Mechanostymulacja organizmów wielokomórkowych za pomocą wysokoprzepustowego systemu kompresji mikroprzepływowej
23 grudnia 2022
Obecny protokół opisuje projekt, produkcję i charakterystykę systemu mikroprzepływowego zdolnego do wyrównania, unieruchomienia i precyzyjnego ucisku setek zarodków Drosophila melanogaster przy minimalnym zaangażowaniu użytkownika. System ten umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i odzyskiwanie próbek do analizy po stymulacji i może być skalowany w celu uwzględnienia innych wielokomórkowych systemów biologicznych.
Protokół ten wyjaśnia, w jaki sposób wytwarzać i wykorzystywać technologie mikroprzepływowe w celu wykorzystania korzyści eksperymentalnych w zakresie przepustowości próbek, zautomatyzowanej obsługi i możliwości precyzyjnego stosowania naprężeń mechanicznych przy jednoczesnej wizualizacji próbek. Technika ta minimalizuje ręczne obchodzenie się z wielokomórkowymi organizmami biologicznymi, takimi jak zarodki i organoidy, w celu ich unieruchomienia, wyrównania i obrazowania na żywo. Umożliwia również zastosowanie do nich kompresji mechanicznej do badań mechanobiologicznych.
Wytwarzanie form o wysokim współczynniku kształtu dla tego układu mikroprzepływowego może być wyzwaniem przy konwencjonalnych technikach mikrowytwarzania. Wskazówki przedstawione w tym artykule wideo mogą przezwyciężyć te wyzwania. Na początek wyczyść płytkę silikonową najpierw acetonem, a następnie alkoholem izopropylowym.
Umieść wafel silikonowy na płycie grzejnej o temperaturze 250 stopni Celsjusza na 30 minut. Do odwodnienia upiec. Pokryj płytkę krzemową heksametylodiloksanem w piecu parowym.
Umieść butelkę SU-8 2100 Photoresist w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza na 15 minut, aby zmniejszyć jej lepkość. Wlej jeden mililitr podgrzanego Photoresist na każdy cal płytki krzemowej umieszczonej na płycie grzejnej, aż Photoresist pokryje większość powierzchni. Zastosuj wirowanie wstępne najpierw z prędkością 250 obrotów na minutę przez 30 sekund, a następnie z prędkością 350 obrotów na minutę przez kolejne 30 sekund, w obu przypadkach z przyspieszeniem 100 obrotów na minutę.
Następnie najpierw wykonaj wirowanie z prędkością 500 obrotów na minutę przez 15 sekund z przyspieszeniem 100 obr./min na sekundę, a następnie z prędkością 1,450 obrotów na minutę przez 30 sekund z przyspieszeniem 300 obr./min na sekundę. Usuń listwę krawędziową za pomocą wacika do pomieszczeń czystych i spryskaj płytkę acetonem, aby usunąć niedoskonałości i zapewnić jednolitą powłokę. Wystaw wafel silikonowy na działanie światła UV o natężeniu 350 milidżuli na centymetr kwadratowy przez maskę fotograficzną.
Za pomocą nakładki do masek kontaktowych nałóż na płytkę silikonową wypalanie po ekspozycji i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Umieść zlewkę w innej, większej zlewce i napełnij większą zlewkę świeżym roztworem wywoływacza. Umieść metalową siatkę na zlewce.
Umieść wafel silikonowy na metalowej siatce do góry nogami. Pozostaw wafel krzemowy zanurzony w wywoływaczu na 30 minut przy włączonym mieszadle. Przenieś płytkę krzemową do ultradźwiękowej kąpieli sonicznej wypełnionej świeżym wywoływaczem przez godzinę w temperaturze 40 kiloherców.
Następnie wyjmij wafel z zlewki i umyj go świeżym roztworem wywoływacza. Przygotuj wstępnie utwardzony roztwór PDMS, mieszając bazę PDMS ze środkiem utwardzającym w stosunku 10 do jednego. Odgazować mieszaninę, umieszczając ją w wirówce na 500 g na pięć minut w temperaturze pokojowej.
Wlej wstępnie utwardzony PDMS na płytkę krzemową i ponownie ją odgazuj. Na koniec umieść nieutwardzony PDMS w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza w celu utwardzenia. Użyj skalpela, aby przeciąć granice utwardzonego obszaru PDMS odpowiadające geometrii chipa mikroprzepływowego.
Przebij otwory wlotowe i wylotowe w PDMS za pomocą stempla do biopsji lub igły z końcówką. Umieść PDMS na szkiełku podstawowym z wzorzystą powierzchnią skierowaną w stronę szkiełka po obróbce plazmowej, aby uszczelnić mikrokanały poprzez wiązanie kowalencyjne. Pozwól dorosłym muchom Oregon-R złożyć jaja na płytkach agarowych z sokiem jabłkowym i zbierz płytki w pożądanym czasie rozwoju po złożeniu jaj dla danego eksperymentu.
Zalej agar płynem do płukania jaj zarodkowych i delikatnie pomieszaj zarodki pędzlem, aby usunąć je z agaru. Przenieś zarodki do 50% roztworu wybielacza na 90 sekund, od czasu do czasu mieszając. Przecedź zarodki przez sito tkankowe i dokładnie zmyj roztwór wybielacza wodą.
Przenieś zarodki na 90-milimetrową szklaną szalkę Petriego z wystarczającą ilością płynu do płukania jaj zarodkowych, aby całkowicie pokryć zarodki. Zbadaj zarodki z transillumination na mikroskopie preparacyjnym i wybierz zarodki o pożądanym stadium rozwoju do załadowania do urządzenia mikroprzepływowego. Zagruntować wszystkie siedem mikrokanalików zarodka, wypełniając je 0,4 mikrometra przefiltrowanego IPA przez główny port wlotowy zarodka.
Zastąp IPA 0,4 mikrometra przefiltrowanej wody dejonizowanej. Następnie zastąp wodę demineralizowaną roztworem do płukania jaj zarodkowych. Zbierz około 100 wstępnie wybranych zarodków ze szklanej szalki Petriego za pomocą szklanej pipety.
Następnie pipetuj zarodki do portu wlotowego zarodka i przyłóż podciśnienie około trzech PSI do wlotu gazu za pomocą przenośnej pompy próżniowej, aby otworzyć mikrokanaliki zarodka. Następnie przechyl chip mikroprzepływowy w dół, aby zarodki automatycznie wyrównały się i osiadły w mikrokanalikach zarodka. Jeśli wloty mikrokanalików zarodka zostaną zatkane przez wiele zarodków wchodzących jednocześnie, przechyl chip mikroprzepływowy w górę, a następnie ponownie w dół, aby usunąć zatkanie.
W zależności od wymaganej przepustowości wprowadzić do mikrokanalików zarodkowych aż 300 zarodków. Po zakończeniu ładowania zarodków usuń podciśnienie, aby unieruchomić zarodki. Następnie przechyl mikro chip z powrotem do pozycji poziomej.
Podłącz przenośne źródło nadciśnienia z manometrem do wlotu gazu, aby zastosować kompresję trzech PSI. Jeśli na zarodkach stymulowanych mechanicznie będą przeprowadzane eksperymenty obrazowania na żywo, należy umieścić chip mikroprzepływowy na standardowym uchwycie na szkiełku mikroskopowym z wlotem gazu podłączonym do źródła ciśnienia. Zbadaj zarodki pod mikroskopem fluorescencyjnym wewnątrz kanałów mikroprzepływowych.
Po zakończeniu eksperymentu z uciskiem zarodki mogą zostać pobrane do dalszej analizy. Aby to zrobić, najpierw zastosuj podciśnienie do wlotu gazu, aby uwolnić zarodki. Następnie przechyl chip mikroprzepływowy do góry, aby zarodki przesunęły się w dół w kierunku portu wprowadzania zarodka.
Pobrać zarodki z chipa mikroprzepływowego za pomocą szklanej pipety. Funkcjonalność urządzenia mikroprzepływowego została eksperymentalnie określona poprzez załadowanie zarodków Drosophila do kanałów kompresyjnych i zastosowanie dodatniego ciśnienia w kanałach gazowych. Zarodki nie doświadczają znacznej kompresji w próżni lub w stanie neutralnego ciśnienia.
Są ściskane po przyłożeniu nadciśnienia. Pomiary zmniejszającej się szerokości zarodków pod mikroskopem pokazują, w jaki sposób można wykorzystać ciśnienie gazu do uzyskania docelowego poziomu kompresji. Wykonane w ten sposób urządzenia mikroprzepływowe pozwalają na chemiczną stymulację unieruchomionych próbek.
Stymulacja pozwala na wysokie obrazowanie czasoprzestrzenne. Podstawowym pytaniem w biologii rozwoju jest to, w jaki sposób siły mechaniczne regulują ekspresję białek i genów podczas rozwoju? Technologia ta pozwala nam na zastosowanie stymulacji mechanicznej do dużej liczby zarodków jednocześnie, dzięki czemu możemy wyizolować wystarczającą ilość białka i RNA, aby przeprowadzić proteomikę porównawczą lub eksperymenty transkryptomiczne.
Dzięki temu naukowcy będą mogli dowiedzieć się więcej o białkach i genach, które są wrażliwe na siły mechaniczne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje konstrukcję i zastosowanie systemu mikrofluidycznego do wyrównywania i unieruchamiania embrionów Drosophila melanogaster. Umożliwia on obrazowanie o wysokiej rozdzielczości oraz odzysk próbek przy jednoczesnym ograniczeniu ręcznej manipulacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Mechanobiologia
- Obrazowanie embrionów
Wprowadzenie
- Technologie mikrofluidyczne zwiększają przepustowość próbek i automatyzację ich obsługi.
