Name: Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj metodę wykrywania produktów pośrednich rekombinacji homologicznej w komórkach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu ligacji zbliżeniowej i ilościowej PCR. Technika ta umożliwia badanie białek zaangażowanych w metabolizm pętli D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium Heyer jest wspierana przez granty GM58015 i GM137751 dla W.-D.H. Badania w laboratorium na Piazza są wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (pętla 3D ERC-STG, wielka umowa 851006). D.R. jest wspierany przez T32CA108459 i Fundację A.P. Gianniniego. Dziękujemy Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) za udostępnienie wyników testów DLC/DLE oraz za dodatkową walidację zmian w testach, które są wyszczególnione w tym protokole.

1. Wstępny wzrost, indukcja DSB i pobieranie próbek
UWAGA: Suplementacja wszystkich pożywek 0,01% adeniny jest zalecana dla szczepów Ade.
<ol>
	<li>Na drożdżach peptonowych dekstrozoadeninowych (YPDA) rozprowadzić odpowiednie szczepy haploidalne (patrz Tabela 1) (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy, 2% agaru, 0,001% adeniny) i rosnąć przez 2 dni w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Użyj pojedynczej kolonii do zaszczepienia 5 ml YPDA w szklanej probówce o pojemności 15 ml. Hodować kultury do nasycenia w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem lub obracaniem w celu napowietrzenia.</li>
	<li>Test DLC: Przygotować 5x roztwór podstawowy psoralenu (0,5 mg/ml trioksalenu w 200-procentowym etanolu) w dygestorium, rozpuszczając psoralen w stożkowej probówce o pojemności 50 ml owiniętej folią aluminiową przez noc w temperaturze pokojowej z ciągłym wstrząsaniem lub odwróceniem. Uszczelnij górną część przezroczystej folii, aby zapobiec parowaniu. Nie należy przygotowywać więcej niż 7 ml 5 x roztworu podstawowego psoralenu na 50 ml stożkowej probówki, aby zapewnić prawidłowe rozpuszczenie psoralenu.</li>
	<li>Następnego dnia użyj 5 ml kultury YPDA wyhodowanej przez noc, aby zaszczepić 50-100 ml mleczanu YEP (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% mleczanu w/w, 0,001% adeniny) w kolbie o odpowiedniej wielkości (pączkujące drożdże rosną optymalnie w kolbie, która ma co najmniej 5 razy większą objętość kultury) do OD600 ~0,03.</li>
	<li>Hodować kulturę przez ~16 h w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min. Po ~16 h zmierz OD600 kultury i powinno wynosić ~0,5-0,8. Nie używaj kultur zbyt rzadkich lub zarośniętych.</li>
	<li>Dla każdego punktu czasowego zbierz odpowiednią objętość komórek w stożkowej probówce i umieść na lodzie. Zazwyczaj jest to 1 x 108 komórek (około 7,5 ml kultury w OD600 1,0 dla haploidalnego szczepu typu dzikiego) dla testu DLC i 5 x 107 komórek (około 2,5 ml kultury w OD600 1,0) dla testu DLE.</li>
	<li>Aby zapewnić dokładność wartości OD600, należy przygotować rozcieńczenia 1:5 dla kultur o OD600≥0,2, aby utrzymać odczyt OD na poziomie 0,2 lub niższym. Dla szczepów typu dzikiego, optymalne punkty czasowe dla analizy DLC wynoszą od 2 h do 6 h, a optymalne punkty czasowe dla analizy DLE to od 4 h do 8 h (patrz Rysunek 3 i <silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Test DLC
	<ol>
		<li>Przed każdym punktem czasowym przygotuj wystarczającą ilość 1x roztworu psoralenu (0,1 mg / ml trioxsalen, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% etanolu) w dygestorii dla wszystkich próbek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml owiniętej folią. Wyjdź w RT.</li>
		<li>Odwirować próbki przy masie 2 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 2,5 ml 1 x roztworu psoralenu w dygestorium i przenieść na szalkę Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm. Alternatywnie, ponownie zawiesić osad w 2,5 ml roztworu TE1 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) w celu kontroli bez sieciowania.</li>
		<li>Usieciuj próbki. Aby urządzenie sieciujące UV pasowało do żarówek długofalowych (365 nm), należy umieścić szalki Petriego 1-2 cm poniżej źródła światła UV ze zdjętą pokrywką na plastikowej lub pleksiszklanej płytce, która została wstępnie schłodzona w temperaturze -20°C. W przypadku kasetonu ze światłem UV umieść szalki Petriego bezpośrednio na źródle światła UV. Próbki należy naświetlić przez 10 minut, delikatnie wstrząsając. 
		UWAGA: Zaleca się ustawienie źródła światła UV na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na ~50 obr./min.</li>
		<li>W dygestorium przenieść próbkę do nowej probówki o pojemności 15 ml. Opłucz szalkę Petriego 2,5 ml roztworu TE1 i dodaj go do probówki. Odwirować próbki o masie 2 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odpowiednio zutylizować supernatant i przechowywać osad w temperaturze -20 °C. Próbki można przechowywać do 1 tygodnia przed przejściem do następnego etapu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test DLE
	<ol>
		<li>Odwirować próbki o masie 2 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Umyć osad komórkowy w 2,5 ml zimnego roztworu TE1 przed powtórzeniem wirowania i przechowywaniem granulek w temperaturze -20 °C. Próbki można przechowywać do 1 tygodnia przed przejściem do następnego etapu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku pobierania próbek po upływie 0 godzin należy pobrać próbki przed dodaniem 20% galaktozy. Dla kolejnych punktów czasowych indukuj tworzenie DSB, dodając 20% galaktozy do kultur do końcowego stężenia 2%. Zebrać pozostałe próbki zgodnie z powyższym opisem, osadzać i zamrażać w stosunku do czasu po indukcji DSB (tj. 4-godzinną próbkę pobiera się 4 godziny po dodaniu 20% galaktozy).</li>
</ol>
2. Sferoplastyka, liza i odbudowa miejsca restrykcji komórek
<ol>
	<li>Rozmrozić próbki na lodzie. Podgrzej suchą kąpiel do temperatury 30 °C.</li>
	<li>Zawiesić próbki w 1 ml buforu sferoplastycznego (0,4 M sorbitolu, 0,4 M KCl, 40 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 3,5 μl roztworu zymoliazy (2% glukozy, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/ml zymoliazy 100T; 17,5 μg/ml końcowe stężenie zymoliazy). Delikatnie wymieszaj, stukając lub odwracając. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 15 minut, a następnie umieścić na lodzie. Podczas 15 minutowej inkubacji należy uzyskać ciekły azot lub suchy lód.</li>
