Optymalizacja ATAC-Seq do badań epigenetycznych nowotworów

ATAC-seq pozwala nam zidentyfikować stan otwartych regionów chromatyny w genomie, który często ulega zmianie w stanach chorobowych w porównaniu ze stanem normalnym. Mniejsza ilość danych wejściowych do komórek, uproszczony protokół trawienia Tn5, a następnie izolacja fragmentarycznego DNA i przygotowanie biblioteki przez amplifikację PCR oraz krótszy czas eksperymentu sprawiają, że jest to bardziej korzystna technika. Porównanie zmienionego krajobrazu epigenetycznego za pomocą ATAC-seq między stanami normalnymi a chorobowymi może rzucić światło na elementy regulatorowe chromatyny związane z chorobą i być przydatne w projektowaniu nowych strategii terapeutycznych.

Ta technika jest łatwa do wykonania, ponieważ nie obejmuje żadnych krytycznych kroków eksperymentalnych. Aby uzyskać pomyślne wyniki ATAC-seq, wystarczy wykonać kilka kroków standaryzacji. Na początek przenieś 25 mikrolitrów z zawiesiny komórkowej zawierającej milion komórek na mililitr w PBS do 1,7-mililitrowej probówki mikrowirówkowej i wiruj przy 500 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.

Ostrożnie wyrzuć supernatant i dodaj 25 mikrolitrów buforu do lizy. Ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować na lodzie przez pięć minut. Wirować w stężeniu 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie wyrzucić supernatant.

Natychmiast ponownie zawiesić osad w 25 mikrolitrach mieszaniny reakcyjnej Tn5 i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Mieszaj roztwór co 10 minut. Dodaj pięć mikrolitrów 3-molowego octanu sodu i 125 mikrolitrów buforu PB do roztworu DNA znakowanego Tn5.

Dobrze wymieszaj. Następnie umieść kolumnę wirującą w 2-mililitrowej probówce zbiorczej i nałóż próbkę na kolumnę wirową. Odwirować przy 17 900 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i odrzucić przepływ.

Dodaj bufor PE do kolumny i obróć kolumnę. Umieść kolumnę wirową z powrotem w tej samej probówce zbiorczej i odwiruj ją przez pięć minut, aby całkowicie wysuszyć membranę. Wyrzuć przepływ i umieść kolumnę wirową w nowej 1.7-mililitrowej probówce do mikrowirówki.

Eluować fragmenty DNA za pomocą 10 mikrolitrów buforu EB i odstawić kolumnę na minutę w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować przy 17, 900 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej w celu wymycia DNA. Ustaw reakcję PCR w probówkach PCR o pojemności 200 mikrolitrów i wykonaj część pierwszą programu amplifikacji PCR.

W przypadku QPCR w czasie rzeczywistym przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR, dodając pięć mikrolitrów produktu PCR, 0,75 mikrolitra 1 000-krotnie rozcieńczonego SYBR Gold, pięć mikrolitrów 2X PCR Master Mix i 3,75 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Określ wymaganą liczbę dodatkowych cykli PCR przy użyciu parametrów przebiegu. Po ustaleniu numeru cyklu należy skonfigurować PCR z dodatkowymi cyklami obliczonymi wcześniej.

Do amplifikowanych produktów PCR dodaj 150 mikrolitrów kulek i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na pięć minut i ostrożnie usuń supernatant. Umyj kulki 200 mikrolitrami 80% etanolu i usuń supernatant.

Całkowicie usunąć etanol i suszyć próbki na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec ponownie zawiesić za pomocą 50 mikrolitrów buforu elucyjnego. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym, a następnie przenieś eluat do świeżej 1,7-mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Porównanie wydajności lizy komórek przy użyciu błękitu trypanowego przedstawiono tutaj. Komórki NMuMG potraktowano buforem hipotonicznym i buforem CSK i wybarwiono błękitem trypanowym. Wyższą skuteczność lizy komórek zaobserwowano w komórkach leczonych CSK.

Biblioteki ATAC-seq przygotowano z komórek raka piersi MDA-MB-231. Po amplifikacji PCR, produkty PCR analizowano na 0,5X TBE, 1,5% żelu agarozowym przed i po oczyszczeniu kulek. Podkłady są w większości usuwane przez wstępne oczyszczenie kulek.

Wskazane są również wzory prążków DNA z elektroforezy w żelu agarozowym 1X TAE 1% i elektroforezy automatycznej. Do wizualizacji pokazanych tu fragmentów DNA wykorzystano SYBR Gold. Ślad przeglądarki genomu pokazujący locus ERS1 jest prezentowany tutaj.

Pokrycie genomu danymi ATAC-seq w komórkach T47D pokazano na tym obrazie. Użyto starterów z poprzedniej publikacji, a ich obszary docelowe są wyróżnione na żółto. Wykres słupkowy przedstawiający wzbogacanie amplikonów starterów w bibliotekach ATAC-seq jest pokazany tutaj.

Biblioteki ATAC-seq zostały przygotowane za pomocą bufora hipotonicznego lub bufora CSK. Reprezentatywny obraz przedstawia wizualizację przeglądarki genomu w celu optymalizacji ATAC-seq. Dane ATAC-seq z warunku wejściowego 25 000 komórek wykazały najwyższe wzbogacenie fragmentów wolnych od nukleosomów, podczas gdy warunek wejściowy 100 000 komórek wykazał najwyższe mononukleosomalne DNA.

Poniżej przedstawiono ślady przeglądarki genomu pokazujące dane ATAC-seq z różnych numerów komórek. Analiza adnotacji piku HOMER jest przedstawiona na tym reprezentatywnym obrazie. HOMER sklasyfikował każdy pik jako promotor proksymalny lub dystalny.

Liczba danych wejściowych do komórki, wybór bufora do lizy komórek oraz stężenie enzymu Tn5 w zależności od typu komórki są najbardziej krytycznym parametrem, który musi zostać znormalizowany. Tn5 połączony z białkiem A w technice cut-and-tack jest szeroko stosowany do identyfikacji miejsca wiązania DNA dla białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu przeciwciał specyficznych dla tego białka będącego przedmiotem zainteresowania.