Mechanostymulacja organizmów wielokomórkowych za pomocą wysokoprzepustowego systemu kompresji mikroprzepływowej
December 23rd, 2022
Obecny protokół opisuje projekt, produkcję i charakterystykę systemu mikroprzepływowego zdolnego do wyrównania, unieruchomienia i precyzyjnego ucisku setek zarodków Drosophila melanogaster przy minimalnym zaangażowaniu użytkownika. System ten umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i odzyskiwanie próbek do analizy po stymulacji i może być skalowany w celu uwzględnienia innych wielokomórkowych systemów biologicznych.
Protokół ten wyjaśnia, w jaki sposób wytwarzać i wykorzystywać technologie mikroprzepływowe w celu wykorzystania korzyści eksperymentalnych w zakresie przepustowości próbek, zautomatyzowanej obsługi i możliwości precyzyjnego stosowania naprężeń mechanicznych przy jednoczesnej wizualizacji próbek. Technika ta minimalizuje ręczne obchodzenie się z wielokomórkowymi organizmami biologicznymi, takimi jak zarodki i organoidy, w celu ich unieruchomienia, wyrównania i obrazowania na żywo. Umożliwia również zastosowanie do nich kompresji mechanicznej do badań mechanobiologicznych.
Wytwarzanie form o wysokim współczynniku kształtu dla tego układu mikroprzepływowego może być wyzwaniem przy konwencjonalnych technikach mikrowytwarzania. Wskazówki przedstawione w tym artykule wideo mogą przezwyciężyć te wyzwania. Na początek wyczyść płytkę silikonową najpierw acetonem, a następnie alkoholem izopropylowym.
Umieść wafel silikonowy na płycie grzejnej o temperaturze 250 stopni Celsjusza na 30 minut. Do odwodnienia upiec. Pokryj płytkę krzemową heksametylodiloksanem w piecu parowym.
Umieść butelkę SU-8 2100 Photoresist w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza na 15 minut, aby zmniejszyć jej lepkość. Wlej jeden mililitr podgrzanego Photoresist na każdy cal płytki krzemowej umieszczonej na płycie grzejnej, aż Photoresist pokryje większość powierzchni. Zastosuj wirowanie wstępne najpierw z prędkością 250 obrotów na minutę przez 30 sekund, a następnie z prędkością 350 obrotów na minutę przez kolejne 30 sekund, w obu przypadkach z przyspieszeniem 100 obrotów na minutę.
Następnie najpierw wykonaj wirowanie z prędkością 500 obrotów na minutę przez 15 sekund z przyspieszeniem 100 obr./min na sekundę, a następnie z prędkością 1,450 obrotów na minutę przez 30 sekund z przyspieszeniem 300 obr./min na sekundę. Usuń listwę krawędziową za pomocą wacika do pomieszczeń czystych i spryskaj płytkę acetonem, aby usunąć niedoskonałości i zapewnić jednolitą powłokę. Wystaw wafel silikonowy na działanie światła UV o natężeniu 350 milidżuli na centymetr kwadratowy przez maskę fotograficzną.
Za pomocą nakładki do masek kontaktowych nałóż na płytkę silikonową wypalanie po ekspozycji i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Umieść zlewkę w innej, większej zlewce i napełnij większą zlewkę świeżym roztworem wywoływacza. Umieść metalową siatkę na zlewce.
Umieść wafel silikonowy na metalowej siatce do góry nogami. Pozostaw wafel krzemowy zanurzony w wywoływaczu na 30 minut przy włączonym mieszadle. Przenieś płytkę krzemową do ultradźwiękowej kąpieli sonicznej wypełnionej świeżym wywoływaczem przez godzinę w temperaturze 40 kiloherców.
Następnie wyjmij wafel z zlewki i umyj go świeżym roztworem wywoływacza. Przygotuj wstępnie utwardzony roztwór PDMS, mieszając bazę PDMS ze środkiem utwardzającym w stosunku 10 do jednego. Odgazować mieszaninę, umieszczając ją w wirówce na 500 g na pięć minut w temperaturze pokojowej.
Wlej wstępnie utwardzony PDMS na płytkę krzemową i ponownie ją odgazuj. Na koniec umieść nieutwardzony PDMS w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza w celu utwardzenia. Użyj skalpela, aby przeciąć granice utwardzonego obszaru PDMS odpowiadające geometrii chipa mikroprzepływowego.
Przebij otwory wlotowe i wylotowe w PDMS za pomocą stempla do biopsji lub igły z końcówką. Umieść PDMS na szkiełku podstawowym z wzorzystą powierzchnią skierowaną w stronę szkiełka po obróbce plazmowej, aby uszczelnić mikrokanały poprzez wiązanie kowalencyjne. Pozwól dorosłym muchom Oregon-R złożyć jaja na płytkach agarowych z sokiem jabłkowym i zbierz płytki w pożądanym czasie rozwoju po złożeniu jaj dla danego eksperymentu.
Zalej agar płynem do płukania jaj zarodkowych i delikatnie pomieszaj zarodki pędzlem, aby usunąć je z agaru. Przenieś zarodki do 50% roztworu wybielacza na 90 sekund, od czasu do czasu mieszając. Przecedź zarodki przez sito tkankowe i dokładnie zmyj roztwór wybielacza wodą.
Przenieś zarodki na 90-milimetrową szklaną szalkę Petriego z wystarczającą ilością płynu do płukania jaj zarodkowych, aby całkowicie pokryć zarodki. Zbadaj zarodki z transillumination na mikroskopie preparacyjnym i wybierz zarodki o pożądanym stadium rozwoju do załadowania do urządzenia mikroprzepływowego. Zagruntować wszystkie siedem mikrokanalików zarodka, wypełniając je 0,4 mikrometra przefiltrowanego IPA przez główny port wlotowy zarodka.
Zastąp IPA 0,4 mikrometra przefiltrowanej wody dejonizowanej. Następnie zastąp wodę demineralizowaną roztworem do płukania jaj zarodkowych. Zbierz około 100 wstępnie wybranych zarodków ze szklanej szalki Petriego za pomocą szklanej pipety.
Następnie pipetuj zarodki do portu wlotowego zarodka i przyłóż podciśnienie około trzech PSI do wlotu gazu za pomocą przenośnej pompy próżniowej, aby otworzyć mikrokanaliki zarodka. Następnie przechyl chip mikroprzepływowy w dół, aby zarodki automatycznie wyrównały się i osiadły w mikrokanalikach zarodka. Jeśli wloty mikrokanalików zarodka zostaną zatkane przez wiele zarodków wchodzących jednocześnie, przechyl chip mikroprzepływowy w górę, a następnie ponownie w dół, aby usunąć zatkanie.
W zależności od wymaganej przepustowości wprowadzić do mikrokanalików zarodkowych aż 300 zarodków. Po zakończeniu ładowania zarodków usuń podciśnienie, aby unieruchomić zarodki. Następnie przechyl mikro chip z powrotem do pozycji poziomej.
Podłącz przenośne źródło nadciśnienia z manometrem do wlotu gazu, aby zastosować kompresję trzech PSI. Jeśli na zarodkach stymulowanych mechanicznie będą przeprowadzane eksperymenty obrazowania na żywo, należy umieścić chip mikroprzepływowy na standardowym uchwycie na szkiełku mikroskopowym z wlotem gazu podłączonym do źródła ciśnienia. Zbadaj zarodki pod mikroskopem fluorescencyjnym wewnątrz kanałów mikroprzepływowych.
Po zakończeniu eksperymentu z uciskiem zarodki mogą zostać pobrane do dalszej analizy. Aby to zrobić, najpierw zastosuj podciśnienie do wlotu gazu, aby uwolnić zarodki. Następnie przechyl chip mikroprzepływowy do góry, aby zarodki przesunęły się w dół w kierunku portu wprowadzania zarodka.
Pobrać zarodki z chipa mikroprzepływowego za pomocą szklanej pipety. Funkcjonalność urządzenia mikroprzepływowego została eksperymentalnie określona poprzez załadowanie zarodków Drosophila do kanałów kompresyjnych i zastosowanie dodatniego ciśnienia w kanałach gazowych. Zarodki nie doświadczają znacznej kompresji w próżni lub w stanie neutralnego ciśnienia.
Są ściskane po przyłożeniu nadciśnienia. Pomiary zmniejszającej się szerokości zarodków pod mikroskopem pokazują, w jaki sposób można wykorzystać ciśnienie gazu do uzyskania docelowego poziomu kompresji. Wykonane w ten sposób urządzenia mikroprzepływowe pozwalają na chemiczną stymulację unieruchomionych próbek.
Stymulacja pozwala na wysokie obrazowanie czasoprzestrzenne. Podstawowym pytaniem w biologii rozwoju jest to, w jaki sposób siły mechaniczne regulują ekspresję białek i genów podczas rozwoju? Technologia ta pozwala nam na zastosowanie stymulacji mechanicznej do dużej liczby zarodków jednocześnie, dzięki czemu możemy wyizolować wystarczającą ilość białka i RNA, aby przeprowadzić proteomikę porównawczą lub eksperymenty transkryptomiczne.
Dzięki temu naukowcy będą mogli dowiedzieć się więcej o białkach i genach, które są wrażliwe na siły mechaniczne.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół wyjaśnia projekt i zastosowanie mikrofluidycznego systemu do ustawiania i unieruchamiania zarodków Drosophila melanogaster. Umożliwia wysokiej rozdzielczości obrazowanie i odzyskiwanie próbek, minimalizując jednocześnie manualne manipulacje.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Mechanobiologia
- Obrazowanie zarodków
Tło
- Technologie mikrofluidyczne zwiększają przepływ próbek i automatyzację obsługi.
- Precyzyjne stosowanie stresu mechanicznego jest kluczowe dla badań mechanobiologii.
- Konwencjonalne techniki mikrofabrykacji mogą być wyzwaniem dla funkcji o wysokiej proporcji kształtu.
- Ten protokół dostarcza wskazówek, jak pokonać te wyzwania.
Cel badania
- Wytworzenie systemu mikrofluidycznego do unieruchamiania i ustawiania zarodków.
- Umożliwienie obrazowania na żywo wielokomórkowych organizmów.
- Zastosowanie kompresji mechanicznej do analizy mechanobiologii.
Stosowane metody
- Czyszczenie płytek krzemu za pomocą acetonu i alkoholu izopropylowego.
- Wytwarzanie form do chipów mikrofluidycznych.
- Ustawianie i unieruchamianie zarodków.
- Wysokiej rozdzielczości obrazowanie podczas stosowania stresu mechanicznego.
Główne wyniki
- Udane ustawianie i unieruchamianie setek zarodków.
- Zdemonstrowane możliwości wysokiej rozdzielczości obrazowania.
- Skuteczna aplikacja kompresji mechanicznej do analizy.
- Potwierdzona skalowalność na inne wielokomórkowe systemy biologiczne.
Wnioski
- System mikrofluidyczny znacząco zmniejsza manualne manipulacje.
- Poprawia zdolność do badania mechanobiologii w zarodkach.
- To podejście może być dostosowane do różnych wielokomórkowych organizmów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput microfluidic compression systems enable scalable mechanostimulation of multicellular organisms, addressing a critical bottleneck in mechanobiology and developmental biology research. This technology enhances predictive confidence in gene and protein expression studies by allowing precise, parallelized mechanical perturbation and quantitative analysis. Its integration supports robust target validation and de-risking at early discovery and preclinical inflection points in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of mechanosensitive pathways in whole-organism models.
- Supports functional target validation by correlating mechanical stimuli with gene and protein expression changes.
- Facilitates predictive confidence in mechanistic hypotheses through high-throughput, quantitative outputs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, immobilized biological systems for downstream screening workflows.
- Standardizes mechanical stimulation protocols to ensure reproducibility and quantitative comparability.
- Enables scalable sample processing for omics-based assay development and compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanostimulation outputs with disease-relevant gene and protein expression profiles.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling large-scale, parallel sample analysis.
- Provides mechanistic de-risking for translational biomarker identification in multicellular systems.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic compression system fits from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and high-throughput sample preparation for omics analyses.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing by enabling controlled mechanical perturbation and quantitative readouts.
- Screening: Delivers reproducible, scalable sample immobilization and stimulation for assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative measurements of mechanical response, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by supporting large-scale, mechanistically informed biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse multicellular model systems and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and automates sample handling, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by supporting robust, quantitative mechanobiology data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mechanistically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics fabrication and mechanobiology experimental design.
- Needs access to high-resolution imaging and pressure-controlled microfluidic instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis workflows.
- Adaptable geometry allows use across various multicellular model systems.
- Sample throughput and device scalability are limited by fabrication and handling infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Preparation of the Silicon Wafer Mold
3:31
Fabrication of the Microfluidic Chip
4:39
Preparation of the Fruit Fly Embryos
5:47
Applying Mechanical Stimulation to Fruit Fly Embryos Using the Microfluidic Chip
8:19
Results: Experimental Measurement of Embryo Compression Level
8:58
Conclusion
