloru i scalania kanałów, aby przypisać kolory do plików.Następnie skompresuj stos Z, klikając stos obrazów i projekt Z. Wybierz typ projekcji jako maksymalną intensywność. Otwórz interfejs kanału, klikając obraz, a następnie narzędzie kanału koloru.Następnie otwórz interfejs jasności i kontrastu. Aby wybrać parametry dla każdego kanału, przejdź do zakładki kanału i wybierz jeden kanał. Umieść kursor na tle i dodaj adnotację do wartości pikseli.Następnie umieść kursor na komórce wyrażonej przez kaspazę i dodaj adnotację do wartości piksela. Aby przetestować parametry, przejdź do interfejsu jasności i kontrastu i kliknij wybierz. Podłącz minimalną wyświetlaną wartość lub wartość piksela komórki wyrażonej kaspazą.Następnie podłącz maksymalną wyświetlaną wartość lub wartość pikseli tła przed kliknięciem OK. Wybierz losowe obrazy z zaślepionej tkanki i powtórz wybór parametrów dla każdego kanału, aby przetestować parametry dla wszystkich kanałów. Po ustawieniu parametrów otwórz pliki obrazów i skompresuj stos Z.Dodaj parametry jasności i kontrastu dla kanału kaspazy i izolektyny dla kanału znacznika naczyniowego. Użyj narzędzia punktowego i określ ilościowo liczbę dodatnich obszarów naczyniowych za pomocą kolokalizacji markera naczyniowego z ekspresją kaspazy jako odczytem obszarów dodatnich. Następnie, używając haczyków jako markera dodatnich obszarów neuronalnych, określ ilościowo liczbę dodatnich obszarów naczyniowych.Dodaj adnotacje do wartości w arkuszu kalkulacyjnym dla każdego obrazu i uśrednij wartości według sekcji. Uśrednij wartości przekroju, które będą odczytem na oko. W protokole zidentyfikowano lokalizację komórkową kaspaz i neuronalnych warstw siatkówki, w których kaspazy są wyrażane.Przekrój poprzeczny siatkówki pozwolił na wizualizację jąder siatkówki w warstwie zwoju siatkówki lub RGL, warstwie międzyjądrowej lub INL oraz zewnętrznej warstwie jądrowej lub ONL w przypadku barwienia haczykami. W przekroju poprzecznym naczynia krwionośne siatkówki wydawały się rozłączone i oddzielone, zaopatrując warstwy splotowate między RGL i INL oraz między INL i ONL. Przekroje poprzeczne siatkówki zidentyfikowały również wysoce regulowaną kaspazę-9, jeden dzień po niedrożności żyły siatkówki.Hamowanie kaspazy-9 było bardziej skuteczne w zmniejszaniu neuronalnej ekspresji kaspazy-7 u myszy z nokautem komórek śródbłonka, co potwierdziło funkcjonalne znaczenie kaspazy śródbłonka-9. Reprezentatywna analiza wykazała, że hamowanie aktywności kaspazy-9 farmakologicznie blokowało ekspresję kaspazy-7 po niedrożności żyły siatkówki. Sukces tej techniki opiera się na starannym przygotowaniu tkanek, a także na IHC i obrazowaniu mikroskopowym w celu zapewnienia spójności, trafności i wiarygodności danych.Metodę tę można połączyć z analizą western blot w celu półilościowego porównania sygnalizacji kaspazy. Technika ta pozwoliła na zbadanie skuteczności podejścia terapeutycznego ukierunkowanego na aktywną kaspazę-9 w RVO. Podejście to można również zastosować do innych tkanek, w tym mózgu.

quantification-of-immunostained-caspase-9-in-retinal-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Katarakta jest główną przyczyną ślepoty na świecie. Promieniowanie ultrafioletowe (UVR) pochodzące ze słońca stanowi główny czynnik ryzyka rozwoju katarakty. Opracowano model zwierzęcy katarakty indukowanej dalekim UVR-B. W niniejszym artykule opisujemy metody badania powstawania katarakty: ekspozycję na UVR, ilościową RT-PCR oraz immunohistochemię.

Charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem UVR in vivo

Źródło: Lani-Louzada, R.,  i inni. Kauteryzacja pełnego koła rąbkowego splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni. J. Vis. Exp. (2022). Ten film pokazuje ilościowe oznaczanie komórek zwojowych siatkówki z chemicznie utrwalonych siatkówk szczurów poddanych pełnej kauteryzacji splotu naczyniowego rąbka. Proces obejmuje przenikanie, barwienie przeciwciał i barwienie przeciwjądrowe, a następnie wizualizację pod mikroskopem epifluorescencyjnym w celu oceny wpływu...

Kwantyfikacja somy komórek zwojowych siatkówki po nadciśnieniu ocznym wywołanym kauteryzacją 

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Zawał mięśnia sercowego (MI) nie tylko powoduje upośledzenie funkcji serca, ale także apoptozę w ciele migdałowatym, regionie mózgu zaangażowanym w behawioralne konsekwencje zawału mięśnia sercowego. Protokół ten opisuje, w jaki sposób indukować zawał mięśnia sercowego, pobierać tkankę ciała migdałowatego i mierzyć w niej aktywność kaspazy-3, markera apoptozy.

Aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura mierzona spektrofluorometrią po zawale mięśnia sercowego

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

Test ochronny został opracowany do monitorowania odporności układu krwionośnego siatkówki na śmierć z powodu urazów związanych z cukrzycą/retinopatią cukrzycową, takich jak stres oksydacyjny i cytokiny.

Test do wykrywania ochrony naczyń krwionośnych siatkówki przed śmiercią związaną z cukrzycą u myszy

Opisano protokół przygotowania kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego na fotoreceptorach. Artykuł ten umożliwia naukowcom konsekwentne wytwarzanie zamrożonych skrawków siatkówki myszy z dobrze zachowaną morfologią i wysokiej jakości wynikami barwienia immunologicznego.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Naucz się kwantyfikacji kaspazy-9 w siatkówce metodą immunohistochemiczną z użyciem mikroskopii konfokalnej. Ta technika pozwala badać funkcje apoptyczne i nieapoptyczne kaspaz w tkankach nerwowych.

Kwantyfikacja immunologicznie barwionej kaspazy-9 w tkance siatkówki

Przeglądaj więcej filmów