	<li>Wirować przez 3 minuty przy 2 500 x g w temperaturze 4 °C i umieścić próbki na lodzie. Przemyć próbki 3x w 1 ml buforu sferoplastycznego. Odwirowywać próbki przez 3 minuty przy 2 500 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić próbki w 1 ml zimnego buforu enzymatycznego 1x restrykcyjnego (50 mM octanu potasu, 20 mM octanu tris, 10 mM octanu magnezu, 100 μg/ml BSA pH ~8,0 w temperaturze pokojowej) i wirować przez 3 minuty przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C. Umieścić próbki na lodzie. Powtórz pranie 1x.</li>
	<li>Zawiesić próbki w 1 ml zimnego buforu enzymatycznego 1x. Podziel próbkę (po 0,5 ml każda) na dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Odwirować próbki przez 3 minuty przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić jedną probówkę z każdej próbki w 180 μl 1,4-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego z hybrydyzującymi oligonukleotydami (patrz Tabela 2) i jedną probówkę w 180 μl 1,4-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego bez hybrydyzujących oligonukleotydów. Każdy oligo hybrydyzujący jest ponownie zawieszany w 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) i stosowany w końcowym stężeniu 7 nM. 1x TE zastępuje hybrydyzujące oligonukleotydy w buforze enzymu restrykcyjnego 1,4x bez hybrydyzacji oligonukleotydów. 
	UWAGA: Oligonukleotydy hybrydyzujące muszą być przechowywane w temperaturze -20 °C w małych porcjach w rozcieńczeniu roboczym. Stężenie hybrydyzujących oligonukleotydów może wymagać optymalizacji; zobacz Dyskusja.</li>
	<li>Próbki należy zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie lub suchym lodzie/etanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C. Na tym etapie próbki można przechowywać przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
3. Trawienie enzymów restrykcyjnych i ligacja wewnątrzcząsteczkowa
<ol>
	<li>Rozmrozić próbki na lodzie. Podgrzej jedną suchą kąpiel do 65 °C, a drugą do 37 °C.</li>
	<li>Odpipetować 36 μl próbki do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie. Pozostałą próbkę należy niezwłocznie przywrócić do temperatury -80 °C w celu przechowywania.</li>
	<li>Dodaj 4 μl 1% SDS (0,1% stężenia końcowego) i wymieszaj, delikatnie stukając w bok tubki. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 15 minut, delikatnie stukając co 5 minut. Umieścić próbki na lodzie bezpośrednio po inkubacji. 
	UWAGA: To leczenie SDS sprzyja denaturacji białek związanych z DNA, solucjalizacji otoczki jądrowej i dostępności chromatyny przed etapami trawienia enzymu restrykcyjnego i ligacji wewnątrzcząsteczkowej.</li>
	<li>Dodać 4,5 μl 10% Triton X-100 (1% stężenie końcowe) i wymieszać pipetując. Dodać 20-50 j. enzymu restrykcyjnego (EcoRI-HF lub HindIII-HF) do każdej próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem co 20-30 minut. W tym czasie podgrzej suchą kąpiel do 55 °C, a łaźnię wodną nastaw na 16 °C.</li>
	<li>Dodać 8,6 μl 10% SDS (1,5% stężenia końcowego) do każdej próbki i wymieszać przez pipetowanie i stukanie. Inkubować w temperaturze 55 °C przez 10 minut. Dodać 80 μl 10% Triton X-100 (6% stężenia końcowego) do każdej próbki i wymieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Dodać 660 μl 1x buforu ligacyjnego bez ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2,5 μg/ml BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + ligaza DNA T4 (8 U/próbkę) do każdej próbki i wymieszać przez delikatne odwrócenie. Inkubować w temperaturze 16 °C przez 1,5 godziny z inwersją co 30 minut. Umieścić próbki na lodzie natychmiast po inkubacji.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie DNA
<ol>
	<li>Podgrzej jedną suchą kąpiel do temperatury 65 °C, a drugą do 37 °C. Dodać 1 μl 10 mg/ml proteinazy K (przygotowanej w 1x TE pH 8,0) do każdej próbki (12,5 μg/ml stężenie końcowe). Inkubować w temperaturze 65 °C przez 30 minut i umieścić próbki na lodzie natychmiast po inkubacji, aż ostygną.</li>
	<li>Przenieść próbki do probówek o pojemności 2 ml. Pracując pod wyciągiem, dodać równą objętość (~800 μl) fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (P/C/IA; pH 8,0) do każdej próbki. Wirować próbki przez ~30 s i odwirowywać próbki przez 5-10 minut przy 16 000 x g w mikrowirówce.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć 600 μl górnej fazy każdej próbki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Prawidłowo zutylizować dolną fazę i probówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Wytrącić DNA, dodając 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 (~ 60 μL) do każdej próbki, a następnie 1 objętość izopropanolu (~ 660 μL). Odwrócić próbki 5x-10x i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Umieścić próbki na lodzie na 2 minuty, a następnie odwirować próbki o stężeniu 16 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w mikrowirówce. Umieścić próbki z powrotem w lodzie, wylać supernatant i opróżnić probówkę na ręczniku papierowym.</li>
	<li>Umyj osad DNA 200 μl 70% etanolu. Wirować przy 16 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, umieścić próbki z powrotem na lodzie, wylać supernatant i usunąć pozostały alkohol za pomocą pipety. Suszyć próbki z otwartymi nakrętkami probówek w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulki DNA w 50 μL 1x TE przez wirowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, wirować, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C w suchej łaźni przez 30 minut. Ponownie zwiruj próbki, a następnie umieść je na lodzie. Próbki mogą być przechowywane na tym etapie w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy, ale zaleca się natychmiastowe przystąpienie do etapów decrosslinkingu (tylko DLC) i qPCR.</li>
</ol>
5. Odwrócenie usieciowania Psoralen (tylko dla testu DLC)
<ol>
	<li>Odpipetować 9 μl oczyszczonego DNA do probówki PCR na lodzie. Dodać 1 μl 1 M KOH (0,1 M stężenie końcowe). Próbki inkubować w temperaturze 90 °C przez 30 minut w termocyklerze.</li>
	<li>Dodać 19,73 μl roztworu octanu sodu (0,1 M octanu sodu, 9,6 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). Próbki mogą być przechowywane na tym etapie w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy, ale zaleca się natychmiastowe przejście do etapu qPCR.</li>
</ol>
