Zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów Candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza

Morfogeneza Candida albicans jest wywoływana przez niezliczone sygnały środowiskowe. Badając morfogenezę in vivo, określamy, w jaki sposób organizm integruje się i reaguje na wszystkie te sygnały środowiskowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam badać morfogenezę przy braku uprzedzeń lub artefaktów, które mogą zostać wprowadzone za pomocą systemów modelowych in vitro.

Bardzo niewiele osób ma doświadczenie z iniekcjami śródskórnymi. Zdecydowanie zalecam, aby ktoś, kto jest nowy w tej technice, skontaktował się z weterynarzem zajmującym się zasobami zwierzęcymi w celu uzyskania pomocy w jej nauce. Procedurę zademonstruje Rohan Wakade, adiunkt z naszej grupy laboratoryjnej.

Zacznij od przygotowania zwierzęcia do szczepienia, podając karmę wolną od chlorofilu przez co najmniej siedem dni przed inokulacją. Na jeden dzień przed wstrzyknięciem należy pobrać odrobinę komórek Canada albicans z jednej kolonii za pomocą wykałaczki. Zaszczepij 25 mililitrów YPD i powtórz ten proces kilka razy, aby uzyskać komórki z kilku różnych kolonii.

Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną z prędkością 175 obr./min. Odwirować jeden mililitr kultury przez dwie minuty przy 500 x g, a następnie umyć drożdże trzykrotnie jednym mililitrem sterylnego DPBS. Zawiesić osad w jednym mililitrze sterylnego DPBS i rozcieńczyć kulturę w stosunku 1 do 100.

Policz komórki za pomocą hemocytometru i odpowiednio dostosuj gęstość komórek. Następnie należy utworzyć inokulum do wstrzyknięcia, mieszając równe objętości szczepu referencyjnego i eksperymentalnego. Za pomocą wacika z bawełnianą końcówką nałóż obficie dostępny bez recepty krem do depilacji na wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię obu uszu znieczulonego zwierzęcia.

Po dwóch do trzech minutach delikatnie przetrzyj ucho suchą gazą, a następnie gazikami nasączonymi sterylną wodą, aby dokładnie usunąć pozostałości kremu do depilacji. Po wysterylizowaniu powierzchni uszu 70% etanolem, dobrze wymieszaj inokulum, kilkakrotnie odwracając fiolkę lub obracając ją. Narysuj od 20 do 30 mikrolitrów inokulum do strzykawki insulinowej.

Trzymać igłę w pozycji pionowej i delikatnie postukać w strzykawkę, aby upewnić się, że powietrze w cylindrze znajduje się na górze. Ostrożnie wyrzuć powietrze i nadmiar inokulum z powrotem do probówki z inokulum lub rurki odpływowej, tak aby tłok znalazł się na znaku 10 mikrolitrów. Nałóż bez recepty dwustronną taśmę do skóry na małą stożkową lub okrągłodenną plastikową rurkę i ułóż ucho w poprzek taśmy, unikając przemieszczenia stożka nosowego do znieczulenia.

Trzymając igłę strzykawki prawie równolegle do skóry i unikając dużych żył, włóż końcówkę igły w najbardziej zewnętrzną warstwę skóry, aż skos zostanie pokryty i powoli wstrzyknij inokulum śródskórnie. Dobre wstrzyknięcie śródskórne spowoduje powstanie małego pęcherzyka w skórze. Trzymaj igłę na miejscu przez 15 do 20 sekund przed wyjęciem jej z ucha, aby zminimalizować wyciek.

Zgodnie z protokołami instytucjonalnymi, oznacz klatkę etykietami zagrożenia biologicznego wskazującymi, że zwierzęta w klatce są zarażone Candida albicans. Używając tych samych umytych kultur, które zostały użyte do przygotowania inokulum, stwórz rozcieńczenie komórek od 1 do 50 w RPMI 1640, uzupełnione 10% ciepłem i aktywowaną płodową surowicą bydlęcą i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z bębnowaniem przez cztery godziny. Zbadaj próbkę pod mikroskopem.

Policz co najmniej 100 komórek, zapisując liczbę drożdży i komórek nitkowatych dla każdego szczepu. Obróć obiektyw o dużej odległości roboczej na miejsce i umieść kroplę płynu zanurzeniowego na soczewce. Obniż soczewkę, aby uniknąć możliwego uszkodzenia podczas zakładania szkiełka nakrywkowego.

Umieść szkiełko nakrywkowe numer 1.5 na otworze sceny i przyklej je taśmą. Podnieś obiektyw tak, aby płyn zanurzeniowy stykał się zarówno z soczewką obiektywu, jak i szkiełkiem nakrywkowym. Zamocuj stożek nosowy do znieczulenia na stoliku mikroskopu w taki sposób, aby całkowicie zakrywał nos zwierzęcia, gdy znajduje się w pozycji do obrazowania.

Umieść nos znieczulonej myszy w stożku nosowym. Umieść kroplę sterylnej wody na szkiełku nakrywkowym nad soczewką obiektywu. Wyreguluj stożek nosowy anestezjologiczny i ustaw mysz tak, aby ucho myszy znajdowało się nad kroplą wody.

Weź kolejną szkiełko nakrywkowe i umieść krawędź szkiełka nakrywkowego równolegle do korpusu myszy, tak aby krawędź dotykała myszy w miejscu, w którym ucho styka się z głową. Za pomocą ruchu zawiasowego opuść wolną krawędź szkiełka nakrywkowego do stolika mikroskopu. Gdy szkiełko nakrywkowe zbliży się do stolika mikroskopu, spłaszczy ucho.

Przyklej bezpiecznie górną szkiełko nakrywkowe, aby utrzymać wystarczający nacisk, aby ucho było płaskie i uniknąć zaczepienia włosów myszy lub wąsów o taśmę. O ile nie używany jest mikroskop z komorą środowiskową, luźno przykryj ciało myszy sterylną serwetą, aby utrzymać normalne środowisko termiczne. Korzystając z białego światła, obrazowania szerokokątnego, dostosuj płaszczyznę ostrości do tkanki ucha i skup się na czerwonych krwinkach poruszających się w naczyniach krwionośnych.

Aby uzyskać wystarczająco silny stosunek sygnału do szumu, aby można było określić morfologię dla wszystkich komórek w polu widzenia, dostosuj moc lasera lub prędkość obrazowania. Aby uniknąć uszkodzenia tkanek, używaj najmniejszej możliwej mocy lasera. Wybierz pole widzenia z wyraźnym tworzeniem włókien w odnośnym szczepie i gdzie większość organizmów jest wystarczająco rozsiana, aby można było określić ich morfologię.

Ustaw górną i dolną płaszczyznę ostrości dla stosu Z. Pokrycie całej głębokości zainfekowanego obszaru nie jest konieczne, ale należy pamiętać, że organizmy na górze lub na dole obrazowanej objętości są zwykle wykluczane z analizy. Zdobądź obrazy stosu Z, pseudopokoloruj każdy kanał, aby odróżnić każdy szczep i nałóż kanały.

Zapisz obrazy. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby wykonać maksymalną projekcję stosu Z na obraz dwuwymiarowy. Policz każdy organizm widziany na obrazach maksymalnej projekcji według typu szczepu i morfologii.

Wspomniany szczep szybko tworzy włókna in vitro. Natomiast EFG1 Null nie zdołał uformować włókien. EFG1 Null wykazuje również znaczny defekt filamentacji in vivo.

Około 9% komórek zerowych EFG1 rosło jako włókna in vivo. Podobnie, zmutowany szczep CYR1 Null wykazywał defekt filamentacji in vitro w porównaniu ze szczepem referencyjnym. Natomiast 53% zmutowanych komórek CYR1 Null rosło jako włókna in vivo.

Włókna utworzone przez mutanta CYR1 Null były krótsze niż szczep referencyjny. Bardzo ważne jest, aby podczas inokulacji trzymać igłę równolegle do skóry. Celem jest umieszczenie inokulum tuż pod zewnętrzną warstwą skóry.

Technika ta może być również stosowana w przypadku szczepów myszy, które wyrażają białko fluorescencyjne w komórkach gospodarza będących przedmiotem zainteresowania, co pozwala nam badać interakcje patogenów gospodarza in vivo.