Name: Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj protokół wywoływania ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy C57BL/6J przy użyciu nowego urządzenia do ekspozycji na hałas i pomiarów ABR. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie mechanizmów uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za granty z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST) rządu Tajwanu (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) oraz granty badawcze z Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).

Eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Mackay Medical College. Ośmiotygodniowe samce myszy C57BL/6J zakupiono w Narodowym Centrum Zwierząt Laboratoryjnych (Nowe Tajpej, Tajwan). Wszystkie myszy zostały wyhodowane i trzymane zgodnie ze standardowym protokołem dla zwierząt.
1. Indukcja NIHL u myszy
<ol>
	<li>Przygotuj klatkę dla myszy doświadczalnych
	<ol>
		<li>W tym celu użyj klatki pułapki na szczury o wymiarach 14 cm × 17 cm × 24 cm. Wytnij cztery kawałki tektury falistej na odpowiednie rozmiary, tak aby zmieściły się w klatce (13 cm × 23 cm i 13 cm × 16 cm).</li>
		<li>Aby zapobiec przecięciu stóp myszy przez siatkę, umieść dwa kawałki odpowiednio na dole i z tyłu. Umieść pozostałe dwa elementy prostopadle do siebie, aby podzielić przestrzeń w klatce na ćwiartki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź to badanie w dźwiękoszczelnym pudełku. Umieść głośnik 8.5 cm przed klatką i umieść zarówno głośnik, jak i klatkę w dźwiękoszczelnym pudełku.</li>
	<li>Otwórz aplikację CLIO</li>
	<li>Przesuń kursor na ikonę głośnika, a następnie kliknij TwoSin. Wprowadź i zmień wartość Freq 1 na 1000 Hz, Freq 2 na 6000 Hz i kliknij OK, aby rozpocząć odtwarzanie dźwięku.</li>
	<li>Na karcie Leq zmień dBV na dBSPL. Po ustawieniu czasu w interfejsie oprogramowania kliknij przycisk zielonego trójkąta, aby odtworzyć dźwięk.</li>
	<li>Umieść mikrofon przed głośnikiem w odległości 8.5 cm, aby skalibrować poziom hałasu (patrz Plik uzupełniający 1). Dostosuj poziom hałasu do 125 dB SPL-A i stale monitoruj przez co najmniej 3 minuty, aby upewnić się, że poziom hałasu jest wystarczająco stabilny. Użyj generatora, analizatora i wzmacniacza, aby tworzyć i kontrolować hałas. (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) 
	UWAGA: Wykonaj ten krok w dźwiękoszczelnym pudełku, aby uniknąć uszkodzenia słuchu operatora.</li>
	<li>Umieść cztery samce myszy C57BL/6J w klatce (po jednej na każdą ćwiartkę) w celu narażenia na hałas. Losowo przypisz myszy w każdej ćwiartce podczas ekspozycji na hałas. Umieść mikrofon na górze klatki, aby monitorować poziom hałasu podczas ekspozycji na hałas (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Wykonaj ten krok w dźwiękoszczelnym pudełku, aby uniknąć uszkodzenia słuchu operatora.</li>
	<li>Wystawiaj myszy na działanie hałasu o częstotliwościach 1 kHz i 6 kHz nieprzerwanie przez 6 godzin dziennie przez 5 kolejnych dni.</li>
	<li>Zmierz progi słyszenia myszy 1 dzień po ekspozycji na hałas (tj. 6 dnia), mierząc ABR. Powtórz te pomiary ABR ponownie 1 tydzień po ekspozycji na hałas (tj. w 13dniu). Po pomiarach ABR poświęć wszystkie zaangażowane myszy i zbierz ich ślimaki (<silna klasa="xfig">Ryc. 3).</li>
</ol>
2. Ocena progu słyszenia na podstawie słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR)
<ol>
	<li>Użyj komercyjnego systemu testowego ABR zaprojektowanego specjalnie dla małych zwierząt10.</li>
	<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć mieszaninę tiletaminy i zolazepamu (40 mg/kg) oraz ksylazyny (9,3 mg/kg) myszom w celu znieczulenia ogólnego. 
	UWAGA: Ocena ABR trwa ~2 godziny. Upewnij się, że zapewniasz wsparcie termiczne za pomocą poduszki grzewczej i nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu, gdy mysz jest pod narkozą.</li>
	<li>Zmierz ABR u myszy w znieczuleniu ogólnym. Umieść podskórne elektrody igłowe (12 mm) w wierzchołku, za małżowiną uszną lewego ucha i z powrotem w pobliżu ogona, aby zmierzyć próg słyszenia.</li>
	<li>Prezentuj bodźce akustyczne za pomocą głośnika umieszczonego w odległości 1 cm od lewego ucha zwierzęcia.</li>
	<li>Użyj oscyloskopu, aby kontrolować bodźce akustyczne. Wybierz Sinus Wave dla bodźców i 10 k dla skali okienkowej. Obróć pokrętło Częstotliwość, aby uzyskać żądaną częstotliwość bodźców akustycznych.</li>
	<li>Dostosuj intensywność bodźca, obracając pokrętło AMLP na generatorze funkcyjnym. Uzyskaj pożądaną intensywność bodźca, przekręcając pokrętło AMLP na odpowiednie napięcie, obliczone na podstawie kalibracji.</li>
	<li>Zbierz pomiary ABR przy serii intensywności bodźca, od 10 dB SPL do 100 dB SPL, z krokiem o rozmiarze 10 dB. 
	UWAGA: Zmierz próg słyszenia w dźwiękoszczelnym pudełku. Za minimalny poziom intensywności bodźca, który mógł spowodować zauważalne V uderzenie fali w zebranym sygnale, przyjęto, że jest to próg ABR10,11 (Rysunek 4). Po ocenie ABR należy monitorować zwierzę do momentu wyzdrowienia ze znieczulenia (~1 h).</li>
</ol>
3. Badanie mikroskopowe
<ol>
	<li>Utrwalanie pobranej tkanki
	<ol>
		<li>Po pomiarach ABR należy złożyć mysz w ofierze, wstrzykując dootrzewnowo mieszaninę tiletaminy i zolazepamu (100 mg/kg) i ksylazyny (23,25 mg/kg) do badania mikroskopowego.</li>
		<li>Pobrać ślimaki od myszy i natychmiast zanurzyć je w 10% formaldehydzie (FA) w celu utrwalenia (dwa ślimaki/ml) na co najmniej 8 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po utrwaleniu roztwór FA zastąpić 10% roztworem kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w celu odwapnienia przez 3-4 dni w temperaturze 4 °C. Następnie sprawdź każdy ślimak pęsetą, aby upewnić się, że ślimaki są wystarczająco zmiękczone.</li>
		<li>Umieść ślimaki na szalce Petriego wypełnionej solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i pokrój spiralny narząd Cortiego (OC) (każdy odwapniony ślimak) na trzy sekcje - skręt podstawowy, skręt środkowy i skręt wierzchołkowy - do barwienia tkanek.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym (powiększenie: 8x-35x) należy usunąć struktury kostne (scala vestibuli, scala tympani, modiolus) odwapnionych ślimaków i uzyskać tkankę miękką, w tym OC (grubość: około 40 μm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne ślimaka
	<ol>
		<li>Przygotowanie buforu blokującego: Przygotować 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,2% roztwory Triton X-100 w PBS.</li>
		<li>Przenieść tkankę do barwienia z płytki Petriego do probówki mikrowirówkowej i zanurzyć tkankę w 0,1 ml buforu blokującego na 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Przygotowanie buforu przeciwciał pierwszorzędowych Myo7A: Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe Myo7A w buforze blokującym w stosunku objętościowym 1:200.</li>
		<li>Traktować tkankę w probówce mikrowirówkowej 100 μl buforu przeciwciał pierwszorzędowych Myo7A przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Opłucz chusteczkę trzy razy w PBS przez 5 minut każdy.</li>
		<li>Przygotowanie buforu przeciwciała drugorzędowego Myo7A (Myo7A-Rb-488) i przeciwciała falloidyny (falloidyny-594): Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe Myo7A (1:400) i przeciwciało falloidyny (1:200) w buforze blokującym.</li>
		<li>Traktować tkankę 100 μl przeciwciała drugorzędowego Myo7A i buforu przeciwciała falloidyny przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po leczeniu przeciwciałem + przeciwciałem falloidyny przepłukać tkankę w PBS trzy razy, po 5 minut.</li>
		<li>Przenieść wypłukaną tkankę z probówki mikrowirówkowej na szalkę Petriego wypełnioną PBS za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia o pojemności 1 ml z naciętą końcówką.</li>
		<li>Aby przygotować się do badania mikroskopowego, rozłóż tkankę, umieść ją na szkiełku podstawowym i dodaj 15 μl pożywki fluoromountowej 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) na tkankę, aby całkowicie ją pokryć. Delikatnie nałóż szklane szkiełko nakrywkowe na chusteczkę. Pozostaw szkiełko na noc w temperaturze pokojowej przed uszczelnieniem go lakierem do paznokci.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu
	<ol>
		<li>Rejestruj obrazy 2D za pomocą pionowego mikroskopu fluorescencyjnego i oprogramowania do akwizycji obrazów.</li>
		<li>Przed wykonaniem badania mikroskopowego należy wyśrodkować tkankę w polu view i dostosować czułość do ISO 100. Najpierw dostosuj czas ekspozycji, klikając przycisk Tryb automatyczny w oprogramowaniu, a następnie dostosuj ręcznie, klikając przycisk Dostosuj, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu.</li>
		<li>Dostosuj długość fali padającego światła, aby wzbudzić fluorofory, obracając kostkę fluorescencyjną. Pseudokolory użyto do oznaczenia emisji z różnych znaczników fluorescencyjnych (światło niebieskie: DAPI; światło zielone: Myo7A; światło czerwone: falloidyna).</li>
		<li>Skanując próbkę tkanki, wygeneruj i zgromadź dane obrazowania w postaci plików obrazów .tif i .jpg.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481">https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481</a> (2021).</li>
<li>Fernandez, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+synaptopathy+with+and+without+sensory+cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss.</a> Neuroscience. 427, 43-57 (2020).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+X-linked+inhibitor+of+apoptosis+protein+protects+against+noise-induced+hearing+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice.</a> Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).</li>
<li>Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+noise+exposure+on+auditory+brainstem+responses+and+number+of+presynaptic+ribbons+in+inner+hair+cells+of+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li>
<li>Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+stress+response+inhibition+provides+sex-dependent+protection+against+noise-induced+cochlear+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).</li>
<li>Amanipour, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+mice%3A+Effects+of+high+and+low+levels+of+noise+trauma+in+CBA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).</li>
<li>Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+duffy+antigen+receptor+for+chemokines+ameliorated+cochlear+damage+from+noise+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).</li>
<li>Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+hearing%3A+a+summary+of+recent+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oto-laryngologica%22%5BJournal%5D)">Estrogen and hearing: a summary of recent investigations.</a> Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).</li>
<li>Tsai, S. C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intravenous+administration+of+skin-derived+mesenchymal+stem+cells+ameliorates+hearing+loss+and+preserves+cochlear+hair+cells+in+cisplatin-injected+mice%3A+SMSCs+ameliorate+hearing+loss+and+preserve+outer+hair+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice.</a> Hearing Research. 413, 108254(2022).</li>
<li>Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+restoration+in+a+deaf+animal+model+with+intravenous+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).</li>
<li>Yu, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+evaluation+of+ribbon+synapses+at+specific+frequency+regions+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).</li>
</ol>

Brak konfliktu interesów do ujawnienia.

NIHL można podzielić na dwa rodzaje: NIHL tymczasowy, który pokazuje czasowe przesunięcie progu słyszenia, oraz NIHL stały, który charakteryzuje się trwałym przesunięciem progu słyszenia. Uważa się, że ubytek słuchu, który zaobserwowaliśmy6 dnia ( 1 dzień po ekspozycji na hałas) jest kombinacją tych dwóch typów. W takim przypadku próg słyszenia wykazywałby stopniową poprawę w czasie ze względu na czasowy składnik ubytku słuchu. W naszych wstępnych badaniach eksperymentalnych, wyniki uzyskane przy użyciu tej sa...

Około 1,3 miliarda ludzi na całym świecie cierpi na utratę słuchu z powodu ekspozycji na hałas1. W tym badaniu naszym celem było ustanowienie jasnego procesu krok po kroku w celu wywołania i potwierdzenia ubytku słuchu wywołanego hałasem (NIHL). NIHL wynika ze zwyrodnienia/zniszczenia komórek rzęsatych (HC) i neuronów zwojowych spiralnych (SGN), uszkodzenia stereocilii HC i/lub utraty synaps między wewnętrznymi HC ślimaka i SGN. Takie nieprawidłowości mogą również powodować szumy uszne i upośledzenie percepcji mowy (zwłaszcza w złożonym środowisku akustycznym) oprócz NIHL. Te braki fizjologiczne mogą kolejno wpływać na funkcje społeczne, psychologiczne i poznawcze2,3,4,5,6.
W badaniach przedklinicznych związanych z NIHL na myszach, najpopularniejszymi szczepami myszy są CBA/CaJ2,3,6,7 i C57BL/64,5,8. Myszy męskie3,4,7 myszy są częściej używane niż samice, ponieważ estrogen ma działanie ochronne na słuch. Dlatego w tym badaniu użyliśmy tylko samców myszy9. Po zapoznaniu się z literaturą wybraliśmy 1 kHz i 6 kHz jako częstotliwości zastosowanego szumu. Natężenie zastosowanego hałasu wynosiło od 115 dB SPL-A (wokół klatki) do 125 dB SPL-A (w środku klatki). Po wystawieniu myszy eksperymentalnych na hałas w sposób ciągły przez 6 godzin dziennie, przez 5 kolejnych dni, optymalny wzrost progu słyszenia wskazywał, że optymalny zakres NIHL został wygenerowany u myszy eksperymentalnych. Czynności związane z obchodzeniem się ze zwierzętami, budowaniem układu doświadczalnego i wywoływaniem hałasu są jasno opisane krok po kroku w dostarczonym protokole.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Standardowy zestaw mikrofonowy 1/4" CCP w swobodnym polu</td><td>GRAS</td><td>428158</td><td>Do ekspozycji na hałas</td></tr><tr><td>Moduł wejściowy wzmacniacza, AMI100D</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Do słuchowej odpowiedzi pnia mózgu</td></tr><tr><td>Bio-wzmacniacz, BIO100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Do słuchowej odpowiedzi pnia mózgu</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>SIGMA</td><td>A9647</td><td>Barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td> <td>CellsensOlympus life science</td><td></td><td>Akwizycja obrazu</td></tr><tr><td>Tektura</td><td></td><td></td><td></td>falista</tr><tr><td>DAPI fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td>Barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>SIGMA</td><td>E5134</td><td>Wzmacniacz odpowiedzi odwapniającej</td></tr><tr><td>wywołanej, ERS100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Do słuchowej odpowiedzi</td></tr> <tr><td>pnia mózguFormaldehyd</td><td>APLHA</td><td>F030410</td><td>Utrwalanie ślimaka</td></tr><tr><td>Wysokowydajny system gromadzenia danych, MP160</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Do słuchowej odpowiedzi pnia mózgu</td></tr><tr><td>Modułowy przedłużacz, MEC110C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Do słuchowej odpowiedzi pnia mózgu</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne Myo7A</td><td>Proteus</td><td>25-6790</td><td>Barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne Myo7A</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>Elektroda igłowa do barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>, Unipolarna 12 mmTp, EL452</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Do słuchowej odpowiedzi pnia mózgu</td></tr><tr><td>przeciwciało falloidynowe</td><td>Alexa Fluor</td><td>A12381</td><td>Barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>SIGMA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Klatka</td><td></td><td></td> pułapka na szczury <td>14 cm x 17 cm x 24cm</td></tr><tr><td>ROMPUN- ksylazyna do wstrzykiwań, roztwór&nbsp;</td><td>Bayer HealthCare, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz dźwięku, MT-1000</td><td>unika</td><td></td><td>Do ekspozycji na hałas</td></tr><tr><td>Generator/analizator dźwięku/różne, FW-02</td><td>CLIO</td><td>620300719</td><td>Do ekspozycji na hałas</td></tr><tr><td>Komora dźwiękoszczelna</td><td>IEA Technologia</td><td></td> elektroakustyczna <td>Do ekspozycji na hałas i głośnik ABR</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Technologia <td></td><td>elektroakustyczna IEA</td><td>Do modułu</td></tr><tr><td>stymulatora</td> ekspozycji na hałas, <td>STM100C BIOPAC</td><td></td><td>Do słuchowej odpowiedzi pnia mózgu</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td> Zestaw tubofonów do <td>barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>, OUT101</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Do słuchowej odpowiedzi pnia mózgu</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy, BX53</td><td>Olympus</td><td></td><td>Akwizycja obrazu</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych

Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage

Zwierzęcy model utraty słuchu wywołanej hałasem (NIHL) jest przydatny dla patologów, terapeutów, farmakologów i badaczy słuchu, aby dokładnie zrozumieć mechanizm NIHL, a następnie zoptymalizować odpowiednie strategie leczenia. Badanie to ma na celu stworzenie ulepszonego protokołu rozwoju mysiego modelu NIHL. W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J. Nieznieczulone myszy były narażone na głośne dźwięki (1 i 6 kHz, prezentowane jednocześnie przy 115-125 dB SPL-A) nieprzerwanie przez 6 godzin dziennie przez 5 kolejnych dni. Funkcje słuchowe oceniano 1 dzień i 1 tydzień po ekspozycji na hałas, za pomocą słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR). Po pomiarze ABR myszy zostały złożone w ofierze, a ich narządy Cortiego zostały pobrane do barwienia immunofluorescencyjnego. Z pomiarów słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR) zaobserwowano znaczny ubytek słuchu 1 dzień po ekspozycji na hałas. Po 1 tygodniu progi słyszenia myszy eksperymentalnych spadły do ~80 dB SPL, co nadal było znacznie wyższym poziomem niż u myszy kontrolnych (~40 dB SPL). Wyniki obrazowania immunofluorescencyjnego wykazały, że zewnętrzne komórki rzęsate (OHC) są uszkodzone. Podsumowując, stworzyliśmy model NIHL przy użyciu samców myszy C57BL/6J. Opracowano i zastosowano nowe i proste urządzenie do generowania i dostarczania szumu o czystym tonie. Ilościowe pomiary progów słyszenia i morfologiczne potwierdzenie uszkodzenia OHC wykazały, że zastosowany hałas skutecznie wywołał oczekiwany ubytek słuchu.

Zmiana progu słyszenia w badaniu ABR 
Próg słyszenia u myszy mierzono za pomocą ABR z użyciem impulsów tonalnych (tone-burst) albo 1 dzień, albo 1 tydzień po ekspozycji na hałas. 1 dzień po ekspozycji na hałas (tj. w 6tym dniu) zaobserwowano istotny wzrost progu słyszenia dla wszystkich trzech badanych częstotliwości (12 kHz: 84,29 ± 2,77 dB SPL; 24 kHz: 91,43 ± 0,92 dB SPL; 32 kHz: 98,57 ± 1,43 dB SPL). Częściowa regeneracja słuchu nastąpiła 1 tydzień po ekspozycji na hałas (tj. w 13t...

Tutaj prezentujemy protokół dla mysiego modelu ubytku słuchu wywołanego hałasem (NIHL). Aby wywołać NIHL, opracowaliśmy nowe i proste urządzenie wykorzystujące tekturę falistą, klatkę pułapkę na szczury i głośnik. Odpowiedź słuchowa pnia mózgu i obrazowanie immunofluorescencyjne zostały wykorzystane do oceny odpowiednio funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych.

Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych

An animal model of noise-induced hearing loss (NIHL) is useful for pathologists, therapists, pharmacologists, and hearing researchers to thoroughly ...

Chociaż przeprowadzono badania nad ubytkiem słuchu spowodowanym hałasem, żadne z nich nie opisało tej metody tak szczegółowo, co czyni ją ważną procedurą. Metoda ta skutecznie spowodowała ubytek słuchu wywołany hałasem u myszy i obserwuje rzeczywiste zmiany progu słyszenia za pomocą ABR. Zwierzęcy model ubytku słuchu wywołanego hałasem jest przydatny dla naukowców, którzy chcą dokładnie zrozumieć mechanizm ubytku słuchu wywołanego hałasem, a następnie zoptymalizować odpowiednie strategie leczenia.Procedurę zademonstruje Dian-Shiue Lee, bardzo utalentowana studentka z mojego laboratorium. Aby przygotować klatkę dla myszy doświadczalnych, użyj klatki pułapki na szczury i pokrój cztery kawałki tektury falistej na odpowiednie rozmiary, tak aby pasowały do klatki. Aby zapobiec przecięciu stóp myszy przez siatkę, umieść dwa kawałki odpowiednio na dole i z tyłu.Umieść pozostałe dwa elementy prostopadle do siebie, aby podzielić przestrzeń w klatce na ćwiartki Otwórz oprogramowanie aplikacyjne CLIO. Przesuń kursor na ikonę głośnika i kliknij TwoSin. Wprowadź i zmień wartość Częstotliwość od 1 do 1 000 herców, Częstotliwość od 2 do 6 000 herców, a następnie kliknij przycisk OK, aby rozpocząć odtwarzanie dźwięku.Na karcie Leq zmień dBV na dBSPL. Po ustawieniu czasu w interfejsie oprogramowania kliknij przycisk zielonego trójkąta, aby odtworzyć dźwięk. Umieść mikrofon przed głośnikiem w odległości 8.5 centymetra, aby skalibrować poziom hałasu.Dostosuj poziom hałasu do 125 decybeli SPL-A i stale monitoruj przez co najmniej trzy minuty, aby upewnić się, że poziom hałasu jest wystarczająco ustabilizowany. Użyj generatora, analizatora i wzmacniacza, aby tworzyć i kontrolować hałas. Umieść cztery samce czarnych myszy C57 6J w klatce, po jednej na każdą ćwiartkę, w celu narażenia na hałas.Losowo przypisz myszy do każdej ćwiartki podczas ekspozycji na hałas. Umieść mikrofon na górze klatki, aby monitorować poziom hałasu podczas ekspozycji na hałas. Umieść klatkę przed głośnikiem w dźwiękoszczelnym pudełku, upewniając się, że głośnik znajduje się w odległości 8.5 centymetra od klatki.Wystaw myszy na hałas o częstotliwościach od jednego kiloherca do sześciu kiloherców nieprzerwanie przez sześć godzin dziennie przez pięć kolejnych dni. Zmierz progi słyszenia myszy w 6 i 13 dniu, mierząc ABR. Użyj komercyjnego systemu testowego ABR, zaprojektowanego specjalnie dla małych zwierząt do pomiarów ABR, i utrzymuj zwierzę w znieczuleniu ogólnym.Umieść 12-milimetrowe podskórne elektrody igłowe w wierzchołku za małżowiną uszną lewego ucha i z powrotem w pobliżu ogona, aby zmierzyć próg słyszenia. Po ustawieniu głośnika w odległości jednego centymetra od lewego ucha zwierzęcia, prezentuj bodźce akustyczne za pomocą głośnika. Wybierz Sinus Wave dla bodźców i 10 k dla skali okienka.Obróć pokrętło częstotliwości, aby uzyskać żądaną częstotliwość bodźców akustycznych. Dostosuj intensywność bodźca, obracając pokrętło AMLP na generatorze funkcyjnym. Uzyskaj pożądaną intensywność bodźca, przekręcając pokrętło AMLP na odpowiednie napięcie obliczone na podstawie kalibracji.Zbierz pomiary ABR w serii intensywności bodźca od 10 do 100 decybeli SPL, z krokiem o wielkości 10 decybeli. Oznacz minimalny poziom intensywności bodźca, który może spowodować zauważalną falę V, jako próg ABR. Poświęć myszy po pomiarach ABR i zbierz ślimaki od myszy poddanych eutanazji.Natychmiast po pobraniu tkanek zanurz je w 10% formaldehydzie w celu utrwalenia i pozwól im odpoczywać przez co najmniej osiem godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj EDTA do odwapnienia, zgodnie z opisem w tekście. Umieść ślimaki na szalce Petriego wypełnionej PBS.W celu barwienia tkanek przetnij spiralny narząd Cortiego lub OC na trzy sekcje: skręt podstawowy, skręt środkowy i zwój wierzchołkowy. Pod mikroskopem preparacyjnym przy powiększeniu od 8x do 35x usuń struktury kostne, w tym scala vestibuli, scala tympani, i modiolus odwapnionego ślimaka, i uzyskaj tkanki miękkie, w tym OC. Znaczny wzrost progu słyszenia zaobserwowano przy 12 kilohercach, 24 kilohercach i 32 kilohercach dzień po ekspozycji na hałas. Częściowa utrata słuchu nastąpiła tydzień po ekspozycji na hałas, ale progi słyszenia były nadal podwyższone o ponad 30 decybeli przy wszystkich częstotliwościach w porównaniu z grupami kontrolnymi.W tym badaniu słuch był bardziej uszkodzony przy wysokich częstotliwościach. Zaobserwowano istotną różnicę w progu słyszenia między grupą kontrolną a grupą eksperymentalną zarówno w 6., jak i 13. dniu, przy 12 kilohercach i 32 kilohercach. Utrata zewnętrznych komórek rzęsatych była konsekwentnie obserwowana w obrazach mikroskopowych uzyskanych od myszy NIHL, w porównaniu z tymi od myszy kontrolnych.Podczas gdy wewnętrzne komórki rzęsate pozostały nienaruszone na wszystkich obrazach, zewnętrzne komórki rzęsate w podstawie i środkowym zwoju OC były poważnie uszkodzone. W przeciwieństwie do tego, zewnętrzne komórki rzęsate w zwoju wierzchołkowym były prawie nienaruszone. Najważniejszym krokiem w tym protokole jest narażenie na hałas, pomiar ABI, pobranie ślimaka.Procedura ta może być stosowana do badania wpływu narażenia na hałas o różnych częstotliwościach na ubytek słuchu przy użyciu różnych rodzajów dźwięku.

modified-experimental-conditions-for-noise-induced-hearing-loss-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano szybką i niedrogą metodę behawioralnego wyznaczania parametrów słuchowych, takich jak progi słyszalności, zaburzenia słuchu czy percepcje fantomowe (subiektywny szum uszny). Metoda ta wykorzystuje hamowanie wstępne (pre-pulse inhibition) reakcji przestrachu akustycznego i może być łatwo zaimplementowana w komputerze osobistym przy użyciu programowalnego przetwornika AD/DA oraz czujnika piezoelektrycznego.

Tani układ do behawioralnej audiometrii u gryzoni

Ten film demonstruje metodę oceny synaps wstęgowych w określonych regionach ślimaka myszy. Wykorzystuje techniki barwienia immunologicznego i obrazowania konfokalnego w celu identyfikacji funkcjonalnych synaps w różnych regionach częstotliwości w każdym skręcie ślimaka.

Ocena synaps wstęgowych w określonych obszarach częstotliwości ślimaka myszy

Źródło: Lee, D. et. al., Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych. J. Vis. Exp. (2023)Ten film przedstawia procedurę ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy. Głośne dźwięki uszkadzają komórki rzęsate w uchu wewnętrznym i zaburzają drogi słuchowe, powodując upośledzenie słuchu.

Wywoływanie ubytku słuchu u myszy poprzez długotrwałą ekspozycję na dźwięk o dużej głośności 

Źródło: Lee, D., et. al. Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje pomiar słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR) u myszy. Elektrody umieszcza się na głowie, za uchem i w pobliżu ogona znieczulonej myszy. Dostarczane są bodźce akustyczne o różnym natężeniu, a generowane sygnały elektryczne są rejestrowane jako przebiegi.

Pomiar słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u myszy

Opisane podejście chirurgiczne po usznym pozwala na szybkie i bezpośrednie dostarczenie do błony bębenkowej ślimaka myszy, jednocześnie minimalizując utratę krwi i śmiertelność zwierząt. Metoda ta może być stosowana w terapii ślimakowej z wykorzystaniem podawania molekularnego, farmakologicznego i wirusowego myszom po urodzeniu przez błonę okienną okrągłą.

Metoda chirurgiczna dostarczania genów za pośrednictwem wirusa do ucha wewnętrznego myszy przez błonę okrągłego okienka

Istnieją różne metody wprowadzania czynników ototoksycznych do ślimaków modeli zwierzęcych. Przedstawiono protokół chirurgiczny dostarczania środków ototoksycznych do wnęki okrągłego okna. Procedura jest niezawodna, tworzy ukierunkowane zmiany wewnątrzślimakowe i pozwala uniknąć mechanicznych uszkodzeń mikroarchitektury. Możliwe jest badanie samonaprawy/regeneracji ślimaka.

Mysie podejście oparte na okrągłym oknie do dostarczania czynników ototoksycznych: szybka i niezawodna technika indukowania zwyrodnienia komórek ślimakowych

Opisano tutaj i porównano dwa podejścia mikrochirurgiczne do miejscowego dostarczania leków do ucha wewnętrznego pod względem wpływu na parametry słuchu, cytoarchitekturę ślimaka i ekspresję markerów stanu zapalnego.

Badanie porównawcze metod dostarczania leków ukierunkowanych do ucha wewnętrznego myszy: pęcherzyk a wstrzyknięcie przezbębenkowe

Zwierzęce modele implantów ślimakowych mogą poszerzyć wiedzę na temat technologicznych podstaw leczenia trwałego odbiorczego ubytku słuchu za pomocą stymulacji elektrycznej. W badaniu przedstawiono protokół chirurgiczny ogłuszenia i implantacji ślimakowej zestawu elektrod u myszy, a także ocenę funkcjonalną z odpowiedzią słuchową pnia mózgu.

Operacja wszczepienia implantu ślimakowego i elektrycznie wywołane nagrania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u myszy C57BL/6

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Audiometria odpowiedzi wywołanej pniem mózgu jest ważnym narzędziem w neurofizjologii klinicznej. Obecnie audiometria odpowiedzi wywołanej pnia mózgu jest również stosowana w naukach podstawowych i badaniach przedklinicznych obejmujących zarówno farmakologiczne, jak i genetyczne modele zwierzęce. Tutaj przedstawiamy szczegółowy opis, w jaki sposób słuchowe reakcje pnia mózgu mogą być z powodzeniem rejestrowane i analizowane u myszy.

Akwizycja i analiza danych w audiometrii odpowiedzi wywołanej pniem mózgu u myszy

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Poznaj protokół wywoływania ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy C57BL/6J przy użyciu nowego urządzenia do ekspozycji na hałas i pomiarów ABR. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie mechanizmów uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych.

Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych (Wideo) | JoVE Journal

Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych

Przeglądaj więcej filmów