6. Ilościowy PCR, kontrole i analiza
<ol>
	<li>Używając 2 μl oczyszczonego DNA, z sieciowaniem lub bez, należy przeprowadzić reakcję qPCR o objętości 20 μl zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw każdą reakcję w dwóch egzemplarzach. Zarówno w przypadku testów DLC, jak i DLE występuje pięć reakcji kontrolnych i jedna reakcja kwantyfikacji DLC/DLE, czyli łącznie sześć reakcji na próbkę, przebiega w dwóch powtórzeniach. Tabela uzupełniająca S1 i tabela uzupełniająca S2 zawierają szablon do ustawiania tych reakcji i analizy, a sekwencje starterów qPCR są wymienione w tabeli 3.</li>
	<li>Warunki cykliczne qPCR muszą być zoptymalizowane dla każdego zestawu qPCR.
	<ol>
		<li>Należy zastosować następujące warunki DLC qPCR, w zależności od użytych zestawów qPCR: początkowa denaturacja (95 °C przez 3 min); 50 rund amplifikacji (95 °C przez 15 s, 61 °C przez 25 s, 72 °C przez 15 s z pojedynczą akwizycją); analiza krzywej topnienia (95 °C przez 5 s, 65 °C przez 1 min), 97 °C z ciągłą akwizycją); i chłodzenie (37 °C przez 30 s).</li>
		<li>Do testu DLE należy zastosować następujące warunki qPCR: początkowa denaturacja (95 °C przez 5 min); 50 rund amplifikacji (95 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 15 s z pojedynczą akwizycją); analiza krzywej topnienia (95 °C przez 5 s, 65 °C przez 1 min), 97 °C z ciągłą akwizycją); i chłodzenie (37 °C przez 30 s). Należy pamiętać, że może być wymagana optymalizacja dla różnych maszyn/zestawów qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test DLC
	<ol>
		<li>Kontrole: Patrz lista starterów qPCR w Tabeli 3. Mapa miejsc wiązania startera jest pokazana na rysunku S1. Aby uzyskać dodatkowe pliki sekwencji dla odpowiednich cech genomowych i amplikonów, sprawdź pliki edytora plazmidów A (ApE); Dodatkowe pliki sekwencji 1-5.
		<ol>
			<li>Genomowe DNA w ARG4: Użyj olWDH1760/olWDH1761 do amplifikacji dsDNA znajdującego się w ARG4. Użyj tej reakcji jako kontroli ładowania i znormalizuj wszystkie inne reakcje z wyjątkiem reakcji sygnału DLC na tę kontrolkę.</li>
			<li>Wydajność ligacji wewnątrzcząsteczkowej w DAP2: Użyj fragmentu 1,904 pz utworzonego przez trawienie EcoRI do ligacji wewnątrzcząsteczkowej równolegle z ligacją DLC. Wzmocnienie na tym złączu ligacyjnym informuje o wydajności ligacji wewnątrzcząsteczkowej i służy jako kontrola, do której sygnał DLC jest znormalizowany.</li>
			<li>Indukcja DSB: Użyj olWDH1766/olWDH1767, aby wzmocnić region, który obejmuje indukowany DSB.</li>
			<li>Sieciowanie i resekcja psoralenu: Użyj olWDH2019/olWDH2020, aby wzmocnić unikalny region PhiX poniżej miejsca rozpoznawania EcoRI. Bez odwrócenia usieciowania użyj stosunku ssDNA (bez sieciowania) do ARG4 (usieciowanego dsDNA), aby określić skuteczność sieciowania. W przypadku odwrócenia usieciowania resekcja doprowadzi do postępującego spadku od 1 do 0,5 sygnału w stosunku do ARG4.</li>
			<li>Przywracaniei wycinanie miejsca rozpoznawania EcoR I: Użyj olWDH1768/olWDH1764, aby wzmocnić region, który obejmuje przywrócone miejsce rozpoznawania EcoRI przed DSB na wyciętym pasmie. olWDH1769/olWDH1763 amplifikują region, który obejmuje miejsce enzymu restrykcyjnego EcoRI w DAP2. Wykonaj rozszczepienie EcoRI w tym miejscu, aby użyć go jako kontroli ligacji wewnątrzcząsteczkowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sygnał DLC: Użyj olWDH1764/olWDH1765 do amplifikacji chimerycznej cząsteczki DNA utworzonej przez wewnątrzcząsteczkową ligację wyciętej (inwazyjnej) nici i dawcy.</li>
		<li>Analiza: Oblicz średnią i odchylenie standardowe wartości Cp dla każdej z powtarzających się reakcji. Użyj wartości QPCR Cp genomowego DNA ARG4 jako odniesienia, aby znormalizować wszystkie inne kontrolne qPCR. Znormalizuj sygnał DLC do wewnątrzcząsteczkowej kontroli ligacji w DAP2. Zobacz Rysunek 3 dla typowych wartości sygnału DLC po 2 godzinach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test DLE
	<ol>
		<li>Kontrole: Patrz lista starterów qPCR w Tabeli 3. Mapa miejsc wiązania startera jest pokazana na rysunku S1. Aby uzyskać dodatkowe pliki sekwencji dla odpowiednich cech genomowych i amplikonów, sprawdź pliki edytora plazmidów A (ApE) (Uzupełniające pliki sekwencji 1-5).
		<ol>
			<li>Genomowe DNA w ARG4: Patrz sekcja 6.3.1.1.</li>
			<li>Skuteczność ligacji wewnątrzcząsteczkowej przy YLR050C: Użyj trawienia HindIII, aby utworzyć fragment o długości 765 pz, który zostanie poddany ligacji wewnątrzcząsteczkowej równolegle z ligacją DLE. Wzmocnienie na tym złączu ligacyjnym informuje o wydajności ligacji wewnątrzcząsteczkowej i służy jako kontrola, do której sygnał DLE jest znormalizowany.</li>
			<li>Indukcja DSB: Patrz sekcja 6.3.1.3.</li>
			<li>Przywracaniei cięcie miejsca rozpoznawania Hind III: Użyj olWDH2010/olWDH2012 i olWDH2009/2011, aby amplifikować region, który obejmuje miejsca enzymu restrykcyjnego HindIII na uszkodzonej nici, gdzie została odpowiednio wycięta i rozszerzona.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sygnał DLE: Użyj olWDH2009 / olWDH2010 do amplifikacji chimerycznej cząsteczki DNA utworzonej przez wewnątrzcząsteczkową ligację wyciętego końca inwazyjnej nici przed DSB do nowo przedłużonego końca za DSB.</li>
		<li>Analiza: Oblicz średnią i odchylenie standardowe wartości Cp dla każdej z powtarzających się reakcji. Użyj wartości QPCR Cp genomowego DNA ARG4 jako odniesienia, aby znormalizować wszystkie inne kontrolne qPCR. Znormalizuj sygnał DLE do wewnątrzcząsteczkowej kontroli ligacji w YLR050C. Typowe wartości sygnału DLE po 6 godzinach są podane w Rysunek 4 i poprzednie publikacje9.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).</li>
<li>Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+recombination+and+genomic+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of recombination and genomic maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501(2015).</li>
<li>Mimitou, E. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sae2%2C+Exo1+and+Sgs1+collaborate+in+DNA+double-strand+break+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing.</a> Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).</li>
<li>Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Holliday+junctions+are+intermediates+of+DNA+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair.</a> Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).</li>
<li>Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPA+coordinates+DNA+end+resection+and+prevents+formation+of+DNA+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins.</a> Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).</li>
<li>Mazón, G., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mph1+and+Mus81-Mms4+prevent+aberrant+processing+of+mitotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates.</a> Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).</li>
<li>Saini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+bubble+during+break-induced+replication+drives+conservative+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis.</a> Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).</li>
<li>Piazza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+processing+of+displacement+loops+during+recombinational+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair.</a> Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).</li>
<li>Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity+ligation-based+method+for+quantitative+measurement+of+D-loop+extension+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).</li>
<li>Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+roles+of+Rad52%2C+Rad54%2C+and+Rad55+proteins+in+Rad51-mediated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination.</a> Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).</li>
<li>Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+homology+search+during+DNA+double-strand+break+repair+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo.</a> Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).</li>
<li>Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysis+of+homologous+DNA+pairing+by+yeast+Rad51+and+Rad54+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins.</a> Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).</li>
<li>Wright, W. D., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+functions+as+a+heteroduplex+DNA+pump+modulated+by+its+DNA+substrates+and+Rad51+during+D-loop+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation.</a> Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).</li>
<li>Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+role+of+Rad54+in+Rad51-ssDNA+filament-dependent+homology+search+and+synaptic+complexes+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation.</a> Nature Communications. 10 (1), 4058(2019).</li>
<li>Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+drives+ATP+hydrolysis-dependent+DNA+sequence+alignment+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination.</a> Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).</li>
<li>Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break-induced+replication+and+telomerase-independent+telomere+maintenance+require+Pol32%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32.</a> Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombination+execution+checkpoint+regulates+the+choice+of+homologous+recombination+pathway+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair.</a> Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).</li>
<li>Donnianni, R. A., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break-induced+replication+occurs+by+conservative+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+break-induced+replication+shows+that+it+stalls+at+roadblocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks.</a> Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).</li>
<li>Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+kinetics+of+break-induced+replication+%28BIR%29+by+the+assay+for+monitoring+BIR+elongation+rate+%28AMBER%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER).</a> Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).</li>
<li>Pham, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+restraining+break-induced+replication+at+two-ended+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks.</a> The EMBO Journal. 40 (10), 104847(2021).</li>
<li>Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralens+as+photoactive+probes+of+nucleic+acid+structure+and+function%3A+Organic+chemistry%2C+photochemistry%2C+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry.</a> Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).</li>
<li>Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkali+reversal+of+psoralen+cross-link+for+the+targeted+delivery+of+psoralen+monoadduct+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion.</a> Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).</li>
<li>Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-catalyzed+reversal+of+a+psoralen-DNA+cross-link%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link.</a> Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Mph1+helicase+dissociates+Rad51-made+D-loops%3A+Implications+for+crossover+control+in+mitotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination.</a> Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Srs2+promotes+synthesis-dependent+strand+annealing+by+disrupting+DNA+polymerase+%CE%B4-extending+D-loops%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops.</a> eLife. 6, 22195(2017).</li>
<li>Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top3-Rmi1+dissolve+Rad51-mediated+D+loops+by+a+topoisomerase-based+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism.</a> Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).</li>
<li>Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+treatment+and+single-molecule+real-time+sequencing+reveal+D-loop+length%2C+position%2C+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution.</a> eLife. 9, 59111(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawione testy pozwalają na wykrycie powstających i rozszerzonych pętli D (test DLC), wydłużenia pętli D (test DLE) oraz tworzenia produktu BIR (test DLE bez hybrydyzujących oligonukleotydów) za pomocą ligacji zbliżeniowej i qPCR. ChIP-qPCR Rad51 do miejsc odległych od DSB był wcześniej używany jako proxy do poszukiwania homologii za pośrednictwem Rad51 i tworzenia pętli D. Jednak ten sygnał ChIP-qPCR jest niezależny od homologii sekwencji między miejscem przerwania a potencjalnym donorem, a także od czynnika Rad54 ...

