Name: Przygotowanie zawiesiny komórek innych niż kardiomiocyty do sekwencjonowania jednokomórkowego RNA z serca dorosłej myszy po zawale mięśnia sercowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Poznaj metodę izolacji żywych niekardiomiocytów z serca myszy po zawale mięśnia sercowego do sekwencjonowania jednokomórkowego RNA. Protokół zapewnia wysoką żywotność komórek przy niskich kosztach i umożliwia badanie heterogeniczności komórek serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundusze Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (LQ22H020010).

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych na Uniwersytecie Zhejiang i zostały zatwierdzone przez Komitet Doradczy ds. Zwierząt na Uniwersytecie Zhejiang.
1. Operacja podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (podwiązanie LAD)
UWAGA: Ośmiotygodniowe samce myszy C57BL/6J zostały użyte jako modele. Serca pobrano 2 tygodnie po zaw. Operację podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem i demonstracją11.
<ol>
	<li>Przed zabiegiem należy zdezynfekować narzędzia chirurgiczne 70% etanolem.</li>
	<li>Zważ mysz, a następnie znieczul mysz wstrzyknięciami dootrzewnowymi 1% pentobarbitalu sodu (50 mg/kg). Obserwuj odruch szczypania palców u nóg i zmierz częstość oddechów, aby ocenić głębokość znieczulenia podczas zabiegu.</li>
	<li>Umieść mysz na stole operacyjnym z poduszką grzewczą o temperaturze 37 °C. Używaj maści okulistycznej, aby zapobiec odwodnieniu oczu.</li>
	<li>Spryskaj lewą klatkę piersiową i szyję przedsercową kremem do depilacji, a do usunięcia włosów użyj bawełnianych wacików. Zdezynfekuj skórę jodoforem, a następnie 70% alkoholem, aby trzykrotnie oczyścić obszar.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie szyjki macicy w linii środkowej (0,8-1,0 cm) pod mikroskopem. Oddziel skórę, mięśnie i tkanki otaczające tchawicę, a następnie włóż kaniulę 20 G do tchawicy. 
	UWAGA: Podczas wkładania kaniuli do tchawicy pod mikroskopem obserwuj, czy rurka nie jest wprowadzona do przełyku.</li>
	<li>Podłącz mysz do respiratora dla gryzoni ustawionego na 0.2 ml objętości oddechowej z prędkością 150 uderzeń na minutę.</li>
	<li>Naciąć klatkę piersiową myszy ukośnie wzdłuż linii środkowej obojczyka sterylnymi nożyczkami. Wypreparuj tkankę podskórną, aby odsłonić żebra.</li>
	<li>Sterylnymi nożyczkami przeciąć skórę ukośnie wzdłuż lewej linii środkowej obojczyka (0,8-1,0 cm). Wykonaj torakotomię lewą, aby oddzielić trzecie i czwarte żebro, aby odsłonić serce. Użyj zwijacza żeber, aby uzyskać dobrą widoczność.</li>
	<li>Otwórz osierdzie zakrzywionymi kleszczami, a następnie podwiąż lewą przednią tętnicę zstępującą (poniżej wyrostka lewego przedsionka) za pomocą jedwabnego szwu 7-0. Blada przednia ściana lewej komory wskazuje, że perfuzja mięśnia sercowego została pomyślnie przerwana.</li>
	<li>Zwolnij retraktor żeber i zszyj nacięcie klatki piersiowej warstwami za pomocą jedwabnego szwu 5-0, jednocześnie usuwając powietrze z klatki piersiowej. Zszyj nacięcie szyi jedwabnym szwem 5-0.</li>
	<li>Wyjmij rurkę dotchawiczą z myszy po przywróceniu jej spontanicznego oddychania. Dootrzewnowo wstrzyknąć 0,5 ml wstępnie podgrzanej sterylnej soli fizjologicznej. Buprenorfinę (0,1 mg/kg) należy wstrzykiwać podskórnie co 12 godzin, aby zminimalizować ból.</li>
	<li>Na koniec umieść mysz na poduszce grzewczej, aby poczekać na reanimację. Monitoruj mysz, aby upewnić się, że nie cierpi na nadmierną duszność lub krwotok poprzez obserwację wzrokową.</li>
	<li>Przywróć mysz do klatki po przebudzeniu. Przez pierwszy tydzień codziennie monitoruj mysz, aby sprawdzić, czy jej mobilność, pielęgnacja i nawyki żywieniowe są odpowiednie. Zgodnie z potrzebami eksperymentu, zbierz serce w różnych punktach czasowych po MI. 
	UWAGA: W tym protokole zawiesinę jednokomórkową przygotowano z sercem 2 tygodnie po zawale mięśnia sercowego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej serca
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów i pożywek
	<ol>
		<li>Bufor dysocjacji tkanek serca: Wymieszaj 10 mg kolagenazy IV (600 U/ml), 5 mg dyspazy II (0,5 U/ml) i 50 μl DNazy I (100 μg/ml) w 5 ml RPMI 1640. Przed użyciem podgrzej to podłoże do 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Bufor do przemywania komórek: Przygotować 1% BSA lub 10% FBS w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS, PH 7,4) i przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie.</li>
		<li>Roztwór perfuzyjny: Wstępnie schłodzony PBS (PH 7,4) jako roztwór perfuzyjny.</li>
		<li>Bufor do lizy krwinek czerwonych (RBC): Użyj buforu do lizy krwinek czerwonych zgodnie z zaleceniami producenta. 
		UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby zapoznać się z listą odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (150 mg/kg).</li>
	<li>Rozwarstwienie serca
	<ol>
		<li>Umieść mysz w pozycji leżącej, mocując jej tylne kończyny za pomocą taśmy klejącej.</li>