- Precyzyjne przyłożenie naprężeń mechanicznych jest kluczowe dla badań z zakresu mechanobiologii.
- Konwencjonalne techniki mikrofabrykacji mogą być problematyczne w przypadku elementów o wysokim stosunku wysokości do szerokości.
- Niniejszy protokół zawiera wskazówki pozwalające pokonać te trudności.
Cel badania
- Wytworzenie systemu mikroprzepływowego do unieruchamiania i wyrównywania zarodków.
- Umożliwienie obrazowania na żywo organizmów wielokomórkowych.
- Zastosowanie kompresji mechanicznej w celu przeprowadzenia analiz mechanobiologicznych.
Zastosowane metody
- Czyszczenie wafli krzemowych acetonem i alkoholem izopropylowym.
- Wytwarzanie form do chipów mikroprzepływowych.
- Pozycjonowanie i immobilizacja embrionów.
- Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości podczas przykładania naprężeń mechanicznych.
Główne wyniki
- Skuteczne ustawienie i unieruchomienie setek embrionów.
- Wykazanie możliwości obrazowania o wysokiej rozdzielczości.
- Efektywne zastosowanie kompresji mechanicznej do analizy.
- Potwierdzona skalowalność w odniesieniu do innych wielokomórkowych systemów biologicznych.
Wnioski
- System mikrofluidyczny znacznie ogranicza konieczność ręcznej obsługi.
- Usprawnia on możliwość badania mechanobiologii embrionów.
- Podejście to można dostosować do różnych organizmów wielokomórkowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowe mikrofluidyczne systemy kompresyjne umożliwiają skalowalną mechanostymulację organizmów wielokomórkowych, rozwiązując krytyczny problem wąskiego gardła w badaniach nad mechanobiologią i biologią rozwoju. Technologia ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad ekspresją genów i białek, umożliwiając precyzyjne, zrównoleglone zaburzenia mechaniczne oraz analizę ilościową. Jej integracja wspiera rzetelną walidację celów terapeutycznych i ograniczanie ryzyka na wczesnych etapach odkrywania oraz w punktach zwrotnych fazy przedklinicznej w procesach rozwoju leków w branży biofarmaceutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną analizę szlaków mechanosensytywnych w modelach całego organizmu.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez korelację bodźców mechanicznych ze zmianami w ekspresji genów i białek.
- Zwiększa pewność predykcyjną hipotez mechanistycznych dzięki wysokoprzepustowym, ilościowym wynikom.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane, unieruchomione układy biologiczne do późniejszych etapów przesiewowych.
- Standaryzuje protokoły stymulacji mechanicznej w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności ilościowej.
- Umożliwia skalowalne przetwarzanie próbek na potrzeby rozwoju analiz omicznych oraz oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki mechanostymulacji z profilami ekspresji genów i białek istotnymi dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki możliwości prowadzenia wielkoskalowych, równoległych analiz próbek.
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie identyfikacji biomarkerów translacyjnych w układach wielokomórkowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten mikrofluidyczny system kompresji znajduje zastosowanie od wczesnych etapów odkryć po badania przedkliniczne, umożliwiając testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz wysokoprzepustowe przygotowanie próbek do analiz omicznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez zerowych poprzez kontrolowane zaburzenia mechaniczne i ilościowe odczyty.
- Screening: Zapewnia powtarzalną i skalowalną immobilizację oraz stymulację próbek w celu przygotowania do analizy.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów odpowiedzi mechanicznej, wspierając analizę porównawczą różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z fazą przedkliniczną, wspierając wielkoskalowe badania biomarkerów oparte na mechanizmach biologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, adaptowalną platformę dla zróżnicowanych wielokomórkowych systemów modelowych i projektów eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i automatyzuje obsługę próbek, poprawiając powtarzalność i przepustowość.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go poprzez wspieranie generowania rzetelnych, ilościowych danych z zakresu mechanobiologii.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój celów zwalidowanych mechanistycznie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie wytwarzania układów mikrofluidycznych oraz projektowania eksperymentów z zakresu mechanobiologii.
- Wymaga dostępu do obrazowania o wysokiej rozdzielczości oraz aparatury mikrofluidycznej z kontrolą ciśnienia.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania próbek i przepływu analizy danych.
- Adaptowalna geometria umożliwia zastosowanie w różnych modelowych systemach wielokomórkowych.
- Przepustowość próbek i skalowalność urządzeń są ograniczone przez infrastrukturę wytwarzania i obsługi.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Preparation of the Silicon Wafer Mold
3:31
Fabrication of the Microfluidic Chip
4:39
Preparation of the Fruit Fly Embryos
5:47
Applying Mechanical Stimulation to Fruit Fly Embryos Using the Microfluidic Chip
8:19
Results: Experimental Measurement of Embryo Compression Level
8:58
Conclusion