Rekombinacja homologiczna (HR) to wysoce wierny mechanizm naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (DSB), międzyniciowych wiązań krzyżowych i luk w ssDNA, a także ścieżka tolerancji uszkodzeń DNA. HR różni się od podatnych na błędy ścieżek naprawy/tolerancji uszkodzeń DNA, takich jak niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i synteza translezji, tym, że wykorzystuje nienaruszone, homologiczne dupleksowe DNA jako dawcę do szablonowania zdarzenia naprawy. Co więcej, wiele kluczowych produktów pośrednich w ścieżce HR jest odwracalnych, co pozwala na znakomitą regulację poszczególnych etapów ścieżki. Podczas faz S, G2 i M cyklu komórkowego HR konkuruje z NHEJ o naprawę dwustronnych DSBs1. Ponadto HR jest niezbędny do replikacji DNA w celu naprawy uszkodzeń DNA związanych z replikacją, w tym luk w ssDNA i jednostronnych DSB, oraz jako mechanizm obejścia uszkodzeń DNA2.
Krytycznym produktem pośrednim w ścieżce HR jest pętla przemieszczenia, czyli pętla D (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Po resekcji końcowej, centralna rekombinaza w reakcji, Rad51, ładuje się na nowo wycięte ssDNA uszkodzonej cząsteczki, tworząc spiralne włókno2. Następnie Rad51 przeprowadza poszukiwanie homologii w celu zidentyfikowania odpowiedniego homologicznego dawcy, zazwyczaj chromatydy siostrzanej w komórkach somatycznych. Pętla D powstaje, gdy włókno Rad51-ssDNA atakuje homologiczny dupleks DNA, co prowadzi do parowania zasad Watsona-Cricka zerwanej nici z komplementarną nicią dawcy, wypierając przeciwną nić donora. Wydłużenie końca 3' pękniętej nici przez polimerazę DNA zastępuje zasady, które zostały utracone podczas zdarzenia uszkodzenia DNA i sprzyja rozdzielczości przedłużonej pętli D pośredniej do produktu dsDNA poprzez wyżarzanie nici zależnej od syntezy (SDSA), podwójne złącze Hollidaya (dHJ) lub podszlaki HR replikacji indukowanej przerwaniem (BIR).
Testy, które fizycznie monitorują produkty pośrednie w ścieżce HR, pozwalają na analizę wymagań genetycznych dla każdego kroku (np. analizę szlaku). Powstawanie DSB, resekcja końcowa, dHJs, pęcherzyki replikacji BIR i produkty HR są łatwo obserwowane przez Southern blotting3,4,5,6,7. Jednak Southern blotting nie informuje o powstających i rozszerzonych pętlach D, a zatem wymagana jest alternatywna metoda wiarygodnego pomiaru tych wspólnych cząsteczek4,8,9. Jedną z szeroko stosowanych strategii analizy powstającego powstawania pętli D jest immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) Rad51 w połączeniu z ilościowym PCR (qPCR)10,11. Jednak związek Rad51 z dsDNA, mierzony za pomocą ChIP-qPCR, jest niezależny od homologii sekwencji i czynnika akcesoriów Rad51 Rad5410,11. W przeciwieństwie do tego, znaczący sygnał wykorzystujący przedstawioną tutaj metodę analizy pętli D, zwaną testem przechwytywania pętli D (DLC), zależy od tworzenia DSB, homologii sekwencji, Rad51 i białek pomocniczych Rad51 Rad52 i Rad548. Odkrycie, że tworzenie pętli D promowane przez Saccharomyces cerevisiae Rad51 zależy od Rad54 in vivo, jest zgodne z licznymi eksperymentami rekonstytucji in vitro wskazującymi, że Rad54 jest wymagany do poszukiwania homologii i tworzenia pętli D przez pączkujące drożdże Rad518,12,13,14,15.
Obecne podejścia do pomiaru wydłużenia pętli D, głównie za pomocą półilościowego PCR, są podobnie problematyczne. Typowy test oparty na PCR w celu wykrycia wydłużenia pętli D amplifikuje unikalną sekwencję, wynikającą z rekombinacji między miejscem pęknięcia a donorem ektopowym, a następnie syntezy DNA związanej z rekombinacją, poprzez starter przed regionem homologii na zerwanej nici i kolejny starter poniżej regionu homologii na nici donorowej. Stosując tę metodę, detekcja syntezy DNA związanej z rekombinacją wymaga nieistotnego czynnika procesywności Pol δ Pol3216. Odkrycie to jest sprzeczne z obserwacją, że delecja POL32 ma tylko łagodny wpływ na konwersję genów in vivo17. Co więcej, te testy oparte na PCR nie są w stanie tymczasowo rozwiązać wydłużenia pętli D i tworzenia produktu BIR, co sugeruje, że sygnał pochodzi z produktów dsDNA, a nie z produktów pośrednich ssDNA17,18,19. Test rozszerzenia pętli D (DLE) został niedawno opracowany w celu rozwiązania tych rozbieżności. Test DLE określa ilościowo syntezę DNA związaną z rekombinacją w miejscu ~ 400 par zasad (bp) poniżej początkowego 3' atakującego końca < klasy sup = "xref">9. Dzięki tej metodzie wydłużenie pętli D jest niezależne od Pol32 i jest wykrywalne w ciągu 4 godzin po indukcji DSB, podczas gdy produkty BIR są po raz pierwszy obserwowane po 6 godzinach. Rzeczywiście, niedawna publikacja z laboratoriów Haber i Malkova zauważyła, że użycie tej metody przygotowania genomowego DNA pojedynczo skutkuje zachowaniem ssDNA9,20.
Tutaj szczegółowo opisane są testy DLC i DLE. Testy te opierają się na podwiązaniu zbliżeniowym w celu wykrycia powstających i wydłużonych pętli D u S. cerevisiae (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)8,9. Produkty BIR można określić ilościowo przy użyciu tego samego systemu oznaczania. W przypadku obu testów tworzenie DSB w miejscu cięcia endonukleazy HO znajdującym się w locus URA3 na chromosomie (Chr.) V jest indukowane przez ekspresję endonukleazy HO pod kontrolą promotora indukowanego galaktozą. Inwazja nici DNA za pośrednictwem Rad51 prowadzi do powstającego powstania pętli D w miejscu dawcy ektopowego znajdującego się w locus LYS2 na Chr. II. Ponieważ prawa strona DSB nie jest homologiczna względem dawcy, naprawa poprzez SDSA i tworzenie dHJ nie jest możliwa. Początkowa naprawa DSB przez BIR jest możliwa, ale tworzenie żywotnych produktów jest hamowane przez obecność centromeru21. Ta celowa konstrukcja zapobiega produktywnej naprawie DSB, unikając w ten sposób wznowienia wzrostu przez komórki z naprawionymi DBS, które w przeciwnym razie mogłyby wyprzedzić hodowlę podczas analizy przebiegu czasu.
W teście DLC, sieciowanie psoralenu dwóch nici heterodupleksowego DNA w pętli D zachowuje pośrednią rekombinację. Po odtworzeniu enzymu restrykcyjnego w miejscu przerwanej (wyciętej) nici i trawieniu, sieciowanie pozwala na ligację unikalnych sekwencji przed homologicznym uszkodzonym i donorowym DNA. Za pomocą qPCR określa się ilościowo poziom chimerycznej cząsteczki DNA obecnej w każdej próbce. W teście DLE sieciowanie nie jest wymagane, a przywrócenie i trawienie enzymu restrykcyjnego, a następnie ligacja wewnątrzcząsteczkowa zamiast tego łączą koniec 5' uszkodzonej cząsteczki z nowo wydłużonym końcem 3'. Ponownie, qPCR służy do ilościowego określenia względnych ilości tego chimerycznego produktu w każdej próbce. W przypadku braku odbudowy miejsca enzymu restrykcyjnego, test DLE informuje o względnych poziomach produktu BIR (dsDNA), który powstaje po rozszerzeniu pętli D.
Pokazane są reprezentatywne wyniki dla każdego testu z użyciem dzikiego szczepu, a czytelnicy są odsyłani do Piazza et al.8 i Piazza et al.9 w celu wykorzystania tych testów do analizy mutantów rekombinacyjnych8,9. Celem tego wkładu jest umożliwienie innym laboratoriom przyjęcia testów DLC i DLE, a wsparcie dla nich jest dostępne na żądanie.

<table><tbody><tr><td><silny>1. Wstępny wzrost, indukcja DSB i pobieranie próbek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 i 50 ml probówki</td><td></td><td></td><td></td>stożkowe</tr><tr><td>15 ml szklane probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hodowlane 250 ml, 500 ml lub 1 l kolby</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm optycznie przezroczyste szalki Petriego z płaskim dnem</td><td></td><td></td><td>Sugerowane: Corning, numer katalogowy 430166; lub Genesee Scientific, numer katalogowy 32-150G</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa ze stożkowymi adapterami</td><td></td><td></td><td></td>probówek 15 i 50 ml</tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna stołowa lub rotator/rewolwer</td><td></td><td></td><td></td>rurowy</tr><tr><td>Rotator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sieciujący UV lub kaseton świetlny z żarówkami UV 365 nm umieszczonymi na szczycie wytrząsarki</td><td></td><td></td> <td>orbitalnejSugerowane: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) lub Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Numer katalogowy 611110831</td></tr><tr><td><mocny>Materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60% w/w syrop DL-mleczanowy sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1375</td><td>Do przygotowania pożywki</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423500</td><td>Do przygotowania podłoża</td></tr><tr><td>Bacto pepton</td><td>BD Difco</td><td>211840</td><td>Do przygotowania pożywki</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Bacto</td><td>BD Difco</td><td>212750</td><td>Do przygotowania pożywki</td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>BD Difco</td><td>0155-17-4</td><td>Do przygotowania pożywki</td></tr><tr><td>Trioxsalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6137</td><td>Do sieciowania psoralenu</td></tr><tr><td>2. Sferoplastyka, liza i restrykcyjna odbudowa miejsca enzymu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki</td><td></td><td></td><td></td>do mikrowirówek</tr><tr><td>Sucha kąpiel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot lub suchy lód/etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka lub mikrowirówka z chłodzeniem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X bufor enzymu restrykcyjnego (CutSmart) (500 mM octan potasu, 200 mM octan tris, 100 mM octan magnezu, 1 mg / ml BSA, pH 7,8-8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymoliaza 100T</td><td>US Biological</td><td>Z1004</td><td>Do sferoplastyki</td></tr><tr><td>3. Trawienie enzymów restrykcyjnych i ligacja wewnątrzcząsteczkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel</td><td></td><td></td><td></td> wodna</tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101</td><td>Trawienie enzymu restrykcyjnego do testu DLC</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104</td><td>Trawienie enzymu restrykcyjnego do testu DLE</td></tr><tr><td>Ligaza DNA</td><td>T4 New England Biolabs</td><td>M0202</td><td>Ligacja wewnątrzcząsteczkowa</td></tr> <tr><td><silna>4. Oczyszczanie DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 i 2 ml probówek</td><td></td><td></td><td></td> do mikrowirówek</tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) o godzinie 25:24:1</td><td>Oczyszczanie</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DNA Sigma-Aldrich P2069<silny>5. Odwrócenie usieciowania psoralenu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler/PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6. qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td>Maszyna qPCR używana przez autorów</td></tr><tr>Maszyna <td>5815916001</td> <td>qPCR Lightcycler 96</td><td>Roche</td><td>używana przez autorów</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 96-Well Plate, biała</td><td></td> Roche <td>4729692001</td><td>96-dołkowe płytki do qPCR</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>zestaw qPCR używany przez autorów</td></tr><tr><td>SYBR Green I Master Mix</td><td>Zestaw</td><td></td><td>do qPCR firmy Roche 4707516001 używany przez autorów</td></tr></tbody></table>

wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję pcr u saccharomyces cerevisiae

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

Uszkodzenia DNA, w tym pęknięcia dwuniciowe DNA i międzyniciowe wiązania krzyżowe, powstałe podczas faz S i G2 cyklu komórkowego mogą być naprawione przez rekombinację homologiczną (HR). Ponadto HR stanowi ważny mechanizm ratowania widełek replikacyjnych po zatrzymaniu lub zawaleniu. Regulacja wielu odwracalnych i nieodwracalnych etapów tej złożonej ścieżki sprzyja jej wierności. Fizyczna analiza produktów pośrednich rekombinacji powstających podczas HR umożliwia scharakteryzowanie tych kontroli przez różne czynniki nukleoproteinowe i ich interaktory. Chociaż istnieją dobrze ugruntowane metody oznaczania określonych zdarzeń i produktów pośrednich w szlaku rekombinacji, wykrywanie tworzenia i wydłużania pętli D, dwóch krytycznych etapów w tej ścieżce, do niedawna okazywało się wyzwaniem. Opisano tu skuteczne metody wykrywania kluczowych zdarzeń w szlaku HR, a mianowicie tworzenia dwuniciowych pęknięć DNA, tworzenia pętli D, wydłużania pętli D oraz tworzenia produktów poprzez replikację indukowaną przerwaniem (BIR) u Saccharomyces cerevisiae. Testy te wykrywają ich odpowiednie produkty pośrednie i produkty rekombinacji z wysoką czułością i są niezależne od żywotności komórek. Wykrywanie pętli D, przedłużenia pętli D i produktu BIR opiera się na ligacji zbliżeniowej. Łącznie testy te pozwalają na badanie kinetyki HR na poziomie populacji w celu precyzyjnego zajęcia się funkcjami białek i regulatorów HR na istotnych etapach szlaku.

Analiza DLC 
Analiza DLC wykrywa zarówno nowo powstałe, jak i wydłużone pętle D (D-loops) tworzone przez inwazję specyficznego miejsca pęknięcia DSB w pojedynczego donora (Rysunek 2). Sieciowanie psoralenem fizycznie łączy przerwaną nić z donorem via heterodupleks DNA w obrębie pętli D. Przywrócenie miejsca cięcia enzymu restrykcyjnego za pomocą długiego, hybrydyzującego oligonukleotydu na resekowanej nici pęknięcia umożliwia cięcie enzymem restrykcyjnym, a nastę...

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

Testy wychwytywania i wydłużania pętli D są pierwszymi, które umożliwiają bezstronną i bezpośrednią ocenę ilościową etapów tworzenia i wydłużania pętli D podczas rekombinacji homologicznej w mitotycznie rosnących komórkach drożdży. Ta niezależna od żywotności technika pozwala na badanie białek w metabolizmie pętli D, które w innym przypadku nie byłyby możliwe do rozdzielenia z późniejszych ról, patrząc tylko na produkty BIR. W przyszłości przewidujemy przeniesienie tych testów do komórek ludzkich, aby lepiej zrozumieć rolę kluczowych białek, w tym BRCA2 oraz przypadków bloom i kilo Warnera w rekombinacji homologicznej.Rozpocząć od odwirowania próbek przez pięć minut. Zawiesić osad w 2,5 mililitrze 1x roztworu psoralenu i przenieść go na szalkę Petriego o wymiarach 60 na 15 milimetrów. Aby uniknąć kontroli sieciowania, ponownie zawieś granulkę w 2,5 mililitra roztworu TE1.Następnie ustaw źródło światła UV na górze w wytrząsarce orbitalnej, ustawione na 50 obr./min. Do sieciowania próbek za pomocą sieciownika UV z żarówkami o długości fali 365 nanometrów. Umieść szalki Petriego od jednego do dwóch centymetrów poniżej źródła światła UV na 10 minut, delikatnie potrząsając na wstępnie schłodzonej plastikowej lub pleksiglasowej płycie.Następnie przenieś próbkę do nowej 15-mililitrowej probówki. Opłucz szalkę Petriego 2,5 mililitra roztworu TE1 i dodaj go do probówki. Odwirowywać próbki przez pięć minut.Odrzucić supernatant i przechowywać osad w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Umieścić próbki na lodzie w celu rozmrożenia. Jednocześnie podgrzej suchą kąpiel do 30 stopni Celsjusza.Ponownie zawiesić próbki w jednym mililitrze buforu sferoplastycznego i przenieść je do 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych. Następnie dodaj 3,5 mikrolitra roztworu zymoliazy i delikatnie wymieszaj, stukając. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 15 minut.A następnie umieść rurki na lodzie. Wirować przez trzy minuty i umieścić próbki na lodzie. Przemyć próbki trzykrotnie w jednomililitrowym buforze sferoplastycznym i odwirować próbki przez trzy minuty.Zawiesić próbki w jednym mililitrze buforu enzymu restrykcyjnego na zimno. Wirować przez trzy minuty i umieścić próbki na lodzie. Powtórz pranie raz.Ponownie zawiesić próbki w jednym mililitrze zimnego 1x buforu enzymu restrykcyjnego. Podzielić próbkę równo na dwie części. Odwirowywać próbki przez trzy minuty w temperaturze 16 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zawiesić jedną probówkę z każdej próbki w 180 mikrolitrach 1,4-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego z hybrydyzującymi oligonukleotami, a drugiej probówki w 180 mikrolitrach 1,4-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego bez hybrydyzujących oligonukleotydów. Zatrzaskowo zamrozić próbki w ciekłym azocie. Rozmrozić próbki na lodzie.Podgrzej jedną suchą kąpiel do 65 stopni, a drugą do 37 stopni Celsjusza. Porcjować 36 mikrolitrów próbki do nowej mikroprobówki wirówkowej i cztery mikrolitry 1% SDS i mieszać, delikatnie stukając w bok probówki. Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut, delikatnie stukając co pięć minut.Umieścić próbki na lodzie bezpośrednio po inkubacji. Dodać 4,5 mikrolitra 10% Triton X-100 i wymieszać pipetując. Do każdej próbki dodać od 20 do 50 jednostek enzymu restrykcyjnego EcoR1 lub HindIII o wysokiej wierności.I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z delikatnym mieszaniem co 20 do 30 minut. W tym czasie podgrzewa się suchą kąpiel do 55 stopni Celsjusza oraz łaźnię wodną do 16 stopni Celsjusza. Dodać 8,6 mikrolitra 10% SDS do każdej próbki i wymieszać, pipetując i stukając.Inkubować w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 10 minut. Dodać 80 mikrolitrów 10% Triton X-100 do każdej próbki i wymieszać pipetując. Dodać 660 mikrolitrów 1x buforu ligacyjnego bez ATP, jeden milimolowy ATP o pH 8,0 i osiem jednostek ligazy DNA T4 do każdej próbki i delikatnie wymieszać przez inwersję.Inkubować w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny z inwersją co 30 minut. Umieścić próbki na lodzie natychmiast po inkubacji. Po oczyszczeniu DNA zgodnie z opisem w protokole, użyj dwóch mikrolitrów oczyszczonego DNA, aby uruchomić 20-mikrolitrową reakcję qPCR zgodnie z instrukcjami producenta.Dla każdej próbki należy skonfigurować pięć reakcji kontrolnych i jedną reakcję oznaczania ilościowego, a następnie przeprowadzić je w dwóch powtórzeniach. Analiza testu DLC dwie godziny po dwuniciowym pęknięciu lub indukcji DSB wykazała, że sieciowanie psoralenu ma kluczowe znaczenie, a wydajność zależy od czasu między pobraniem próbki a qPCR. Wartości ARG4 Cp były podobne między próbkami usieciowanymi, ale niższe dla próbki bez sieciowania, ponieważ DNA bez usieciowania amplifikuje się wydajniej.Dla wszystkich próbek kontrola qPCR ligacji międzycząsteczkowej mieściła się w zakresie. O solidnej indukcji DSB świadczy niski sygnał qPCR dla kontroli, który wzmacnia się w całym miejscu rozpoznawania endonukleazy HO. Podobne wyniki zaobserwowano dla kontroli qPCR EcoR1.Sygnał DLC z hybrydyzującym oligonugoligotywem obliczono przez normalizację do kontroli ligacji międzycząsteczkowej. Analiza testu DLE przeprowadzona sześć godzin po indukcji DSB wykazała, że wartości CP ARG4 były podobne między próbką z hybrydyzującymi oligonukleotydami i bez niej. Kontrola qPCR ligacji międzycząsteczkowej wykazała akceptowalny sygnał dla próbki oligonukleotydów z hybrydyzacją i bez niej, ale niższy sygnał dla próbki uszkodzonej.We wszystkich trzech próbkach wystąpiła silna indukcja DSB. Ponieważ rozszczepienie HindIII zależy od odbudowy miejsca enzymu restrykcyjnego przez hybrydyzujący oligo. Stwierdzono istotną różnicę w amplifikacji w całym miejscu rozszczepienia HindIII na wyciętym pasmie między szerokością i bez próbek oligo.Zaobserwowano mniejszą różnicę w amplifikacji w całym miejscu na przedłużonej nici, ponieważ tutaj rozszczepienie HindIII również zależy od rozciągnięcia. Próbki i bufor muszą być zawsze przechowywane w niskiej temperaturze. Próbki muszą być błyskawicznie zamrożone po ponownym zawieszeniu w 1,4-krotnym buforze enzymu restrykcyjnego na zimno z lub bez hybrydyzujących oligonukleotydów.Wpływ powstawania i wydłużania pętli D na tworzenie produktu można badać za pomocą testów Southern blot lub genetycznych punktów końcowych. Wpływ na wyszukiwanie homologii można badać przy użyciu wysokiego CP. Immunoprecypitacja chromatyny może dostarczyć informacji na temat rekrutacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

