Name: Zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów Candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy Candida albicans w żywym ssaku gospodarza. Technika ta pozwala na nieinwazyjną obserwację adaptacji grzyba podczas infekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NIH 1R01AI33409 oraz Wydział Pediatrii, Carver College of Medicine, University of Iowa.

<ol><li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li>
<li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li>
<li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996(2022).</li>
<li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li>
<li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Candida+albicans+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li>
<li>Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+genes+to+networks%3A+The+regulatory+circuitry+controlling+candida+albicans+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).</li>
<li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+Candida+species%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species.</a> Elife. 10, 64682(2021).</li>
<li>Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. H., Wellington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+morphogenesis+of+Candida+albicans+during+infection+in+a+live+animal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Imaging morphogenesis of Candida albicans during infection in a live animal.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (1), 010504(2010).</li>
<li>Wakade, R. S., Huang, M., Mitchell, A. P., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+Candida+albicans+identifies+differential+in+vitro+and+in+vivo+filamentation+phenotypes+for+transcription+factor+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of Candida albicans identifies differential in vitro and in vivo filamentation phenotypes for transcription factor deletion mutants.</a> mSphere. 6 (3), 0043621(2021).</li>
<li>Wakade, R. S., Kramara, J., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+filamentation+does+not+require+the+cAMP-PKA+pathway+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Candida albicans filamentation does not require the cAMP-PKA pathway in vivo.</a> mBio. 13 (3), 0085122(2022).</li>
<li>Bergeron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+Pseudomonas+aeruginosa+interact+to+enhance+virulence+of+mucosal+infection+in+transparent+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interact to enhance virulence of mucosal infection in transparent zebrafish.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 00475(2017).</li>
<li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+and+filaments+have+specialized%2C+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html">https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html</a> (2020).</li>
<li>Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phenotypic+profile+of+the+Candida+albicans+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network.</a> Plos Genetics. 5 (12), 1000783(2009).</li>
<li>Cullen, P. J., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+filamentous+growth+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The regulation of filamentous growth in yeast.</a> Genetics. 190 (1), 23-49 (2012).</li>
<li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+filament+formation+in+Candida+albicans+by+polyamine+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Control of filament formation in Candida albicans by polyamine levels.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4870-4878 (1999).</li>
<li>Ahmad Hussin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotin+auxotrophy+and+biotin+enhanced+germ+tube+formation+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Biotin auxotrophy and biotin enhanced germ tube formation in Candida albicans.</a> Microorganisms. 4 (3), 37(2016).</li>
<li>Nantel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+profiling+of+Candida+albicans+cells+undergoing+the+yeast-to-hyphal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription profiling of Candida albicans cells undergoing the yeast-to-hyphal transition.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3452-3465 (2002).</li>
<li>Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strains+and+strategies+for+large-scale+gene+deletion+studies+of+the+diploid+human+fungal+pathogen+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Strains and strategies for large-scale gene deletion studies of the diploid human fungal pathogen Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 4 (2), 298-309 (2005).</li>
<li>Glazier, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EFG1%2C+Everyone%27s+favorite+gene+in+Candida+albicans%3A+A+comprehensive+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Infection+and+Microbiology%22%5BJournal%5D)">EFG1, Everyone's favorite gene in Candida albicans: A comprehensive literature review.</a> Frontiers in Cellular Infection and Microbiology. 12, 855229(2022).</li>
<li>Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+and+diverse+regulation+of+the+Ras%2FcAMP%2Fprotein+kinase+A+pathway+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).</li>
<li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+genetically+engineered+strain+to+evaluate+the+pathogenic+potential+of+yeast+cell+and+filamentous+forms+during+Candida+albicans+systemic+infection+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.</a> Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).</li>
<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li>
<li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634(2013).</li>
<li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology.+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199(1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Model ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną do uzyskania obrazów organizmów C. albicans rosnących w tkance ssaka gospodarza, co pozwala nam ocenić fenotypy morfogenezy podczas aktywnej infekcji. Proces morfogenezy ma kluczowe znaczenie dla patogenezy C. albicans i był szeroko badany przy użyciu różnych testów in vitro 2,3,4. Jednak żaden test in vitro nie jest w stanie w pełni odwzorować złożonego środowiska biochemicznego i strukturalnego gospodarza.
Opisany tutaj protokół koncentruje się na wykorzystaniu tego systemu obrazowania in vivo do badania przesiewowego serii/biblioteki mutantów C. albicans w celu identyfikacji genów zaangażowanych w morfogenezę podczas infekcji. Zastosowanie szczepów C. albicans wykazujących ekspresję różnych białek fluorescencyjnych pozwala nam na ilościowe określenie morfogenezy in vivo zmutowanych szczepów C. albicans w porównaniu ze szczepem referencyjnym. Porównanie morfogenezy mutanta ze szczepem referencyjnym w obrębie tego samego obszaru infekcji zapewnia, że organizmy są narażone na identyczne środowisko. Pozwala to na ilościowy pomiar procentu komórek poddawanych filamentacji, a także zakresu filamentacji. Normalizacja pomiarów zmutowanego szczepu (szczepów) do pomiarów szczepu referencyjnego pozwala nam lepiej porównać wydajność jednego mutanta z drugim.
Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki wskazują na możliwość wystąpienia znacznej rozbieżności między fenotypami in vitro i in vivo . Zmutowany szczep C. albicans efg1ΔΔ jest często stosowany jako kontrola ujemna w testach morfogenezy, ponieważ nie udaje się go w filament w prawie wszystkich warunkach in vitro 20. Chociaż wyniki in vivo były bardzo podobne do wyników in vitro , nawet ten poważnie utrudniony szczep czasami tworzył włókna w środowisku tkanki gospodarza (ryc. 3). Podkreśla to siłę środowiska gospodarza w wyzwalaniu morfogenezy.
W przeciwieństwie do tego, zmutowany szczep cyr1ΔΔ wykazuje znaczną dysonans między wzrostem in vitro i in vivo; chociaż żadna ze zmutowanych komórek nie ulega filamentacji in vitro, około połowa komórek rośnie jako włókna in vivo (ryc. 4)10,21. Co ciekawe, włókna te były znacznie krótsze niż te utworzone przez szczep referencyjny, co sugeruje, że CYR1 przyczynia się do tempa wzrostu włókien lub zdolności do utrzymania nitkowatego fenotypu. Aby ułatwić analizę długości włókien, zmierzono długość ścieżki krzywej włókien za pomocą dwuwymiarowej projekcji obrazów. W dwuwymiarowych rzutach włókien rosnących w trzech wymiarach, każde włókno rosnące na osi, która nie jest równoległa do płaszczyzny xy, będzie rzutować jako krótsze niż jego rzeczywista długość. Ponieważ to skrót perspektywiczny występuje również w przypadku szczepu referencyjnego, ocena rozkładu długości włókien w projekcji dwuwymiarowej nadal pozwala na ilościowe porównanie między szczepami referencyjnymi i zmutowanymi. Analiza długości filamentu w dwóch, a nie trzech wymiarach wymaga mniej intensywnej analizy obrazu; Dzięki temu można go wykonać stosunkowo szybko na typowym komputerze stacjonarnym. Korzystanie z tej prostszej analizy pozwala na włączenie rozkładu długości włókien jako części protokołu badań przesiewowych, dając bardziej zniuansowane zrozumienie zdolności każdego mutanta do przechodzenia morfogenezy bez powodowania znacznych opóźnień w przepustowości.
Przedstawione tu reprezentatywne badania przeprowadzono na myszach DBA2/N, które mają defekt w układzie dopełniacza powodujący niepowodzenie rekrutacji neutrofili do miejsca zakażenia C. albicans 22. Celem tych badań było zbadanie mechanizmów regulacji filamentacji C. albicans w tkance gospodarza. Dlatego wykorzystano myszy DBA2/N, aby uniknąć mylenia wyników ze względu na podatność lub oporność poszczególnych szczepów na neutrofile. Ponieważ odpowiedź neutrofili anty-C. albicans może wpływać na filamentację23, rekrutacja neutrofili do miejsca infekcji może mieć wpływ na wyniki testu morfogenezy. Jeśli szczep jest zdolny do filamentacji in vivo , ale jest silnie hamowany przed filamentacją, gdy obecne są neutrofile, filamentacja zostanie wykryta u myszy DBA2 / N, ale jest mało prawdopodobne, aby została zaobserwowana w przypadku użycia myszy z nienaruszoną chemotaksją neutrofili. Tak więc obciążenie myszy używanej jako gospodarz jest ważnym czynnikiem podczas korzystania z tego protokołu.
Obserwacja, że zmutowany szczep efg1ΔΔ nie jest w stanie filamentować in vivo , jest mało prawdopodobna, aby była związana z odpowiedziami neutrofili gospodarza, ponieważ szczep ten również nie jest w stanie filamentować in vitro. Filamentacja obserwowana in vivo ze szczepem cyr1ΔΔ jest niezgodna z jego brakiem filamentacji in vitro. Dane z modelu zakażenia C. albicans u danio pręgowanego wskazują, że reagujące neutrofile są ważne w zapobieganiu morfogenezie24. Dlatego jest mało prawdopodobne, aby użycie myszy DBA2 / N, które nie mają odpowiedzi neutrofili, odpowiadało za wzrost filamentacji cyr1ΔΔ in vivo w porównaniu z in vitro. Niemniej jednak środowisko in vivo ma wyraźny wpływ na morfogenezę szczepu cyr1ΔΔ; w związku z tym dalsze badania tego szczepu mogą dostarczyć ważnych informacji na temat regulacji morfogenezy C. albicans podczas aktywnych infekcji. Opisany tutaj protokół został zaprojektowany jako test przesiewowy w celu identyfikacji szczepów, takich jak szczep cyr1ΔΔ, które mają być wykorzystane w przyszłych badaniach.
Zastosowanie systemu znieczulenia gazowego o niskim przepływie jest bardzo pomocne w tym protokole (ryc. 1A,B). Podczas początkowego opracowywania tego protokołu myszy znieczulono za pomocą wstrzykiwanego koktajlu znieczulającego ketaminy zmieszanego z ksylazyną. Chociaż możliwe było wykonanie ograniczonego obrazowania za pomocą tej metody znieczulającej, czas trwania znieczulenia był nieprzewidywalny, co wymagało szybkiego zakończenia sesji obrazowania, aby uniknąć powrotu myszy do zdrowia po znieczuleniu podczas obrazowania. Tradycyjne wziewne systemy znieczulające są nieporęczne i wymagają dużych szybkości przepływu gazów znieczulających, co często wymaga stosowania ich w dygestorium. W związku z tym tradycyjne wziewne systemy znieczulające byłyby bardzo trudne w użyciu przy ograniczeniach przestrzennych mikroskopu konfokalnego bez nieumyślnego narażenia badaczy na działanie środków znieczulających. Zastosowanie systemu znieczulenia wziewnego o niskim przepływie pozwala na konsekwentne znieczulenie zwierzęcia przy jednoczesnym zachowaniu bezpiecznego środowiska dla badacza. Nos o niskim przepływie umożliwia łatwe pozycjonowanie zwierzęcia zarówno do inokulacji, jak i mikroskopii. Rurka doprowadzająca o małym kalibrze i małej objętości pozwala na użycie stosunkowo długich rurek, co umożliwia umieszczenie aparatu anestezjologicznego w wystarczającej odległości, aby nie zakłócać mikroskopii.
Chlorofil obecny w typowej karmie myszy prowadzi do znacznej autofluorescencji tkanek25. Powoduje to znaczne szumy na obrazach, co utrudnia uzyskanie obrazów o wysokiej jakości i wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Kiedy zwierzęta były karmione karmą bez chlorofilu przez 7 dni przed obrazowaniem, tło z autofluorescencji było znacznie zmniejszone w tkance, ale chlorofil odkładający się we włosach nadal był problematyczny. Usuwanie włosów na małżowinach usznych za pomocą dostępnego bez recepty chemicznego kremu do depilacji skutecznie minimalizuje autofluorescencję we włosach (ryc. 1C, D). W ten sposób połączenie karmy bez chlorofilu i odpowiedniego usuwania owłosienia znacznie zmniejszyło autofluorescencję i znacznie poprawiło jakość obrazu. Ponieważ włosy są usuwane z ucha przed obrazowaniem, kolor sierści zwierzęcia nie ma wpływu na ten układ. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do badania zakażeń C. albicans u myszy BALB/c (biały), C57BL/6 () i DBA2/N (brązowy). Protokół może być również stosowany u myszy z nokautem C57BL/6, które mają niedobór różnych genów gospodarza; Umożliwi to w przyszłości badania nad tym, w jaki sposób układ odpornościowy gospodarza ssaków wpływa na filamentację. Jedną z cech tego modelu, która nie została omówiona w tym protokole, jest to, że ponieważ ten system obrazowania jest nieinwazyjny, to samo zwierzę może być obrazowane wielokrotnie przez kilka dni, co pozwala śledzić postęp poszczególnych infekcji w czasie. Ta cecha prawdopodobnie odegra kluczową rolę w przyszłych badaniach nad interakcją gospodarz-patogen.
Podsumowując, protokół ten skutkuje uzyskaniem obrazów o wysokiej rozdzielczości przestrzennej C. albicans rosnących w tkance żywego ssaka gospodarza, co pozwala na dokładną ocenę morfogenezy w zmutowanych szczepach 8,9,10. Zaprezentowane tutaj wyniki pokazują, w jaki sposób protokół ten może być wykorzystany do badania przesiewowego biblioteki mutantów C. albicans. Spośród przebadanych do tej pory mutantów C. albicans duża część mutantów ze znanymi defektami morfogenezy in vitro łatwo ulega filamentacji in vivo 9,10. Podkreśla to znaczenie włączenia systemu in vivo, takiego jak ten, do eksperymentów mających na celu wyjaśnienie mechanizmów patogenezy C. albicans.

Candida albicans jest powszechnym ludzkim patogenem grzybiczym, powodującym choroby śluzówkowo-skórne, choroby rozsiane i miejscowe infekcje tkanek1. Kluczową cechą fizjologii C. albicans jest jej złożony polimorficzny wzrost, co jest związana z jej rolą zarówno jako komensala, jak i patogenu2,3,4. W warunkach bogatych w składniki odżywcze in vitro w temperaturze 30 °C zwykle rośnie jako jajowate, pączkujące drożdże. Różnorodne czynniki środowiskowe, w tym niedobór składników odżywczych, zmiany pH, wzrost w temperaturze 37 °C, ekspozycja na surowicę i wzrost po zatopieniu w agarze powodują przejście do spolaryzowanego wzorca wzrostu, co skutkuje powstawaniem prawdziwych strzępek i/lub pseudostrzępek5. Inicjacja spolaryzowanego wzrostu i wynikający z niego wzrost organizmów nitkowatych jest określana jako morfogeneza.
Ze względu na znaczenie morfogenezy w zjadliwości organizmu, regulacja tworzenia strzępek była szeroko badana6,7. Istnieje złożona sieć szlaków sygnałowych i regulacji transkrypcji, która wyzwala morfogenezę. Pomimo związku morfogenezy C. albicans z patogenezą, większość badań dotyczących morfogenezy wykorzystywała bodźce in vitro do wywoływania tworzenia strzępek. Staje się coraz bardziej oczywiste, że różne modele filamentacji in vitro nie są identyczne pod względem stymulowanych indywidualnych szlaków regulacyjnych. Co więcej, żadne warunki wzrostu in vitro nie odpowiadają ściśle złożonemu środowisku gospodarza. Biorąc pod uwagę znaczenie C. albicans jako ludzkiego patogenu, celem tego protokołu jest zbadanie jego morfogenezy podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza przy użyciu systemu o umiarkowanej przepustowości, co pozwoli badaczowi na badanie przesiewowe bibliotek mutantów C. albicans.
Aby ułatwić te badania, opracowano system obrazowania in vivo, który pozwala nam uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej komórek C. albicans podczas infekcji małżowiny usznej znieczulonej myszy za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego8,9,10. Ponieważ skóra małżowiny usznej jest dość cienka, obrazy te można uzyskać bez konieczności preparowania tkanek. W ten sposób ilościowe dane fenotypowe można zmierzyć w miejscu aktywnych infekcji w tkance gospodarza. Opisany tutaj protokół obejmuje transformację szczepu referencyjnego i jednego lub więcej zmutowanych szczepów z różnymi kasetami ekspresji białek fluorescencyjnych11,12. Szczepy wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych są następnie mieszane i wstrzykiwane śródskórnie. Po ustaleniu infekcji stosuje się obrazowanie konfokalne w celu ilościowego określenia zarówno częstotliwości filamentacji, jak i długości utworzonych włókien. Dane uzyskane ze zmutowanych szczepów są znormalizowane do danych uzyskanych ze szczepu referencyjnego, który jest obecny w tym samym regionie tkanki, zapewniając w ten sposób kontrolę wewnętrzną. Ten system pozwolił nam z powodzeniem przebadać kilka serii zmutowanych szczepów C. albicans, z których wiele ma defekty morfogenezy in vitro9,10. Wiele z tych szczepów łatwo rozwija się in vivo, co podkreśla znaczenie modeli in vivo dla badań nad morfogenezą.

<table><tbody><tr><td>#1.5 szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo-Fisher</td><td>20811</td><td>wystarczająco duże, aby zakryć uniwersalny otwór sceniczny</td></tr><tr><td>0,1 mL Strzykawki insulinowe</td><td>EXELint</td><td>26018</td><td>Może używać strzykawek o średnicy 5/16"&ndash; 1/2" długości i 29&ndash; 32 G</td></tr><tr><td>3,7% formaldehyd w dPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBJ5734</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu/30% wody</td><td>Decon Laboratories</td><td>A05061001A</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do przygotowywania alkoholu</td><td>Covidien</td><td>5110</td><td>Alternatywa: gaziki nasączone 70% alkoholem izopropylowym</td></tr><tr><td>C.albicans szczep referencyjny i szczepy eksperymentalne</td><td>SN250</td><td>FGSC Katalog</td> <td>onlineSpecyficzny szczep C. albicans różni się w zależności od eksperymentu i celów badaczy. Użyliśmy szczepów pochodzących z SC5314, a także innych izolatów klinicznych.</td></tr><tr><td>Mysz bez chlorofilu</td><td>Komputer Envigo</td><td>2920x</td><td></td></tr><tr><td>Dell</td><td></td><td>Optiplex 7050</td><td>Komputer, na którym można uruchomić oprogramowanie do obrazowania w celu akwizycji i analizy obrazów. Dostępnych jest różne programy do obrazowania, które różnią się w zależności od konkretnego mikroskopu i systemu użytkownika.</td></tr>Można również stosować <tr><td>aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>Pro Advantage</td><td>76200</td><td></td></tr><tr><td>DBA2/N (myszy 6-12 tygodniowe)</td><td></td><td></td><td>Myszy BALB/c i C57/BL6 mogą być również używane. Te ostatnie pozwalają na wykorzystanie powszechnie dostępnych modeli myszy z nokautem, a także modeli mysich, w których poszczególne typy komórek, takie jak fagocyty, są identyfikowane na podstawie ekspresji białek fluorescencyjnych.</td></tr><tr><td>Dwustronna taśma przeznaczona do przytrzymywania tkaniny przy skórze (taśma modowa)</td> <td>w lokalnej aptece lub sklepie</td><td></td> spożywczym <td>Dwustronna taśma klejąca przeznaczona do utrzymywania odzieży na miejscu na ludzkiej skórze. Jest to zazwyczaj dostępne bez recepty w aptekach i sklepach z różnorodnymi rozmaitościami. Ważne jest, aby używać tego rodzaju taśmy, ponieważ jest ona przeznaczona do delikatnego przylegania do skóry. Przykłady:&nbsp; https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =moda+taśma& qid=1649174406& sprefix= moda+taśma%2Caps%2C70& sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =moda+taśma& qid=1649174320& sprefix= moda+taśma%2Caps%2C70& sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =moda+taśma& qid=1649174406& sprefix= moda+taśma%2Caps%2C70& sr=8-29</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>14190-144</td><td>Musi być sterylny; otwierać nowy pojemnik dla każdego eksperymentu</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco / Thermo-Fisher</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Gazik</td><td>Pro Advantage</td><td>P157112</td><td></td></tr><tr><td>Żel do oczu lurbicant</td><td>lokalna apteka lub sklep</td><td></td><td></td>spożywczy</tr><tr><td>ImageJ lub FIJI oprogramowanie analityczne</td><td>NIH</td><td>ImageJ (FIJI)</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Akorn</td><td>J119005</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 (platforma SP8) z obiektywem Leica 11506375</td><td>Leica</td><td>DMi8 (SP8)</td><td>Obiektyw&nbsp; (Leica 11506375) używane tutaj&nbsp; to soczewka zanurzająca w wodzie 25x, która pozwala nam uzyskać wysokie NA (0,95) przy jednoczesnym przybliżeniu współczynnika załamania światła tkanki ucha. Mikroskop (Leica DMi8 (platforma SP8) ma linie lasera diodowego 488 nm i 638 nm i jest wyposażony w bezfiltrową detekcję spektralną ze sterowaną komputerowo regulowaną szerokością pasma do wykrywania światła emisyjnego. Stolik musi mieć wystarczający prześwit, aby obiektyw mógł Dotrzyj do dolnego szkiełka nakrywkowego bez uderzania w scenę.</td></tr><tr><td>System anestezjologiczny o niskim przepływie lub tradycyjny waporyzator anestezjologiczny</td><td>Kent Scientific International</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Nair balsam do depilacji</td><td>lokalna apteka lub sklep</td><td></td> spożywczy <td>Dostępny bez recepty krem do depilacji</td></tr><tr><td>Nourseothricin</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB-101L</td><td></td></tr><tr><td>pENO1-NEON-NATR plazmidy</td><td></td><td></td> <td>pENO1-iRFP-NATRKonstrukty transformacji ekspresji białek fluorescencyjnych&nbsp; hojnie podarowany nam przez dr Roberta Wheelera (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infekcja i odporność)</td></tr><tr><td>Taśma laboratoryjna wrażliwa na nacisk</td><td>Taśma & Label Graphic Systems Inc</td><td>1007910</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 pożywki do hodowli komórkowych</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Naparstek, plastikowa rurka stożkowa 15 ml lub probówki polistyrenowe Falcon 5 ml z okrągłym dnem</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td>Aby bezpiecznie trzymać ucho zwierząt podczas wstrzykiwań</td></tr></tbody></table>

zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans jest ważnym ludzkim patogenem. Jego zdolność do przełączania się między formami morfologicznymi ma kluczowe znaczenie dla jego patogenezy; Te zmiany morfologiczne są regulowane przez złożoną sieć sygnalizacyjną kontrolowaną w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Te składniki regulacyjne zostały dokładnie przebadane, ale prawie wszystkie badania wykorzystują różne bodźce in vitro do wywołania filamentacji. Aby określić, w jaki sposób morfogeneza jest regulowana podczas procesu patogenezy, opracowaliśmy system mikroskopii in vivo, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej organizmów przechodzących tworzenie strzępek w organizmie ssaka. Przedstawiony tutaj protokół opisuje zastosowanie tego systemu do badań przesiewowych małych zbiorów zmutowanych szczepów C. albicans, co pozwala nam zidentyfikować kluczowe regulatory morfogenezy zachodzącej w miejscu infekcji. Przedstawiono reprezentatywne wyniki, które pokazują, że niektóre regulatory morfogenezy, takie jak regulator transkrypcji Efg1, mają spójne fenotypy in vitro i in vivo, podczas gdy inne regulatory, takie jak cyklaza adenylowa (Cyr1), mają znacząco różne fenotypy in vivo w porównaniu z in vitro.

Przedstawione tutaj wyniki opierają się na wcześniej opublikowanych raportach9,10. Celem niniejszej analizy jest ilościowa ocena zdolności mutantów szczepów C. albicans do przechodzenia morfogenezy podczas aktywnych infekcji. Typowe parametry odróżniające pseudohif od hif mogą być trudne do oceny w organizmach rosnących trójwymiarowo w złożonym środowisku in vivo. Jest to szczególnie widoczne w przypadku dwuwymiarowych przekrojów uzyskanych za pomocą obrazowania konfokalnego. Dlatego też niniejsza analiza przesiewowa koncentruje się na identyfikacji organizmów rosnących w formie włóknistej w przeciwieństwie do formy drożdżowej. W badaniach następczych, z wykorzystaniem bardziej szczegółowej analizy, w tym rekonstrukcji trójwymiarowych, metodę tę można by dostosować do rozróżniania drożdżaków, hif i pseudohif.
Ekspresja białka fluorescencyjnego w szczepie referencyjnym lub mutantycznym C. albicans umożliwia bezpośrednią detekcję morfologii szczepu in vivo (Rycina 3 oraz Rycina 4). Generalnie ilościowa analiza za pomocą mikroskopii świetlnej jest najskuteczniejsza, gdy niewiele lub żadne z pikseli na obrazie nie jest nasycone. W przypadku niniejszego protokołu nasycenie obrazu często jednak upraszcza analizę. Lokalizacja białka fluorescencyjnego nie jest jednolita w całej komórce i często jest wyższa w komórce macierzystej drożdży niż w filamentach. Na szczęście w badaniach nad morfogenezą to przestrzenny rozkład sygnału, a nie jego intensywność, definiuje wynik. Zatem uzyskanie obrazów, w których wiele pikseli jest nasyconych, poprawia możliwość ilościowego określenia morfogenezy w tym teście.
Aby zilustrować znaczenie oceny morfogenezy in vivo, przedstawiono reprezentatywne wyniki dla szczepu referencyjnego (SN250) oraz dwóch mutantów: jednego pozbawionego czynnika transkrypcyjnego Efg1 i drugiego pozbawionego cyklazy adenylowej Cyr1. In vitro żaden z tych szczepów nie rośnie w formie filamentów20,21. Podczas hodowli in vitro w podłożu RPMI uzupełnionym o 10% surowicy, szczep referencyjny szybko tworzy filamenty, podczas gdy szczepy efg1ΔΔ i cyr1ΔΔ tego nie robią (Rysunek 3 i Rysunek 4). W tych warunkach mutant efg1ΔΔ wykazuje w pewnym stopniu polaryzację wzrostu, przy czym komórki potomne są lekko wydłużone w porównaniu z komórkami macierzystymi. Podkreśla to znaczenie stosowania jasnej definicji filamentacji. Każda taka definicja jest z założenia arbitralna, ale jest ona niezbędna do spójnej oceny fenotypu. W tych badaniach filamentowy wzór wzrostu zdefiniowano jako organizm, w którym największy wymiar komórki potomnej jest więcej niż dwukrotnie większy od wymiaru komórki macierzystej. Stosując tę definicję, wydłużone komórki efg1ΔΔ nie są uznawane za filamentowe.
Zgodnie z fenotypem in vitro, szczep efg1ΔΔ wykazuje istotny defekt filamentacji in vivo: około 9% komórek efg1ΔΔ rosło w formie filamentów in vivo (Rycina 3). W przeciwieństwie do tego, 53% komórek mutanta cyr1ΔΔ rosło jako filamenty in vivo (Rycina 4). Chociaż liczba komórek mutanta cyr1ΔΔ ulegających filamentacji in vivo była znacznie niższa niż w szczepie referencyjnym, zdolność mutanta cyr1ΔΔ do tworzenia filamentów in vivo stanowi istotną zmianę w stosunku do całkowitego braku morfogenezy in vitro. Wizualnie filamenty tworzone przez mutant cyr1ΔΔ wydawały się krótsze niż w szczepie referencyjnym. Aby ocenić to ilościowo, zmierzono długość ścieżki krzywej komórek filamentacyjnych przy użyciu dwuwymiarowej projekcji obrazów in vivo (Rycina 4E). Mediana długości filamentów cyr1ΔΔ była o 29% krótsza niż długość filamentów szczepu referencyjnego.
<img alt="Układ eksperymentalny do znieczulenia myszy z wykorzystaniem metod inhalacyjnej i iniekcyjnej w badaniach medycznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Znieczulenie i inokulacja. (A) Indukcja znieczulenia przy użyciu komory indukcyjnej. (B) Utrzymywanie znieczulenia za pomocą maski nosowej, co pozwala na zmianę pozycji myszy w razie potrzeby. (C) Aplikacja kremu do depilacji za pomocą aplikatora z watką. W celu ochrony oczu podczas znieczulenia zastosowano żel nawilżający do oczu. (D) Skuteczna depilacja prawego ucha. Porównanie z niepoddanym zabiegowi lewym uchem. (E) Iniekcja śródskórna C. albicans do ucha myszy. Ucho jest stabilizowane za pomocą końcówki probówki stożkowej owiniętej dwustronną taśmą skórną (taśmą krawiecką). (F) Zbliżenie iniekcji śródskórnej. W skórze tworzy się blady pęcherzyk, co jest oznaką prawidłowego podania śródskórnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ mikroskopowy z myszami do badania neurologicznego; proces obejmuje badanie optyczne i analizę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przygotowanie do obrazowania. (A) Stolik mikroskopu przygotowany do obrazowania. Stożek anestezjologiczny jest zamocowany na miejscu. Do stolika przyklejono taśmą szkiełko nakrywkowe, zasłaniające otwór obiektywu. Dostępne są dodatkowe kawałki taśmy. Podgrzewany stolik jest wstępnie rozgrzany do 37 °C (nie pokazano). (B) Umieszczenie znieczulonej myszy w stożku anestezjologicznym. (C) Mysz jest lekko obracana tak, aby strona ucha, w którą podano inokulum, była skierowana w stronę dolnego szkiełka nakrywkiego/obiektywu. Ucho jest następnie dociśnięte do dolnego szkiełka nakrywkiego i unieruchomione poprzez nałożenie drugiego szkiełka nakrywkiego na wierzch ucha. (D) Górne szkiełko nakrywkowe jest przyklejone taśmą do stolika, aby unieruchomić ucho względem stolika mikroskopu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie wzrostu komórek nitkowatych; mikroskopia w polu jasnym, mikroskopia fluorescencyjna, wykresy słupkowe; badanie genetyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: In vitro i in vivo morfologia efg1szczep mutant $\Delta\Delta$. (A) Obraz szerokopolowy WT i efg1szczepy mutanty ΔΔ po in vitro indukcja filamentacji poprzez hodowlę komórek w pożywce RPMI + 10% surowicy w temperaturze 37 °C przez 4 h. Paski skali oznaczają 10 µmKontrast obrazu został dostosowany przy użyciu oprogramowania do edycji zdjęć w celu ułatwienia oglądania.B) Procent filamentacji in vitro obserwowano w WT oraz efg1szczepy mutanty ΔΔ. Und = niewykrywalne (nie wykryto filamentów). Wysokość słupka reprezentuje medianę procentowego udziału komórek filamentowatych z trzech niezależnych eksperymentów, w których poddano analizie co najmniej 100 komórek. Słupki błędu wskazują odchylenie standardowe (wyniki porównano testem t studenta) t-test, p &lt; 0.001). (C) Mikrografia konfokalna typu WT (zielony) i efg1mutant ΔΔ (czerwony) w fazie wzrostu in vivo 24 h po inokulacji. Strzałki wskazują przykłady efg1Komórki mutanty ΔΔ, które spełniają naszą definicję „nitkowatych”. Pasek skali oznacza 50 µm. (D) Procent filamentacji in vivo obserwowane w WT oraz efg1Szczepy mutanty ΔΔ. Wysokość słupków reprezentuje medianowy procent komórek nitkowatych z dwóch niezależnych eksperymentów. Słupki błędu wskazują odchylenie standardowe (wyniki porównano za pomocą testu t studenta) t-test, p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza komórek nitkowatych; obrazy mikroskopowe, wykresy słupkowe, wykres rozrzutu; badanie morfologii komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: In vitro i in vivo morfologia cyr1szczep mutant $\Delta\Delta$. (A) Obraz szerokopolowy (widefield) cyr1szczep mutant ΔΔ po in vitro indukcja filamentacji poprzez hodowlę komórek w pożywce RPMI + 10% surowicy w 37 °C przez 4 h. Pasek skali oznacza 10 µmKontrast obrazu został dostosowany przy użyciu oprogramowania do edycji zdjęć w celu ułatwienia oglądania.B) Procent nitek (filamentacji) in vitro obserwowano w WT i cyr1Szczepy mutanty ΔΔ. Und = niewykrywalne (nie wykryto filamentów). Wysokość słupka reprezentuje medianowy procent komórek filamentacyjnych z trzech niezależnych eksperymentów, w których poddano analizie co najmniej 100 komórek. Słupki błędu wskazują odchylenie standardowe (wyniki porównano testem t studenta) t-test, p &lt; 0.001). (C) Mikrograf konfokalny WT (zielony) i the cyr1mutant ΔΔ (czerwony) w fazie wzrostu in vivo 24 h po inokulacji. Pasek skali oznacza 50 µm. (D) Procent filamentacji in vivo obserwowano w grupie WT i cyr1szczepy mutanty ΔΔ. Wysokość słupków reprezentuje medianę procentowego udziału komórek nitkowatych z dwóch niezależnych eksperymentów. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe (wyniki porównano testem t studenta) t-test, p &lt; 0.001). (E) Rozkład długości filamentów in vivo, mierzona jako długość ścieżki krzywej w dwuwymiarowej projekcji stosu z (z-stack). Każda kropka reprezentuje długość jednego filamentu. W analizie nie uwzględniono komórek rosnących w formie drożdżowej. Słupek oznacza medianę długości filamentów. Rozkład długości jest istotnie różny w analizie z wykorzystaniem testu U Manna-Whitneya (p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten manuskrypt opisuje metodę badania przesiewowego bibliotek mutantów Candida albicans średniej wielkości pod kątem fenotypów morfogenezy podczas aktywnej infekcji u ssaków za pomocą nieinwazyjnej mikroskopii konfokalnej.

Zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów Candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Morfogeneza Candida albicans jest wywoływana przez niezliczone sygnały środowiskowe. Badając morfogenezę in vivo, określamy, w jaki sposób organizm integruje się i reaguje na wszystkie te sygnały środowiskowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam badać morfogenezę przy braku uprzedzeń lub artefaktów, które mogą zostać wprowadzone za pomocą systemów modelowych in vitro.Bardzo niewiele osób ma doświadczenie z iniekcjami śródskórnymi. Zdecydowanie zalecam, aby ktoś, kto jest nowy w tej technice, skontaktował się z weterynarzem zajmującym się zasobami zwierzęcymi w celu uzyskania pomocy w jej nauce. Procedurę zademonstruje Rohan Wakade, adiunkt z naszej grupy laboratoryjnej.Zacznij od przygotowania zwierzęcia do szczepienia, podając karmę wolną od chlorofilu przez co najmniej siedem dni przed inokulacją. Na jeden dzień przed wstrzyknięciem należy pobrać odrobinę komórek Canada albicans z jednej kolonii za pomocą wykałaczki. Zaszczepij 25 mililitrów YPD i powtórz ten proces kilka razy, aby uzyskać komórki z kilku różnych kolonii.Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną z prędkością 175 obr./min. Odwirować jeden mililitr kultury przez dwie minuty przy 500 x g, a następnie umyć drożdże trzykrotnie jednym mililitrem sterylnego DPBS. Zawiesić osad w jednym mililitrze sterylnego DPBS i rozcieńczyć kulturę w stosunku 1 do 100.Policz komórki za pomocą hemocytometru i odpowiednio dostosuj gęstość komórek. Następnie należy utworzyć inokulum do wstrzyknięcia, mieszając równe objętości szczepu referencyjnego i eksperymentalnego. Za pomocą wacika z bawełnianą końcówką nałóż obficie dostępny bez recepty krem do depilacji na wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię obu uszu znieczulonego zwierzęcia.Po dwóch do trzech minutach delikatnie przetrzyj ucho suchą gazą, a następnie gazikami nasączonymi sterylną wodą, aby dokładnie usunąć pozostałości kremu do depilacji. Po wysterylizowaniu powierzchni uszu 70% etanolem, dobrze wymieszaj inokulum, kilkakrotnie odwracając fiolkę lub obracając ją. Narysuj od 20 do 30 mikrolitrów inokulum do strzykawki insulinowej.Trzymać igłę w pozycji pionowej i delikatnie postukać w strzykawkę, aby upewnić się, że powietrze w cylindrze znajduje się na górze. Ostrożnie wyrzuć powietrze i nadmiar inokulum z powrotem do probówki z inokulum lub rurki odpływowej, tak aby tłok znalazł się na znaku 10 mikrolitrów. Nałóż bez recepty dwustronną taśmę do skóry na małą stożkową lub okrągłodenną plastikową rurkę i ułóż ucho w poprzek taśmy, unikając przemieszczenia stożka nosowego do znieczulenia.Trzymając igłę strzykawki prawie równolegle do skóry i unikając dużych żył, włóż końcówkę igły w najbardziej zewnętrzną warstwę skóry, aż skos zostanie pokryty i powoli wstrzyknij inokulum śródskórnie. Dobre wstrzyknięcie śródskórne spowoduje powstanie małego pęcherzyka w skórze. Trzymaj igłę na miejscu przez 15 do 20 sekund przed wyjęciem jej z ucha, aby zminimalizować wyciek.Zgodnie z protokołami instytucjonalnymi, oznacz klatkę etykietami zagrożenia biologicznego wskazującymi, że zwierzęta w klatce są zarażone Candida albicans. Używając tych samych umytych kultur, które zostały użyte do przygotowania inokulum, stwórz rozcieńczenie komórek od 1 do 50 w RPMI 1640, uzupełnione 10% ciepłem i aktywowaną płodową surowicą bydlęcą i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z bębnowaniem przez cztery godziny. Zbadaj próbkę pod mikroskopem.Policz co najmniej 100 komórek, zapisując liczbę drożdży i komórek nitkowatych dla każdego szczepu. Obróć obiektyw o dużej odległości roboczej na miejsce i umieść kroplę płynu zanurzeniowego na soczewce. Obniż soczewkę, aby uniknąć możliwego uszkodzenia podczas zakładania szkiełka nakrywkowego.Umieść szkiełko nakrywkowe numer 1.5 na otworze sceny i przyklej je taśmą. Podnieś obiektyw tak, aby płyn zanurzeniowy stykał się zarówno z soczewką obiektywu, jak i szkiełkiem nakrywkowym. Zamocuj stożek nosowy do znieczulenia na stoliku mikroskopu w taki sposób, aby całkowicie zakrywał nos zwierzęcia, gdy znajduje się w pozycji do obrazowania.Umieść nos znieczulonej myszy w stożku nosowym. Umieść kroplę sterylnej wody na szkiełku nakrywkowym nad soczewką obiektywu. Wyreguluj stożek nosowy anestezjologiczny i ustaw mysz tak, aby ucho myszy znajdowało się nad kroplą wody.Weź kolejną szkiełko nakrywkowe i umieść krawędź szkiełka nakrywkowego równolegle do korpusu myszy, tak aby krawędź dotykała myszy w miejscu, w którym ucho styka się z głową. Za pomocą ruchu zawiasowego opuść wolną krawędź szkiełka nakrywkowego do stolika mikroskopu. Gdy szkiełko nakrywkowe zbliży się do stolika mikroskopu, spłaszczy ucho.Przyklej bezpiecznie górną szkiełko nakrywkowe, aby utrzymać wystarczający nacisk, aby ucho było płaskie i uniknąć zaczepienia włosów myszy lub wąsów o taśmę. O ile nie używany jest mikroskop z komorą środowiskową, luźno przykryj ciało myszy sterylną serwetą, aby utrzymać normalne środowisko termiczne. Korzystając z białego światła, obrazowania szerokokątnego, dostosuj płaszczyznę ostrości do tkanki ucha i skup się na czerwonych krwinkach poruszających się w naczyniach krwionośnych.Aby uzyskać wystarczająco silny stosunek sygnału do szumu, aby można było określić morfologię dla wszystkich komórek w polu widzenia, dostosuj moc lasera lub prędkość obrazowania. Aby uniknąć uszkodzenia tkanek, używaj najmniejszej możliwej mocy lasera. Wybierz pole widzenia z wyraźnym tworzeniem włókien w odnośnym szczepie i gdzie większość organizmów jest wystarczająco rozsiana, aby można było określić ich morfologię.Ustaw górną i dolną płaszczyznę ostrości dla stosu Z. Pokrycie całej głębokości zainfekowanego obszaru nie jest konieczne, ale należy pamiętać, że organizmy na górze lub na dole obrazowanej objętości są zwykle wykluczane z analizy. Zdobądź obrazy stosu Z, pseudopokoloruj każdy kanał, aby odróżnić każdy szczep i nałóż kanały.Zapisz obrazy. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby wykonać maksymalną projekcję stosu Z na obraz dwuwymiarowy. Policz każdy organizm widziany na obrazach maksymalnej projekcji według typu szczepu i morfologii.Wspomniany szczep szybko tworzy włókna in vitro. Natomiast EFG1 Null nie zdołał uformować włókien. EFG1 Null wykazuje również znaczny defekt filamentacji in vivo.Około 9% komórek zerowych EFG1 rosło jako włókna in vivo. Podobnie, zmutowany szczep CYR1 Null wykazywał defekt filamentacji in vitro w porównaniu ze szczepem referencyjnym. Natomiast 53% zmutowanych komórek CYR1 Null rosło jako włókna in vivo.Włókna utworzone przez mutanta CYR1 Null były krótsze niż szczep referencyjny. Bardzo ważne jest, aby podczas inokulacji trzymać igłę równolegle do skóry. Celem jest umieszczenie inokulum tuż pod zewnętrzną warstwą skóry.Technika ta może być również stosowana w przypadku szczepów myszy, które wyrażają białko fluorescencyjne w komórkach gospodarza będących przedmiotem zainteresowania, co pozwala nam badać interakcje patogenów gospodarza in vivo.

use-vivo-imaging-to-screen-for-morphogenesis-phenotypes-candida

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System obrazowania in vivo jest wykorzystywany do generowania pomiarów ilościowych zakażenia myszy pierwotniakiem z grupy Trypanosomatidów, Leishmania. Jest to nieinwazyjna i nieletalna metoda wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję lucyferazy w wielu tkankach w przebiegu przewlekłej infekcji Leishmania spp.

Obrazowanie in vivo transgenicznych pasożytów Leishmania u żywego gospodarza

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Zakażenie noworodków ludzkim wirusem cytomegalii (HCMV) stanowi ważną przyczynę upośledzenia umysłowego, jednak zdarzenia molekularne prowadzące do patogenezy wywołanej przez wirusa są nadal słabo poznane. Aby zbadać dynamikę infekcji mózgu, dostosowaliśmy obrazowanie in vivo całych zwierząt do przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie noworodków zakażonych wirusem rekombinowanym lucyferazy.

Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Ten artykuł wideo opisuje potok o wysokiej przepustowości, który został pomyślnie ustanowiony do infekowania i analizowania dużej liczby zarodków danio pręgowanego, dostarczając nowego potężnego narzędzia do testowania związków i odkrywania leków przy użyciu całego organizmu kręgowców zwierzęcych.

Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

Przedstawiamy eksperymentalną procedurę rozwoju biofilmu Candida albicans w mysim modelu podskórnym. Biofilmy grzybów określono ilościowo, określając liczbę jednostek tworzących kolonie oraz nieinwazyjne obrazowanie bioluminescencyjne, w którym ilość wytwarzanego światła odpowiada liczbie żywotnych komórek.

Candida albicans (Candida albicans) Rozwój biofilmu na istotnych z medycznego punktu widzenia ciałach obcych w mysim modelu podskórnym, a następnie obrazowanie bioluminescencyjne

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Celem tego protokołu jest wizualizacja kształtu i lokalizacji komórek Candida albicans w przewodzie pokarmowym ssaków.

Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Test ex vivo opisany w tym badaniu z wykorzystaniem ekstraktów homogenatu jelitowego i barwienia immunofluorescencyjnego stanowi nowatorską metodę badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym. Metoda ta może być wykorzystana do badania sygnałów środowiskowych regulujących przemianę morfogenetyczną w jelitach.

Test ex vivo do badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym

Ten protokół opisuje zastosowanie przeciwbakteryjnej terapii fotodynamicznej (aPDT) w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. aPDT wykonano przy użyciu rozpuszczalnej w wodzie mieszaniny kurkuminoidów i niebieskiego światła LED.

Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna za pośrednictwem kurkuminoidów na mysim modelu kandydozy jamy ustnej

Poznaj metodę obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy Candida albicans w żywym ssaku gospodarza. Technika ta pozwala na nieinwazyjną obserwację adaptacji grzyba podczas infekcji.

Zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów Candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów Candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza

Przeglądaj więcej filmów