		<li>Spryskaj ciało 70% etanolem, a następnie przetnij pionowo skórę brzucha i mięśnie, unikając przebijania wątroby. Ostrożnie otwórz klatkę piersiową, unikając przebicia serca.</li>
		<li>Użyj wstępnie schłodzonego PBS (PH 7,4) do perfuzji lewej komory, aż do zaobserwowania bezbarwnego płynu perfuzyjnego (potrzebne jest około 15 ml PBS [pH 7,4]).</li>
		<li>Delikatnie unieś serce z klatki piersiowej za pomocą kleszczy i odetnij nadmiar tkanki przyczepionej na zewnątrz serca nożyczkami okulistycznymi. Umieść serce w 1 ml wstępnie schłodzonego PBS (PH 7,4) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjacja enzymatyczna tkanki serca
	<ol>
		<li>Przenieś serce myszy do jednego dołka na 24-dołkowej płytce ze 150 μl buforu dysocjacji tkanki sercowej umieszczonego na lodzie i pokrój je na małe kawałki (~1 mm) nożyczkami.</li>
		<li>Przenieść zmieloną tkankę serca do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml z 5 ml buforu dysocjacji tkanek. 
		UWAGA: Zalecana objętość bufora dysocjacji tkanek serca wynosi 5 ml / serce.</li>
		<li>Umieścić probówkę wirówkową w elektrycznie termostatyzowanej wytrząsarce posuwisto-zwrotnej z prędkością 125 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Pipetować zawiesinę tkankową w górę i w dół 10 razy co 20 minut.</li>
		<li>Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 70 μm, aby usunąć niestrawioną tkankę i grudki. Dodać 25 ml buforu do płukania komórek, aby przepłukać oryginalną probówkę, a następnie przenieść ją w celu przepłukania sitka komórkowego. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm, aby jeszcze bardziej usunąć grudki komórek.</li>
		<li>Przefiltrowaną zawiesinę komórkową odwirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić próbkę komórkową w 1 buforze do lizy RBC na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Dodać czterokrotnie większą objętość buforu do przemywania komórek i odwirowywać przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforu do przemywania komórek. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do przemywania komórek.</li>
		<li>Zmieszać 18 μl zawiesiny komórek z 2 μl roztworu barwiącego oranżek akrydyny (AO)/jodku propidyny (PI) (9:1) i dodać 10 μl mieszaniny do szkiełka w komorze liczącej. Oceń liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incident+heart+failure+in+patients+with+coronary+artery+disease+undergoing+percutaneous+coronary+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727(2021).</li>
<li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+in+myocardial+injury%2C+repair%2C+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling.</a> Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).</li>
<li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+revisited%3A+Inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).</li>
<li>Tzahor, E., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coalition+to+heal-the+impact+of+the+cardiac+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment.</a> Science. 377 (6610), 4443(2022).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Massaia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gene+expression+to+understand+the+dynamic+architecture+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167(2018).</li>
<li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+the+temporal+diversity+and+dynamics+of+cardiac+immunity+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction.</a> Small Methods. 6 (3), 2100752(2022).</li>
<li>Tombor, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+endothelial+plasticity+with+transient+mesenchymal+activation+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 12 (1), 681(2021).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2581(2011).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).</li>
<li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+the+healthy+and+diseased+heart+reveals+cytoskeleton-associated+protein+4+as+a+new+modulator+of+fibroblasts+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li>
<li>Garcia-Flores, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from the human placenta.</a> Nature Protocols. , (2022).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li>
<li>Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+dissect+the+immunological+network+of+autoimmune+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis.</a> Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14, 935-936 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Artykuł ten miał na celu opisanie protokołu izolacji pojedynczych niekardiomiocytów z serc myszy po zawale mięśnia sercowego. Protokół może być stosowany do izolowania różnych typów komórek w mikrośrodowisku post-MI z wysoką jakością, w tym komórek odpornościowych, komórek śródbłonka i fibroblastów. Trzy podstawowe czynniki mają kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości zawiesiny komórek do sekwencjonowania pojedynczych komórek. Pierwszym z nich jest ustawienie trawienia enzymatycznego. Ważne jest, aby kontrolowa...

Zawał mięśnia sercowego (MI) jest jedną z najczęstszych chorób sercowo-naczyniowych, a jego śmiertelność wzrasta na całym świecie1. Wskaźnik zawału mięśnia sercowego jest spowodowany niedostatecznym dopływem krwi do otaczającego mięśnia sercowego, co może być wynikiem zablokowania tętnicy wieńcowej, które występuje z pęknięciem blaszki miażdżycowej. Chociaż przezskórna interwencja wieńcowa (PCI) zmniejszyła śmiertelność pacjentów z ostrym zawałem serca, wysoka częstość występowania niewydolności serca po zawale serca pozostaje problemem2. Kluczową patofizjologią leżącą u podstaw niewydolności serca po zawale mięśnia sercowego jest kompensacyjna reakcja organizmu na urazy serca, która polega na zastąpieniu martwego mięśnia sercowego niekurczliwymi bliznami zwłóknieniowymi. Te reakcje adaptacyjne w znacznym stopniu opierają się na miejscowym zapaleniu, w którym pośredniczą interakcje między wieloma typami komórek a komórkami tkanki serca, a to zapalenie jest obecnie uważane za potencjalny cel terapeutyczny w celu zmniejszenia powstawania blizn zwłóknieniowych, a tym samym ochrony przed niewydolnością serca po zawale mięśnia sercowego3,4. Co ciekawe, mikrośrodowisko w miejscu zawału doświadcza zależnej od czasu przemiany w typach i funkcjach komórek naciekających na różnych etapach MI1,5. Wiele badań wykazało, że niekardiomiocyty (np. komórki odpornościowe, fibroblasty i komórki śródbłonka) odgrywają kluczową rolę w zapaleniu po zawale serca i naprawie tkanek5,6. W ostatnich latach sekwencjonowanie pojedynczych komórek było szeroko stosowane jako potężne narzędzie do wyjaśniania zaangażowania i funkcji niekardiomiocytów w mikrośrodowisku po zawale mięśnia sercowego7,8. Dostarcza to wglądu w patofizjologię urazów i naprawy po zawale mięśnia sercowego oraz rozwój potencjalnych terapii przeciwko niewydolności serca po zawale mięśnia sercowego.
Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) to technika używana do szczegółowego badania całych transkryptomów za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS)7,8,9. Ostatnio rozwój scRNA-Seq zrewolucjonizował dziedzinę badań biomedycznych. W porównaniu z konwencjonalnym sekwencjonowaniem masowym, scRNA-Seq analizuje profile ekspresji genów i niejednorodność transkrypcji na poziomie pojedynczej komórki7,8. Technika ta znacząco promuje badania nad patofizjologią komórkową klasy MI<sup="xref">9,10 poprzez identyfikację różnych typów komórek krążących w mikrośrodowisku po zawale mięśnia sercowego i odkrycie interakcji między kardiomiocytami a niekardiomiocytami. Odkrycia te przyczyniają się do odkrycia nowych celów terapeutycznych dla pacjentów po zawale serca (MI WIDE). Ogólnie rzecz biorąc, eksperyment post-MI oparty na scRNA-seq obejmuje trzy główne sekcje: (1) ustanowienie modelu zwierzęcego po zawale mięśnia sercowego; 2) przygotowanie zawiesiny komórek; oraz (3) sekwencjonowanie próbek i analiza danych. Warto zauważyć, że przygotowanie zawiesiny komórkowej jest najbardziej krytycznym krokiem w przygotowaniu eksperymentu scRNA-Seq, ponieważ jakość zawiesiny komórkowej decyduje o dokładności wyników.
Ten protokół ma na celu ekstrakcję zawiesiny komórek niekardiomiocytów z tkanki serca po zawale mięśnia sercowego; co istotne, szczegółowe informacje na temat utrzymania żywotności i rozdzielczości komórek są zawarte. Tymczasem sprzęt używany w tym protokole, taki jak zestawy chirurgiczne dla myszy, respiratory dla gryzoni i wirówki, można znaleźć w większości ośrodków doświadczalnych na zwierzętach i laboratoriów biomedycznych, a zatem koszt eksperymentu tego protokołu jest stosunkowo niski. Ponadto, jeśli weźmie się pod uwagę punkty czasowe i miejsca zawału jako zmienne, protokół ten może być stosowany do symulacji szerokiego zakresu scenariuszy klinicznych, zwłaszcza w przypadku powikłań po zawale mięśnia sercowego.

<table><tbody><tr><td>Barwnik z pomarańczy akrydynowej / jodku propidyny</td><td>Logos biosystems</td><td>F23001</td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowany&nbsp; Komórka&nbsp; Licznik</td><td>Logos biosystems</td><td>L20001</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Servicebio</td><td>G5001</td><td>Działanie cytoprotekcyjne</td></tr><tr><td>Szkiełka do liczenia komórek</td><td>Logos biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td>Enzymy trawienne</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td>Enzymy trawienne</td></tr><tr><td>Dnaza I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>Zapobiegaj zlepianiu się komórek</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; 40&mu; m Sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Usuń grudki komórek</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; 70&mu; m Sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Usuń niestrawioną tkankę i grudki</td></tr><tr><td>Sortownik komórek przepływowych</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>OU QING SI</td><td></td><td></td></tr> 10054963976859 <tr><td>Uchwyt na igły</td><td>FST</td><td>12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do okulistyki</td><td>RWD</td><td>F14012-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki okulistyczne</td><td>RWD</td><td>S11036-08</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC</td><td>Beyotime</td><td>C3702-120ml</td><td>Usuń czerwone krwinki</td></tr><tr><td>Zwijacz żeber</td><td>FST</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Respirator dla gryzoni</td><td>Harvard</td><td>730043</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Solvent&nbsp; roztwór enzymu</td></tr><tr><td>Sterylne nożyczki</td><td>RWD</td><td>S14014-10</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie zawiesiny komórek innych niż kardiomiocyty do sekwencjonowania jednokomórkowego rna z serca dorosłej myszy po zawale mięśnia sercowego

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Zawał mięśnia sercowego (MI) jest jedną z najczęstszych chorób sercowo-naczyniowych, z rosnącą śmiertelnością na całym świecie. Niekardiomiocyty stanowią ponad połowę całkowitej populacji komórek serca i przyczyniają się do adaptacyjnej kompensacji uszkodzenia mięśnia sercowego, w tym reakcji zapalnych, naprawy tkanek i tworzenia blizn. Aby zbadać mikrośrodowisko serca po zawale mięśnia sercowego, sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) jest szeroko stosowane do identyfikacji różnych typów komórek serca i komunikacji międzykomórkowej. Wśród procedur przygotowania próbki sekwencyjnej scRNA, przygotowanie zawiesiny komórki jest jednym z najbardziej krytycznych etapów, ponieważ żywotność komórki może wpływać na jakość wyników sekwencjonowania scRNA. Dlatego zaprojektowaliśmy eksperymentalny protokół przygotowania zawiesiny komórek niekardiomiocytów z serc myszy po zawale mięśnia sercowego z dodatkowym naciskiem na poprawę żywotności komórek poprzez wybór łagodnych enzymów trawiennych, kontrolowanie czasu trawienia i stosowanie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Na koniec wyizolowaliśmy komórki CD45 + z zawiesiny komórek innych niż kardiomiocyty uzyskanej za pomocą tego protokołu, a następnie przeprowadziliśmy sekwencję scRNA.

Poprzez zastosowanie sekcji 2 niniejszego protokołu uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek o wysokiej żywotności. Niemniej jednak nadal można było zaobserwować fragmenty komórkowe (Rysunek 1A); w związku z tym przeprowadzono fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS), aby dodatkowo poprawić jakość preparatu16. Po sortowaniu FACS średnia wielkość komórki zmniejszyła się z 9,6 µm do 9,1 µm (Tabela 1), co sugeruje, że FACS pozwala na skuteczne zmniejszen...

Tutaj opisujemy protokół izolowania wystarczającej ilości pojedynczych niekardiomiocytów o wysokiej żywotności z serca myszy po zawale mięśnia sercowego (MI). Można to wykorzystać do późniejszego sekwencjonowania pojedynczych komórek, analizy cytometrii przepływowej i pierwotnej hodowli komórek.

Przygotowanie zawiesiny komórek innych niż kardiomiocyty do sekwencjonowania jednokomórkowego RNA z serca dorosłej myszy po zawale mięśnia sercowego

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Nasz protokół zapewnia zarówno żywotność komórek, jak i skuteczność izolacji zawiesiny pojedynczej komórki przy stosunkowo niskich kosztach. Stosunkowo niskie koszty i wymagania dotyczące sprzętu laboratoryjnego to główne zalety tej techniki. Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia heterogeniczność niekardiomiocytów w patofizjologii serca, a także dostarcza pomysłów na podstawowe i kliniczne badania chorób serca.Protokół ten może być wykorzystany w tych badaniach nad środowiskiem sercowo-naczyniowym po zawale mięśnia sercowo-naczyniowego, takim jak udział komórek odpornościowych. W przypadku preparatów po raz pierwszy sugeruję, aby zwrócić szczególną uwagę na próbkę pepsyny i czas trawienia. Po przygotowaniu i roztworów zgodnie z opisem w manuskrypcie, umieść uśpioną mysz, która miała zawał mięśnia sercowego dwa tygodnie wcześniej, w pozycji leżącej na plecach na stole operacyjnym.Przymocuj jego tylne kończyny za pomocą taśmy klejącej. Aby wyciąć serce, spryskaj ciało 70% etanolem. Wykonaj pionowe nacięcie przez skórę i mięśnie brzucha, unikając wątroby.Nie nakłuwając serca, ostrożnie otwórz klatkę piersiową i obficie lewą komorę wstępnie schłodzonym roztworem PBS, aż płyn perfuzyjny stanie się bezbarwny. Za pomocą kleszczy delikatnie unieś serce i odetnij nadmiar tkanek przyczepionych do jego zewnętrznej strony nożyczkami okulicznymi. Umieść serce w jednym mililitrze wstępnie schłodzonego PBS w 1.5 mililitrowej probówce do mikrowirówki.Przenieś serce do studzienki na 24-dołkowej płytce umieszczonej na lodzie. Wlej 150 mikrolitrów buforu dysocjacyjnego serca do studzienki i pokrój serce na milimetrowe kawałki za pomocą nożyczek. Przenieś zmieloną tkankę serca do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej pięć mililitrów buforu dysocjacji tkanek.Umieść rurkę w termostatycznym wytrząsarce tłokowej. Pipetować zawiesinę w górę i w dół 10 razy co 20 minut. Aby usunąć grudki i niestrawioną tkankę, przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów, używając 25 mililitrów buforu do przemywania komórek.Wypłucz probówkę wirówkową i sitko do komórek. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 mikrometrów, aby usunąć dalsze grudki komórek. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zawiesić próbkę komórkową w pięciu objętościach buforu do lizy RBC i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Teraz dodaj cztery objętości buforu do płukania komórek w zawiesinie komórek i odwiruj, jak pokazano wcześniej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach buforu do przemywania komórek i ponownie odwirować.Pod koniec wirowania odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do przemywania komórek. Weź 18 mikrolitrów zawiesiny do innej probówki wirówkowej i dodaj dwa mikrolitry roztworu barwiącego jodku propidium z pomarańczą akrydynową. Dodaj 10 mikrolitrów tego zabarwionego roztworu do szkiełka z komorą liczącą.Oceń liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek. Fragmenty komórek obserwowano w jednokomórkowym zawieszeniu serca. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją skutecznie zmniejszyło proporcję fragmentów komórek i zlepianie się komórek, co spowodowało zmniejszenie średniej wielkości komórki.Sekwencjonowanie RNA wykazało oczywiste oddzielenie siedmiu typów komórek odpornościowych, jak wykazano przez nienadzorowane grupowanie i zmniejszone osadzanie stochastycznego sąsiada w rozkładzie T. Każda komórka odpornościowa wykazywała wysoką ekspresję klasycznych markerów. Tkanka serca musi być przecięta na tyle drobno, aby uniknąć niepełnego trawienia, co prowadzi do powstania wielu grudek komórkowych w zawiesinie komórkowej.Zawiesina pojedynczej komórki uzyskana za pomocą tego protokołu może być dalej stosowana w analizie przepływu pierwotnej hodowli komórkowej. Protokół ten jest korzystny dla badań nad mikrośrodowiskiem infekcji mięśnia sercowego, co może pomóc naukowcom spojrzeć poza tkanki serca i uznać infekcję mięśnia sercowego za problem systematyczny.

preparation-non-cardiomyocyte-cell-suspension-for-single-cell-rna

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Opisujemy niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy. Protokół ten daje spójny wynik dla hodowli funkcjonalnych dorosłych kardiomiocytów od różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy.

Izolacja i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy do sygnalizacji komórkowej i przerostu serca in vitro

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Prezentowany tutaj jest protokół izolowania różnych podzbiorów makrofagów i innych komórek nieimmunologicznych z mięśnia sercowego ludzkiego i mysiego poprzez przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki poprzez trawienie enzymatyczne. Przedstawiono również schematy bramkowania do identyfikacji i charakterystyki izolowanych makrofagów w oparciu o cytometrię przepływową.

Izolacja podzbiorów makrofagów i komórek zrębu z próbek mięśnia sercowego u ludzi i myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji, transfekcji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy i szczurów.

Izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Tutaj opisujemy dwuetapowy protokół trawienia komórkowego do przygotowania jednokomórkowego zawieszenia tętnic szyjnych myszy.

Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z tętnic szyjnych myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Poznaj metodę izolacji żywych niekardiomiocytów z serca myszy po zawale mięśnia sercowego do sekwencjonowania jednokomórkowego RNA. Protokół zapewnia wysoką żywotność komórek przy niskich kosztach i umożliwia badanie heterogeniczności komórek serca.

Przygotowanie zawiesiny komórek innych niż kardiomiocyty do sekwencjonowania jednokomórkowego RNA z serca dorosłej myszy po zawale mięśnia sercowego (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie zawiesiny komórek innych niż kardiomiocyty do sekwencjonowania jednokomórkowego RNA z serca dorosłej myszy po zawale mięśnia sercowego

Przeglądaj więcej filmów