detection-homologous-recombination-intermediates-via-proximity

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Test translokacji stymulowanej przez HO monitoruje proces wyżarzania pojedynczej nici po powstaniu pęknięć obu nici DNA w wielu loci u diploidalnych Saccharomyces cerevisiae. Mechanizm ten może służyć jako model przemieszczeń genomowych w komórkach somatycznych wyższych eukariotów po ekspozycji na wysokie dawki promieniowania jonizującego.

Ilościowe oznaczenie i analiza powstawania translokacji chromosomowych indukowanych przez endonukleazę HO poprzez odżarzanie pojedynczych nici w Saccharomyces cerevisiae

W tym filmie opisujemy technikę Southern blotting w celu identyfikacji homologicznych zdarzeń rekombinacji w genomie embrionalnych komórek macierzystych myszy za pomocą sond znakowanych radioaktywnie. Regiony DNA zawierające zdarzenia rekombinacji homologicznej pojawiają się jako wyraźne prążki, gdy błona zawierająca DNA związane z sondą jest wystawiona na działanie promieni rentgenowskich.

Southern blotting w celu wykrycia rekombinacji homologicznej w genomie embrionalnych komórek macierzystych myszy

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej, które wystąpiły w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą Southern blotting i/lub PCR. Przykładem tej metody jest generowanie modeli myszy zastępujących genetyczną miozynę II bez mięśni przy użyciu tradycyjnej technologii celowania opartej na embrionalnych komórkach macierzystych opartej na rekombinacji homologicznej.

Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy przy użyciu Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Tutaj opisujemy wykorzystanie Grafix (Gradient Fixation), wirowania gradientu glicerolu w obecności środka sieciującego, do identyfikacji interakcji między czynnikami splicingowymi, które przejściowo wiążą się z kompleksem spliceosomów.

Wykorzystanie Grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów Saccharomyces cerevisiae

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Opisujemy dwa uzupełniające się protokoły do dokładnego określenia czasu trwania fazy S u S. cerevisiae za pomocą EdU, analogu tymidyny, który jest wprowadzany in vivo i wykrywany za pomocą chemii Click za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. Pozwala to na łatwą charakterystykę czasu trwania replikacji DNA i przeoczonych defektów replikacji u mutantów.

Oznaczanie czasu trwania fazy S przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny w Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół przedstawia metodę izolacji chromatyny specyficzną dla locus, opartą na rekombinacji specyficznej dla miejsca, w celu oczyszczenia interesującego miejsca pojedynczej kopii genu w jego natywnym kontekście chromatyny z pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae.

Oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę wykrywania produktów pośrednich rekombinacji homologicznej w komórkach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu ligacji zbliżeniowej i ilościowej PCR. Technika ta umożliwia badanie białek zaangażowanych w metabolizm pętli D.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów