Name: Analiza autofagii wywołanej głodem w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Poznaj metodę indukcji autofagii w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster poprzez pozbawienie aminokwasów. Analiza klonów mutacyjnych z użyciem GFP-Atg8a pozwala badać dynamikę autofagii w odpowiedzi na dostępność składników odżywczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni THFC i BDSC za dostarczenie szczepów much. Dr Tong Chao jest wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32030027, 91754103, 92157201) oraz fundusze na badania podstawowe dla uniwersytetów centralnych. Dziękujemy podstawowej placówce Instytutu Nauk Przyrodniczych (LSI) za świadczenie usług.

1. Krzyżowanie się Drosophila i składanie jaj
<ol>
	<li>Wprowadzić 3 samce (genotyp hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) i 15 samic (genotyp y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP) dorosłe muchy (patrz tabela materiałów) do fiolki hodowlanej (ze standardową pożywką z mąki kukurydzianej/melasy/agaru Drosophila w temperaturze 25 °C) w celu krycia. 
	UWAGA: Należy ustawić wiele fiolek z kulturami tej samej krzyżówki, aby zapewnić wystarczającą ilość larw do dalszych eksperymentów. Samce muchy o genotypie hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a są nosicielami miejsca FRT na chromosomie X w pobliżu centromeru (FRT19A). Wyraża również FLP po szoku cieplnym w temperaturze 37 °C. Transgen z wszechobecną ekspresją RFP jest wstawiany do chromosomu X. GFP-Atg8a ulega ekspresji pod kontrolą cgGal4 w ciele tłuszczowym larw22. Samica szczepu muchy o genotypie y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP jest nosicielem śmiertelnej mutacji (Mu) i FRT19A na chromosomie X. Szczegółowy schemat skrzyżowania jest pokazany w Rysunek 1.</li>
	<li>W celu złożenia jaj przenieś muchy do nowej fiolki z kulturą. Po 48 godzinach od wprowadzenia, stukać w fiolkę "matującą", aż muchy zostaną ogłuszone i upuść na pożywkę u podstawy fiolki.
	<ol>
		<li>Odłączyć "łączącą" fiolkę i przykryć jej usta odłączoną odwróconą fiolką ze świeżą pożywką (fiolka ze świeżymi kulturami). Następnie przenieś muchy do świeżej fiolki z kulturą, odwracając i stukając w fiolki.</li>
		<li>Zatkać świeżą fiolkę z kulturą (z przeniesionymi muchami) i wyrzucić starą fiolkę z kulturą. Umieścić tę fiolkę ze świeżymi kulturami w inkubatorze o temperaturze 25 °C do składania jaj na świeżej pożywce. 
		UWAGA: Wstępne podgrzanie świeżych fiolek z kulturami do temperatury 25 °C przez 15 minut przed procesem przenoszenia much pomoże muchom szybko przystosować się do nowego środowiska i przyspieszyć składanie jaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Muchy usuwamy po 6 godzinach od złożenia jaj. Jeśli eksperymenty muszą zostać powtórzone, przenieś te muszki do innej fiolki z kulturą (jak opisano w kroku 1.2). W przeciwnym razie wyrzuć muchy, wrzucając je do kolby zawierającej 75% etanolu).
	<ol>
		<li>Inkubować fiolkę z zarodkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu wywołania ekspresji FLP. Następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 25 °C i pozwolić zarodkom na dalszy rozwój. 
		UWAGA: Pomyślne formowanie się zmutowanych klonów może być następnie potwierdzone za pomocą obrazowania. Brak sygnałów RFP oznacza zmutowane klony.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Głód aminokwasów indukuje autofagię
<ol>
	<li>Za pomocą szpatułki laboratoryjnej zgarnij pożywkę zawierającą rozwijające się larwy na szalkę Petriego 75 godzin po złożeniu jaj. Dodaj 3 ml 1x PBS do naczynia i delikatnie oddziel pożywkę hodowlaną i larwy za pomocą długich kleszczy. Wybierz od 10 do 15 larw we wczesnym stadium rozwoju. 
	UWAGA: Larwy wczesnego stadium rozwoju muszą być starannie wybierane. Etap rozwoju larw ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego protokołu. Ze względu na ograniczony czas składania jaj oczekuje się, że większość larw w fiolce hodowlanej będzie we wczesnym trzecim stadium rozwojowym po 75 godzinach inkubacji. Jednak różne receptury pożywek hodowlanych mogą prowadzić do różnic w czasie rozwoju larw. Kryteriami rozróżniania larw wczesnego trzeciego stadium rozwojowego są długość ciała, obecność przetchlinków przednich i tylnych, a także haki żuchwy aparatu gębowego23.</li>
	<li>Napełnij studzienki 9-dołkowej szklanej płytki punktowej z wgłębieniem (patrz Tabela materiałów) 1x PBS. Umieść oddzielone larwy trzeciego stadium w studzienkach za pomocą długich kleszczy i dokładnie umyj larwy, aby usunąć wszystkie pozostałości pożywki.</li>
	<li>Weź 5 ml 20% roztworu sacharozy (w 1x PBS) do pustej fiolki i umieść czyste larwy trzeciego stadium w tym roztworze za pomocą długich kleszczy. Inkubować tę fiolkę w inkubatorze w temperaturze 25 °C przez 6 godzin przed pobraniem ich do sekcji. 
	UWAGA: 20% roztwór sacharozy (w 1x PBS) służy jako pożywka głodowa z niedoborem aminokwasów.</li>
</ol>
3. Sekcja larw w trzecim stadium rozwojowym i przetwarzanie próbek tkanek
<ol>
	<li>Naostrz dwie pary kleszczy #5 (patrz Tabela materiałów) równomiernie po obu stronach za pomocą kamienia do ostrzenia.</li>
	<li>Dodaj 400 μl 1x PBS do każdej studzienki 9-dołkowej szklanej płytki punktowej i przenieś larwy do studzienek za pomocą długich kleszczy. Umieść jedną larwę w studzience stroną grzbietową (stroną z tchawicą) skierowaną do góry.
	<ol>
		<li>Chwyć naskórek larwy dwoma kleszczami #5 na środku pnia larwy i delikatnie rozerwij skórki. Odsłonięte ciała tłuszczowe, wraz z innymi wewnętrznymi tkankami larw, będą nadal przyczepione do tuszy larwy. Pociągnij na tyle, aby jak najbardziej odsłonić narządy wewnętrzne. Powtórz ten krok dla wszystkich larw. 
		UWAGA: Każda larwa ma dwa duże kawałki ciała tłuszczowego wzdłuż tułowia ciała. Tkanka tłuszczowa jest białą, nieprzezroczystą i płaską monowarstwą, którą można łatwo odróżnić pod mikroskopem preparacyjnym24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść tuszę larwalną do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 25 °C bez wytrząsania probówek. 
	UWAGA: 4% PFA jest toksyczne. Nosić rękawiczki i maski dla ochrony. 
	UWAGA: Zaleca się przygotowanie 4% PFA w buforze 1x PBS. Proszek PFA nie rozpuszcza się natychmiast w 1x PBS. W związku z tym mieszaninę należy inkubować w temperaturze 65 °C w inkubatorze przez noc lub wstrząsać z przerwami przez 45 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Po 30 minutach inkubacji tuszy z 4% PFA, odpipetować roztwór PFA, dodać 500 μL 1x PBS do probówki i delikatnie potrząsać probówką na płaskim rotatorze przez 10 minut przed odrzuceniem 1x roztworu PBS (powtórzyć 3x).</li>
	<li>Za pomocą długich kleszczy przenieś utrwaloną i umytą tuszę larwalną do studzienki w 9-wklęsłej płytce punktowej wypełnionej 1x PBS. Za pomocą kleszczy #5 usuń wszystkie beztłuszczowe tkanki ciała.</li>
	<li>Użyj kleszczyków #5, aby zamontować kawałki ciała tłuszczowego na szkiełku mikroskopowym, używając 80% glicerolu jako medium montażowego i połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu. 
	UWAGA: Przed montażem sprawdź pH 80% glicerolu (przy użyciu bibułek do pomiaru pH, pH = 7 jest optymalne), aby chronić sygnał GFP. Podłoże montażowe (patrz Tabela Materiałów) z DAPI w 80% glicerolu pomoże w obrazowaniu jąder komórek tłuszczowych. Szkiełka te są stabilne przez 1 tydzień, jeśli są przechowywane w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+Molecular+machinery+for+self-eating%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autophagy: Molecular machinery for self-eating.</a> Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).</li>
<li>Jin, S., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cancer%3A+Management+of+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress.</a> Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).</li>
<li>Yang, Z., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eaten+alive%3A+A+history+of+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eaten alive: A history of macroautophagy.</a> Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).</li>
<li>Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagosome%3A+Origins+unknown%2C+biogenesis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).</li>
<li>Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosomes%2C+phagosomes%2C+autolysosomes%2C+phagolysosomes%2C+autophagolysosomes...Wait%2CI%27mconfused%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused.</a> Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+autophagy+proteins-Diversification+in+eukaryotes+and+potential+ancestors+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).</li>
<li>Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+regulation+of+starvation-induced+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body.</a> Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+import+regulates+cytosolic+protein+homeostasis+and+neuronal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity.</a> Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).</li>
<li>Ichimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin-like+system+mediates+protein+lipidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin-like system mediates protein lipidation.</a> Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).</li>
<li>Rusten, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body+is+induced+by+ecdysone+through+regulation+of+the+PI3K+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway.</a> Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).</li>
<li>Nishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Atg5%2FAtg7-independent+alternative+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy.</a> Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).</li>
<li>Ravikumar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammalian+autophagy+in+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).</li>
<li>Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+controls+phagophore+expansion+during+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).</li>
<li>Shintani, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+proteins+facilitate+the+formation+of+transport+vesicles+in+the+cytoplasm+to+vacuole+targeting+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).</li>
<li>Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+regulation+by+nutrient+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Autophagy regulation by nutrient signaling.</a> Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).</li>
<li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+and+why+to+study+autophagy+in+Drosophila%3A+It%27s+more+than+just+a+garbage+chute%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute.</a> Methods. 75, 151-161 (2015).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li>
<li>Senecoff, J. F., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directionality+in+FLP+protein-promoted+site-specific+recombination+is+mediated+by+DNA-DNA+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).</li>
<li>Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis in Drosophila.</a> Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).</li>
<li>Zappia, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F%2FDp+inactivation+in+fat+body+cells+triggers+systemic+metabolic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes.</a> eLife. 10, 67753(2021).</li>
<li>Demerec, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDemerec%2C+M+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).</li>
<li>Rizki, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+fat+body+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27s+Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval fat body surfaces.</a> Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).</li>
<li>Szeto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALIS+are+stress-induced+protein+storage+compartments+for+substrates+of+the+proteasome+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy.</a> Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Renna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+inducers+of+autophagy+that+enhance+the+clearance+of+mutant+proteins+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+RNA+interference+screen+identifies+genes+that+regulate+autophagy+at+different+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages.</a> Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).</li>
<li>Tian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+for+analysis+of+autophagy+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An antibody for analysis of autophagy induction.</a> Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).</li>
<li>Nezis, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy in Drosophila.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 146767(2012).</li>
<li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+materials+for+monitoring+mitochondrial+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology.</a> Materials. 14 (15), 4180(2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Niniejszy protokół opisuje metody (1) generowania muszek przenoszących zmutowane klony w ciałach tłuszczowych larw, (2) indukowania autofagii poprzez głód aminokwasów, oraz (3) preparowania ciał tłuszczowych larw. Aby pomyślnie wytworzyć klony w larwalnych ciałach tłuszczowych, należy starannie przeprowadzić następujące krytyczne kroki. (1) Dokładny czas szoku cieplnego ma kluczowe znaczenie, ponieważ rekombinacja mitotyczna zachodzi tylko wtedy, gdy tkanka przechodzi mitozę, oraz (2) zarówno temperatura, jak i czas trwa...

Autofagia to proces "samozjadający" wywołany różnymi stresami, w tym głodem aminokwasów1. Makroautofagia (zwana dalej autofagią) jest najlepiej zbadanym typem autofagii i odgrywa niezastąpioną rolę w utrzymaniu homeostazy komórkowej2. Nieprawidłowe działanie autofagii jest związane z kilkoma chorobami ludzkimi3. Ponadto niektóre geny związane z autofagią są potencjalnymi celami w leczeniu różnych chorób4. 
Autofagia jest regulowana w bardzo wyrafinowany sposób5. Po wygłodzeniu błony izolacyjne sekwestrują materiały cytoplazmatyczne, tworząc autofagosomy o podwójnej błonie6. Autofagosomy następnie łączą się z endosomami i lizosomami, tworząc amfisomy i autolizosomy. Za pomocą lizosomalnych enzymów hydrolitycznych pochłonięta zawartość cytoplazmatyczna ulega degradacji, a składniki odżywcze są poddawane recyklingowi7. 
Autofagia to ewolucyjnie zachowany proces8. Drosophila melanogaster jest doskonałym modelem do badania procesu autofagii in vivo. Głód aminokwasów łatwo indukuje autofagię w tkance tłuszczowej muchy, analogu ludzkiej wątroby i tkanki tłuszczowej9. Defekty autofagii zakłócają wyraźne wzorce puncta kilku białek związanych z autofagią, takich jak między innymi Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 i p6210. Dlatego analiza wzorców tych markerów autofagii pomoże dostrzec występowanie wad autofagii i wadliwego etapu autofagii. Na przykład białko podobne do ubikwityny Atg8 jest najczęściej stosowanym markerem autofagii11. U Drosophila melanogaster udało się opracować transgeniczne szczepy z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) oznaczonym zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) Atg8a12. GFP-Atg8a jest dyfundowany w cytozolu i jądrach w karmionych komórkach. Po zagłodzeniu, GFP-Atg8a jest przetwarzany i modyfikowany przez fosfatydyloetanoloaminę (PE) i tworzy puncta, które oznaczają błony izolacyjne i w pełni rozwinięte autofagosomy13,14. Dzięki bezpośredniej mikroskopii fluorescencyjnej indukcję autofagii można łatwo zaobserwować jako wzrost tworzenia się punktów GFP-Atg815. Atg8a puncta nie powstawałaby w odpowiedzi na głód w obecności defektu inicjacji autofagii. Ponieważ GFP-Atg8a może być gaszony i trawiony przez niskie pH w autolizosomach, GFP-Atg8a puncta może zwiększyć swoją liczbę, jeśli autofagia zostanie zablokowana w późnych stadiach16.
Ponieważ autofagia jest bardzo wrażliwa na dostępność składników odżywczych17, niewielkie różnice w warunkach hodowli często prowadzą do różnic w fenotypach. Dlatego analiza klonalna, metoda analizująca zmutowane komórki w porównaniu z komórkami kontrolnymi typu dzikiego w tej samej tkance, ma główną przewagę w analizowaniu defektów autofagii18. Korzystając z rekombinacji specyficznej dla miejsca między chromosomami za pośrednictwem flp/FRT, w której pośredniczy reflukaza/refpasa rozpoznawanie celu, łatwo powstają muchy przenoszące tkanki mozaiki19,20. Dzikie komórki otaczające zmutowane komórki tworzą doskonałą kontrolę wewnętrzną, aby uniknąć różnic indywidualnych21.
Niniejsze badanie opisuje, jak wywołać autofagię poprzez głód aminokwasów i wygenerować mozaikę tkanek tłuszczowych wyrażających GFP-Atg8a. Protokoły te mogą być wykorzystywane do analizy różnic w autofagii wśród zmutowanych klonów.

<table><tbody><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>#5 Kleszcze</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>9 Opatrunki Płytka punktowa</td><td>PYREX</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100854-0100</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610440-0500</td><td>Skład 1x roztwór PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600445-0500</td><td>Skład 1x roztwór PBS</td></tr><tr><td>Szpatułka laboratoryjna</td><td>Fisher</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze długie</td><td>R' DEER</td><td>RST-14</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe mikroskopu</td><td>CITOTEST</td><td>80340-1130</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>CITOTEST</td><td>80302-2104</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>Skład 1x roztwór PBS</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>Skład 1x roztwór PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr>Standardowy pokarm <td></td><td></td> z <td>mąki kukurydzianej / melasy / agaru</td><td>Tong Laboratoryjny</td></tr><tr><td>mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10021418</tr><tr><td>Medium montażowe przeciw blaknięciu Vectashield z DAPI</td><td>Vectorlabratory</td><td>H-1200-10</td><td>Zalecane medium</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> montażowe<tr><td><mocne>Muchy kolby</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yw* Iso FRT19A</td><td></td><td></td><td>Tong Lab</td> Fly</tr> <tr><td>stocksy'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFPMuchy </td><td></td><td></td><td>Tong Lab</td></tr> <tr><td>yw* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's fly stocks</td></tr><tr><td>hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a</td><td></td><td></td><td>Tong Lab</td></tr></tbody></table>

analiza autofagii wywołanej głodem w ciele tłuszczowym larw drosophila melanogaster

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Autofagia to proces samotrawienia komórkowego. Dostarcza ładunek do lizosomów w celu degradacji w odpowiedzi na różne stresy, w tym głód. Nieprawidłowe działanie autofagii wiąże się ze starzeniem się i wieloma chorobami ludzkimi. Maszyneria autofagii jest wysoce konserwatywna - od drożdży po ludzi. Larwalne ciało tłuszczowe Drosophila melanogaster, analog wątroby kręgowców i tkanki tłuszczowej, stanowi unikalny model monitorowania autofagii in vivo. Autofagia może być łatwo wywołana przez głód składników odżywczych w ciele tłuszczowym larw. Większość genów związanych z autofagią jest konserwatywna u Drosophila. Opracowano wiele transgenicznych szczepów much wykazujących ekspresję znakowanych markerów autofagii, co ułatwia monitorowanie różnych etapów procesu autofagii. Analiza klonalna umożliwia dokładne porównanie markerów autofagii w komórkach o różnych genotypach w tym samym fragmencie tkanki. Obecny protokół szczegółowo opisuje procedury (1) generowania klonów somatycznych w ciele tłuszczowym larw, (2) indukowania autofagii poprzez głód aminokwasów oraz (3) preparowania ciała tłuszczowego larw, mając na celu stworzenie modelu do analizy różnic w autofagii przy użyciu markera autofagosomów (GFP-Atg8a) i analizy klonalnej.

W warunkach sytości białko podobne do ubikwityny oznakowane GFP, GFP-Atg8a, jest rozproszone wewnątrz komórek. W przypadku głodzenia tworzy ono zielone punkty i znakuje autofagosomy. Po połączeniu się autofagosomów z lizosomami sygnał GFP zostaje wygaszony w kwaśnych autolizosomach, a zielone punkty zanikają. Jeśli autofagia nie zostanie indukowana lub dojrzewanie autofagosomów zostanie przyspieszone, oczekuje się, że liczba punktów GFP będzie niska. Jeżeli jednak fuzja autofagosomów z lizosomami zostanie zablokowana lub...

Obecny protokół opisuje indukcję autofagii w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster poprzez wyczerpanie składników odżywczych i analizuje zmiany w autofagii za pomocą transgenicznych szczepów much.

Analiza autofagii wywołanej głodem w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Protokół ten opisuje, jak indukować autofagię w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster poprzez zubożenie aminokwasów i jak analizować różnice w autofagii wśród zmutowanych klonów. Ponieważ autofagia jest bardzo wrażliwa na dostępność składników odżywczych w warunkach hodowli, analiza klonalna, metoda polegająca na analizie zmutowanych komórek w porównaniu z komórkami typu dzikiego w tej samej tkance, ma przewagę w analizowaniu defektów autofagii. Zacznij od wprowadzenia trzech samców i 15 dorosłych samic much do fiolki hodowlanej ze standardową mąką kukurydzianą lub melasą lub pożywką agarową Drosophila w temperaturze 25 stopni Celsjusza do krycia.Po 48 godzinach od indukcji należy postukać w fiolkę z pasującymi środkami, aż muchy zostaną ogłuszone i opaść na pożywkę u podstawy fiolki. Odłączyć fiolkę do krycia i przykryć jej usta odłączoną odwróconą fiolką z hodowlą ze świeżym podłożem. Następnie odwróć i postukaj w fiolki, aby przenieść muchy do świeżej fiolki z kulturą.Zatkać świeżą fiolkę z kulturą bakterii i wyrzucić starą fiolkę. Umieść fiolkę ze świeżymi kulturami w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza w celu składania jaj na świeżej pożywce. Usuń muchy po sześciu godzinach składania jaj i wyrzuć muchy, wrzucając je do kolby zawierającej 75% etanolu.Inkubować fiolkę z zarodkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby wywołać ekspresję flippazy. Następnie umieść je w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza i pozwól zarodkom dalej się rozwijać. Za pomocą szpatułki laboratoryjnej zgarnij pożywkę zawierającą rozwijające się larwy na szalkę Petriego 75 godzin po złożeniu jaj.Dodaj 1X PBS do naczynia i delikatnie oddziel pożywkę hodowlaną i larwy za pomocą długich kleszczy. Następnie wybierz od 10 do 15 larw we wczesnym stadium rozwoju. Napełnij studzienki dziewięciodołkowej szklanej płytki punktowej z wgłębieniem 1X PBS i umieść oddzielone larwy trzeciego stadium w studzienkach za pomocą długich kleszczy.Dokładnie umyj larwy, aby usunąć wszystkie pozostałości podłoża. Weź pięć mililitrów 20% roztworu sacharozy do pustej fiolki i umieść czyste larwy trzeciego stadium w tym roztworze za pomocą długich kleszczy. Inkubuj tę fiolkę w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza przez sześć godzin przed pobraniem ich do sekcji.Dodaj 1X PBS do każdej studzienki z dziewięciodołkową szklaną płytką punktową i przenieś larwy do studzienek za pomocą długich kleszczy. Umieść jedną larwę w studni stroną grzbietową skierowaną do góry. Chwyć naskórek larwy dwoma kleszczami po 5 kleszczy na środku pnia larwy i delikatnie rozerwij skórki.Odsłonięte ciała tłuszczowe, wraz z innymi wewnętrznymi tkankami larw, będą nadal przyczepione do tuszy larwy. Pociągnij na tyle, aby jak najbardziej odsłonić narządy wewnętrzne. Powtórz ten krok dla wszystkich larw.Przenieść tuszę larwalną do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów 4% PFA i inkubować przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza bez potrząsania probówkami. Po 30 minutach odpipetować roztwór PFA. Dodaj 500 mikrolitrów 1X PBS do probówki.Delikatnie potrząsaj probówką na płaskim rotatorze przez 10 minut, a następnie wyrzuć roztwór 1X PBS. Powtórz to trzy razy. Za pomocą długich kleszczy przenieś utrwaloną i umytą tuszę larwalną do studzienki w dziewięcioma wgłębieniach wypełnionych 1X PBS.Usuń wszystkie beztłuszczowe tkanki ciała za pomocą 5 kleszczy. Na koniec zamontuj kawałki ciała tłuszczowego na szkiełku mikroskopowym, używając 80% glicerolu jako medium montażowego i połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Mutant pierwszy i mutant drugi to dwa niezależne śmiertelne mutanty na chromosomie X, a izozogenizowane żółto-białe muchy FRT 19A służą tutaj jako kontrola.Wzorce GFP-Atg8a analizowano w kontrolnych, zmutowanych lub zmutowanych dwóch mozaikowych ciałach tłuszczowych larw, a zmutowane klony lub klony kontrolne były negatywnie oznaczone przez RFP. W klonach kontrolnych wzorce GFP-Atg8a Puncta były podobne do tych w otaczających komórkach dodatnich RFP. U zmutowanych klonów jeden zmutowany GFP-Atg8a Puncta był znacznie zmniejszony.A u dwóch zmutowanych klonów liczba i rozmiar GFP-Atg8a Puncta zostały zwiększone. Etap rozwoju larw ma tutaj kluczowe znaczenie. Czas rozwoju i czas trwania głodu muszą być modyfikowane zgodnie z recepturami pożywek hodowlanych każdego laboratorium.Ta procedura może być zastosowana do zbadania selektywnej autofagii. Na przykład mitofagię można monitorować w ciałach tłuszczowych much, przyłączając białko fluorescencyjne do sekwencji docelowej mitochondriów.

analyzing-starvation-induced-autophagy-drosophila-melanogaster-larval

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

Obwód żywieniowy u larw Drosophila melanogaster służy prostemu, ale potężnemu modelowi, który pozwala na skorelowanie zmian w tempie karmienia ze zmianami w obwodach nerwowych stomatogastrycznych. Obwód ten składa się z centralnych neuronów serotoninergicznych, które wysyłają projekcje do haczyków ustnych, a także do jelita przedniego.

Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u Drosophila

Opisujemy tutaj test fagocytozy z wykorzystaniem rozproszonych komórek embrionalnych Drosophila. Umożliwia nam łatwe i precyzyjne ilościowe określenie poziomów fagocytozy in vivo oraz identyfikację nowych cząsteczek wymaganych do fagocytozy komórek apoptotycznych.

Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

Przedstawiamy protokół pomiaru zużycia tlenu i pozakomórkowego zakwaszenia w mózgach larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Analizator metaboliczny jest używany z dostosowanym i zoptymalizowanym protokołem. Ograniczenia mikrotkanek są kluczowym elementem tego protokołu i zostały zaprojektowane i stworzone specjalnie do ich wykorzystania w tej analizie.

Analiza metaboliczna larwalnych i dorosłych mózgów Drosophila melanogaster

Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzenia trzech prostych testów degeneracji aksonów (śmierci aksonów) wywołanych urazem u Drosophila melanogaster, aby ocenić morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster

Opisany tutaj jest protokół, który umożliwia kolorymetryczną kwantyfikację ilości jedzenia spożywanego w określonym przedziale czasu przez larwy Drosophila melanogaster wystawione na działanie diety o różnej jakości makroskładników. Testy te są przeprowadzane w kontekście neuronalnego badania termogenetycznego.

Kwantyfikacja spożycia makroskładników odżywczych w termogenetycznym badaniu przesiewowym neuronów przy użyciu larw Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół respirometrii o wysokiej rozdzielczości do analizy bioenergetyki u zmutowanych muszek owocowych PINK1B9-null. W metodzie wykorzystuje się protokół SUIT (Substrate-Uncouplingr-Inhibitor-Titration).

Analiza funkcji mitochondriów u Drosophila melanogaster PINK1B9-Null mutant przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Poznaj metodę indukcji autofagii w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster poprzez pozbawienie aminokwasów. Analiza klonów mutacyjnych z użyciem GFP-Atg8a pozwala badać dynamikę autofagii w odpowiedzi na dostępność składników odżywczych.

Analiza autofagii wywołanej głodem w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów