Name: Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj metodę CRISPR-EZ do edycji genomu myszy przez elektroporację zygot z niemal 100% wydajnością. Technika umożliwia tworzenie modeli zwierzęcych i badanie wczesnego rozwoju embrionalnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

A.J.M. stworzył oryginalną koncepcję, która doprowadziła do opracowania CRISPR-EZ i stworzył liczby. C.K.D. skompilował i dostosował wewnętrzne i opublikowane protokoły do tego aktualnego rękopisu. A.J.M. jest wspierany przez NIH (R00HD096108).

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766(2014).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+phenotype-expressing+triple-knockout+mice+with+heritable+mutated+alleles+by+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system.</a> Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).</li>
<li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS One. 10 (11), 0142755(2015).</li>
<li>Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicism+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing.</a> Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).</li>
<li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mouse+genome+engineering+by+CRISPR-EZ+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li>
<li>Hur, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+mice+by+electroporation+of+Cpf1+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).</li>
<li>Tröder, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR%2FCas9+genome+editing+in+murine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), 0196891(2018).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2Fcas9-mediated+genome+editing+in+mice+by+zygote+electroporation+of+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease.</a> Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).</li>
<li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Cas9+protein%2FsgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA%2FCas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474(2018).</li>
<li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li>
<li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li>
<li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR%2FCas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554(2017).</li>
<li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR%2FCas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li>
<li>Nishio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+voltage+strength+during+electroporation+on+the+development+and+quality+of+in+vitro-produced+porcine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.</a> Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).</li>
<li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Frontiers in Genetics. 11, 570069(2020).</li>
<li>Escoffre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+%28still+not%29+known+of+the+mechanism+by+which+electroporation+mediates+gene+transfer+and+expression+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues.</a> Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-READI%3A+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li>
<li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Scientific Reports. 8, 888(2018).</li>
<li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse-specific+retrotransposon+drives+a+conserved+Cdk2ap1+isoform+essential+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development.</a> Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li>
<li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).</li>
<li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 14811(2019).</li>
<li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieval+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185(2007).</li>
<li>Takahashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GONAD%3A+Genome-editing+via+oviductal+nucleic+acids+delivery+system%3A+A+novel+microinjection+independent+genome+engineering+method+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice.</a> Scientific Reports. 5, 11406(2015).</li>
<li>Tu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+Cas9+degradation+reduces+mosaic+mutations+in+non-human+primate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos.</a> Scientific Reports. 7, 42081(2017).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16 (1), 87(2015).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+exon-intron+architecture+variation+of+genes+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes.</a> BMC Genomics. 10, 47(2009).</li>
<li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR%3A+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92(2017).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+and+generating+a+mouse+model%3A+frequently+asked+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Designing and generating a mouse model: frequently asked questions.</a> Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).</li>
<li>Nakajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+in+the+knockin+mice+generated+using+the+CRISPR%2F+Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system.</a> Scientific Reports. 6, 34703(2016).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nature Methods. 12 (6), 479(2015).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
</ol>

Brak jest stosownych oświadczeń finansowych autorów.

Przedstawiona tutaj jest prosta i bardzo wydajna technologia edycji genomu myszy. Elektroporacja może być stosowana do generowania zmodyfikowanych zarodków w ciągu 1-2 tygodni (ryc. 1) i może produkować edytowane myszy w ciągu 6 tygodni9. W porównaniu z równolegle opracowanymi protokołami opartymi na elektroporacji, które dostarczają RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, opisana tutaj metoda jest koncepcyjnie podobna...

Edycja genomu u żywych myszy została znacznie uproszczona i stała się dostępna i bardziej przystępna cenowo od czasu pojawienia się edycji CRISPR1,2,3. Początkowe próby edycji na zwierzętach wykorzystywały mikroiniekcję do dostarczenia mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 do zarodków w stadium przedjądrowym4,5,6. Chociaż mikroiniekcja jest dość skuteczna, ilość praktyki wymagana do jej pełnego opanowania może nie być odpowiednia dla stażystów i studentów, a także wymaga drogiego sprzętu, na który skromnie finansowane laboratorium nie jest w stanie sobie pozwolić. Mikroiniekcja jest zwykle wykonywana przez doświadczonych techników w placówkach transgenicznych, a harmonogramy i ceny usług są ograniczające szybkość dla wielu badaczy. Bardziej dostępnym podejściem jest elektroporacja, która, jak wykazano, jest dość skuteczna w dostarczaniu mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 do zarodków w stadium przedjądrowym7. Dalsze ulepszenia w strategiach edycji i dostarczania genomu CRISPR sugerują, że wstępnie złożone RNP już zaangażowane w sgRNA mogą być skutecznym sposobem na zmniejszenie mozaicyzmu8.
Powodem rozwoju i użycia tego protokołu było ominięcie wielu ograniczeń i przeszkód związanych z mikroiniekcją. Jak sama nazwa wskazuje, łatwa, wewnętrzna i opłacalna metoda, która mogłaby szybko określić, czy nieprzetestowane projekty sgRNA byłyby warte użycia podczas eksperymentu z mikroiniekcją, byłaby bardzo wygodnym pierwszym krokiem kontroli jakości (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Chociaż metoda ta nie może zastąpić mikroiniekcji w przypadku bardziej złożonych strategii, takich jak wprowadzanie długich sekwencji DNA dawcy w celu uzyskania wyników opartych na rekombinacji, jest idealna w przypadku mniej złożonych strategii, takich jak małe delecje lub insercje i znakowanie genów. Metoda ta jest odpowiednia dla badaczy posiadających podstawowe umiejętności w zakresie manipulacji zarodkami, którzy mają proste potrzeby edycyjne, chcieliby przetestować swoją hipotezę w ramach czasowych rozwoju preimplantacyjnego lub wolą przetestować sgRNA w zarodkach przed umówieniem się na wizytę u specjalisty od mikroiniekcji. W tym przypadku odczynniki do edycji są przejściowo dostarczane do zarodków w stadium przedjądrowym jako RNP Cas9 / sgRNA poprzez elektroporację (serię impulsów elektrycznych), aby zmaksymalizować wydajność przy jednoczesnym zmniejszeniu mozaicyzmu8. Korzystając z metody genotypowania zarodków, wyniki edycji są dostępne w ciągu około 1 tygodnia9, zmniejszając w ten sposób potrzebę różnych zastosowań mikroiniekcji przy znacznie obniżonych kosztach.
Skuteczność tej metody osiąga szczyt w stadium zarodka przedjądrowego, kiedy zarodek nie złączył jeszcze przedjądrza matki i ojca ani nie wszedł w fazę S (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Superowulacja jest stosowana w celu maksymalizacji liczby zygot, ale wytwarza zarówno zygoty przedjądrowe, jak i niezapłodnione jaja. Zdrowe zygoty można również wstępnie wyselekcjonować przed elektroporacją, aby zwiększyć ogólną wydajność. Podobnie jak inne protokoły elektroporacji, zygoty efektywnie edytowały bez konieczności dołączania podobnego kroku7,10,11,12,13,14,15, opcjonalnym etapem tego protokołu jest nieznaczna erozja osłonki przejrzystej (ZP). ZP to warstwa glikoproteiny, która wspomaga wiązanie plemników, odpowiedź akrosomów i zapłodnienie otaczające zarodki w stadium przedjądrowym. Z naszego doświadczenia wynika, że delikatna erozja ZP na bazie kwasów zapewnia niezawodne dostarczanie elektroporacji Cas9 RNP przy jedynie marginalnym wpływie na żywotność.
Zaobserwowaliśmy szybkość dostarczania RNP do 100% dzięki elektroporacji w szczepach myszy, które są powszechnie używane w badaniach, takich jak C57BL/6J i C57BL/6N9,16. Niezależne grupy opracowały również procedury oparte na elektroporacji, których skuteczność jest większa lub odpowiadająca mikroiniekcji11,12,13,14,15,17, z protokołami elektroporacji działającymi dobrze w RAT18,19, świnia20,21,22 i cow23, dlatego sugerujemy, aby czytelnicy porównali protokoły, aby znaleźć warunki, które najlepiej odpowiadają ich potrzebom eksperymentalnym i sprzętowym. Opisany tutaj system wykorzystuje powszechnie stosowane materiały i sprzęt, wymagający jedynie podstawowych umiejętności w zakresie manipulacji zarodkami. Technika ta jest skuteczna w przypadku wielu strategii edycji, dzięki czemu metoda ta jest szeroko dostępna dla społeczności naukowej.
Projektowanie idealnych małych przewodników RNA (sgRNA) jest niezbędne do efektywnej edycji. Zalecamy badania przesiewowe od dwóch do trzech strategii sgRNA na miejsce docelowe bezpośrednio w zarodkach myszy, zwłaszcza jeśli pożądane jest generowanie linii myszy. Po zaprojektowaniu zalecane są metody wolne od klonowania, takie jak transkrypcja in vitro (IVT) w celu wytworzenia wysokiej jakości sgRNA3. RNP i sgRNA miesza się z 30-50 przetworzonymi zarodkami w stadium przedjądrowym i poddaje się serii impulsów elektrycznych, aby najpierw tymczasowo przeniknąć przez ZP i błonę komórkową, z kolejnymi impulsami, aby utrzymać otwarte pory i elektroforować RNP przez zygotę24. Po optymalizacji stwierdziliśmy, że sześć impulsów 3 ms przy 30 V dla zarodków masowych (~50) było optymalnych dla skuteczności i żywotności edycji, zapewniając wysoce wydajne dostarczanie Cas9 / sgRNA RNP9,16,25. Zdarzenia edycji w poszczególnych morulach myszy można potwierdzić za pomocą różnych strategii walidacji typowych dla edycji CRISPR, takich jak polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), trawienie endonukleazy T7 i sekwencjonowanie Sangera w obszarze zainteresowania26.
Obecna metoda jest najbardziej odpowiednia dla prostych schematów edycji (Rysunek 3), takich jak wstawianie/usuwanie (indels), delecje wielkości eksonu rzędu 500-2000 bp, oraz dostarczanie mutacji punktowych i małych insercji, takich jak znaczniki C- lub N-Terminal (np. FLAG, HA lub V5)9,16,27. Potencjał złożonej edycji genomu, takiej jak duże insercje znaczników fluorescencyjnych lub alleli warunkowych, pozostaje niepewny i jest obecnie przedmiotem nadchodzących ulepszeń.
Ta metoda jest łatwa do opanowania i może być użyta do szybkiego testowania sgRNA w hodowlanych zarodkach myszy w ciągu 1 tygodnia9 (<strong class="xfig">Rysunek 1). W niniejszej pracy przedstawiono sześcioetapowy protokół, który obejmuje: 1) projekt sgRNA; 2) synteza sgRNA; 3) superowulacja i krycie; 4) hodowla, pobieranie i przetwarzanie zarodków; 5) Montaż RNP i elektroporacja; 6) hodowla zarodków i genotypowanie. Podane są informacje o wszystkich użytych materiałach (Tabela materiałów). Jako kontrola pozytywna, odczynniki do edycji locustyrozynazy (Tyr) class="xref">9,16 zostały włączone do Tabeli Uzupełniającej 1.

<table><tbody><tr><td>Kuweta do elektroporacji 0,1 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>nr kat. 1652089</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>26-G, igła 1/2 cala</td><td>BD</td><td>nr kat. 305111</td><td>Superowulacja</td></tr><tr><td>3&ndash; 8-miesięczny samiec myszy i 3-5-tygodniowe samice</td><td>myszy JAX</td><td>nr kat. 000664</td><td>Superowulacja</td></tr><tr><td>35 mm Naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Greiner Bio-One,</td> <td>nr kat. 627-160</td><td>Hodowla zarodków</td></tr><tr><td>60 mm Naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Greiner Bio-One,</td> <td>nr kat. 628-160</td><td>Przetwarzanie zarodków</td></tr><tr><td>6x barwnik ładujący</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>nr kat. R0611</td><td>sgRNA Synteza i genotypowanie</td></tr><tr><td>Kwaśny roztwór Tyrode'a (AT), klasa hodowli zarodków</td><td>Sigma-Aldrich,</td> <td>nr kat. T1788</td><td>Przetwarzanie zarodków</td></tr><tr><td>BSA, klasa hodowli zarodków</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr kat. A3311</td><td>Przetwarzanie i hodowla zarodków</td></tr><tr><td>Białko Cas9</td><td>Alt-R S.p. Nukleaza Cas9 3NLS</td><td>nr kat. 1074181</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>DNaza I, bez RNaz</td><td>New England BioLabs,</td> <td>nr kat. M0303</td><td>Synteza sgRNA</td></tr><tr><td>DPBS (bez wapnia i magnezu)</td><td>Gibco</td><td>nr kat. 14190-144</td><td>Przetwarzanie zarodków</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>nr kat. R3101S</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>EDTA, bezwodne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr kat. EDS-100G</td><td>RNP Bufor</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>nr kat. V1016</td><td>sgRNA Synteza</td></tr><tr><td>Żelatyna (proszek) typ B, klasa laboratoryjna</td><td>Fisher,</td> <td>nr kat. G7-500</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Glicerol,&nbsp; stopień biologii molekularnej</td><td>Fisher</td><td>nr kat. BP229</td><td>RNP Bufor</td></tr><tr><td>Taq Polimeraza</td><td>Promega</td><td>nr kat. M712</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>HEPES, klasa hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr kat. H4034</td><td>RNP Bufor</td></tr><tr><td>HinfI (10 000 U/ml)</td><td>NEB</td><td>nr kat. R0155S</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>New England BioLabs,</td> <td>nr kat. Synteza</td><td></td></tr> <tr><td>sgRNA E2040Ludzka gonadotropina kosmówkowa, liofilizowana&nbsp; (hCG)</td><td>Milipor</td><td>nr kat. 230734</td> Hialuronidaza <td>superowulacyjny</td></tr><tr><td>/M2</td><td>Milipor</td><td>nr kat. MR-051-F</td><td>Przetwarzanie zarodków</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve pożywka (pożywka zoptymalizowana pod kątem sympleksu z dodatkiem potasu plus aminokwasy)</td><td>Zenith Biotech</td><td>nr kat. ZEKS-050</td><td>Hodowla zarodków</td></tr><tr><td>LE agaroza, klasa analityczna</td><td>BioExpress</td><td>nr kat. E-3120-500</td><td>sgRNA Synteza i genotypowanie</td></tr><tr><td>M2 podłoże</td><td>Zenith Biotech</td><td>nr kat. ZFM2-050</td><td>Przetwarzanie zarodków</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu, bezwodny (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr kat. M8266</td><td>RNP i Liza Bufor</td></tr><tr><td>Mineralny Olej</td><td>Millipore</td><td>nr kat. ES-005C</td><td>Hodowla zarodków</td></tr><tr><td>Nonidet P-40, substytut (NP-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr kat. 74385</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz, klasa biologii molekularnej</td><td>Ambion</td><td>nr kat. AM9937</td><td>sgRNA Synteza i genotypowanie</td></tr><tr><td>Oligonukleotydy do syntezy sgRNA, oligonoidy donorowe i startery PCR do genotypowania</td><td>Zintegrowane technologie DNA na</td><td>zamówienie niestandardowe</td><td>Projektowanie sgRNA</td></tr><tr><td>Zredukowane podłoże surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>nr kat. 31985062</td><td>Hodowla zarodków</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England BioLabs,</td> <td>nr kat. M0530</td><td>synteza</td></tr> <tr><td>sgRNAChlorek potasu klasa biologii molekularnej (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr kat. P9333</td><td>RNP i bufor do lizy</td></tr><tr><td>Surowica ciężarnej klaczy liofilizowana gonadotropina ((PMSG)</td><td>ProspecBio</td><td>nr kat. HOR-272</td><td>Proteinaza superowulacyjna</td></tr><tr><td>K, stopień biologii molekularnej</td><td>Fishera</td><td>nr kat. BP1700-100</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>1,5 ml mikrowirówka bez RNaz</td><td>VWR</td><td>nr kat. 20170-333</td><td>Synteza i genotypowanie sgRNA</td></tr><tr><td>Ośmiodołkowe probówki paskowe do PCR bez RNaz</td><td>VWR</td> nr <td>kat. 82006-606</td><td>sgRNA Synteza i genotypowanie</td></tr><tr><td>Magnetyczne kulki oczyszczające</td><td>GE Healthcare</td><td>nr kat. 65152105050250</td><td>sgRNA Synteza</td></tr><tr><td>Tris (2-karboksetylo)fosfiny chlorowodorek (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr kat. C4706</td><td>RNP Bufor</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 8,5 klasa biologii molekularnej</td><td>Teknova</td><td>nr kat. T1085</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Tween 20 klasa biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr kat. P7949-500</td><td>Bufor do lizy</td></tr></tbody></table>

wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot crispr

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

Dzięki wyjątkowej wydajności, dokładności i łatwości, system CRISPR/Cas9 znacznie poprawił edycję genomu w hodowlach komórkowych i eksperymentach na zwierzętach laboratoryjnych. Podczas generowania modeli zwierzęcych elektroporacja zygot oferuje wyższą wydajność, prostotę, koszt i przepustowość jako alternatywa dla złotego standardu metody mikroiniekcji. Elektroporacja jest również łagodniejsza, z wyższą żywotnością i niezawodnie dostarcza rybonukleoproteiny (RNP) Cas9 / jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) do zygot popularnych laboratoryjnych szczepów myszy (np. C57BL / 6J i C57BL / 6N), które zbliżają się do 100% wydajności dostarczania. Technika ta umożliwia mutacje typu insercja/delecja (indels), mutacje punktowe, delecja całych genów lub eksonów oraz małe insercje w zakresie 100-200 pz w celu wstawienia LoxP lub krótkich znaczników, takich jak FLAG, HA lub V5. Chociaż jest stale ulepszany, tutaj przedstawiamy obecny stan CRISPR-EZ w protokole, który obejmuje produkcję sgRNA poprzez transkrypcję in vitro, przetwarzanie zarodków, składanie RNP, elektroporację i genotypowanie zarodków preimplantacyjnych. Badacz z wykształceniem wyższym z minimalnym doświadczeniem w manipulowaniu embrionami może uzyskać genetycznie edytowane zarodki w czasie krótszym niż 1 tydzień przy użyciu tego protokołu. W tym przypadku oferujemy prostą, tanią, wydajną i wydajną metodę, którą można zastosować w przypadku zarodków myszy.

Ta metoda pozwala na uzyskanie więcej niż 100 µg sgRNA (20 µL w &gt;(stężenie 6 000 ng/L) w celu wydajnego montażu kompleksów RNP Cas9/sgRNA. Rutynowa metoda superowulacji opisana w niniejszym tekście zazwyczaj pozwala na uzyskanie 10–20 żywotnych embrionów na jedną zapłodnioną samicę. Ze względu na błędy manipulacyjne i typowe straty związane z manipulacją embrionami, oczekuje się, że 80% embrionów zostanie zapłodnionych, pozostanie żywotnych i będzie w doskonałym stanie po elektroporacji. Aby pomóc badaczom w pomyślnym...

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Ta metoda może sprawdzić przewodnikowe RNA w zarodkach, przetestować pytania dotyczące wczesnego rozwoju lub stworzyć edytowane myszy. Wszelkie postępy w CRISPR Cas9 mogą być wykorzystane tą metodą. Główną zaletą tej metody jest to, że jest łatwa do nauczenia i wykorzystuje odczynniki, które są dostępne dla laboratoriów, które mają dostęp do myszy.W przyszłości technika ta będzie przydatna do korygowania choroby lub mutacji u potomstwa zwierzęcia towarzyszącego lub zwierzęcia ważnego dla rolnictwa. Ta metoda najlepiej nadaje się do generowania modeli myszy. W naszym laboratorium używaliśmy różnych wariantów tej metody do badania wydarzeń związanych z zapłodnieniem i wczesnym rozwojem preimplantacyjnym, w szczególności regulacji genów w potencji zarodka.Najtrudniejszą częścią jest użycie szklanej igły do przenoszenia zarodków z płytki na płytkę. Tę procedurę zademonstruje Chantal Diallo, specjalistka ds. badań w moim laboratorium. Aby rozpocząć pobieranie i przetwarzanie zarodków, połóż uśpioną samicę myszy na plecach i spryskaj 70% etanolem brzuch, który ma zostać chirurgicznie otwarty.Aby otworzyć jamę brzuszną i usunąć jajowody, przeciąć warstwę skóry nożyczkami chirurgicznymi i

efficient-genome-editing-of-mice-by-crispr-electroporation-of-zygotes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Zgrupowany, regularnie rozmieszczony, krótki powtórzeń palindromicznych/system białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) stanowi obiecujące narzędzie dla inżynierii genetycznej i otwiera możliwość celowej integracji transgenów. Opisujemy strategię opartą na łączeniu końców za pośrednictwem homologii (HMEJ) dla efektywnej ukierunkowanej integracji DNA in vivo i celowanych terapii genowych przy użyciu CRISPR/Cas9.

Ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii

Konwencjonalne badania utraty funkcji genów przy użyciu zwierząt nokautujących często były kosztowne i czasochłonne. Mutageneza somatyczna oparta na CRISPR oparta na elektroporacji jest potężnym narzędziem do zrozumienia funkcji genów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metodę analizy fenotypów nokautu w proliferujących komórkach móżdżku.

Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Obecny protokół opisuje mikroiniekcję zygoty z CRISPR-Cas9 i DNA dawcy w celu efektywnej produkcji myszy z kasetą z genami i myszami z klapkami.

Mikroiniekcja zygoty do tworzenia alleli knock-in i flox kasety genów u myszy

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Ten protokół opisuje mikroiniekcję i elektroporację in vivo dla regionalnie ograniczonej edycji genomu za pośrednictwem CRISPR w jajowodzie myszy.

Somatyczne modele myszy z inżynierią genomu przy użyciu mikroiniekcji in vivo i elektroporacji

Ten protokół przedstawia zoptymalizowane podejście do produkcji genetycznie modyfikowanych modeli szczurów. Wirus związany z adenowirusem (AAV) służy do dostarczania matrycy naprawy DNA, a elektroporacja służy do dostarczania odczynników CRISPR-Cas9 w celu zakończenia procesu edycji genomu w zarodku 2-komórkowym.

CRISPR-Cas9 Edycja genomu zarodków szczurów przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) i elektroporacją zarodków 2-komórkowych

Efektywność metody Improved Genome Editing za pomocą dostarczania kwasów nukleinowych w jajowódku (I-GONAD) jest porównywalna z tradycyjną mikroiniekcją, która wymaga pobrania zygot od samic dawców i przekazania ich do kobiet pseudo-ciężarnych. Protokół ten wykazuje swoją skuteczność, wprowadzając mutacje indukowane przez CRISPR/Cas9 do locus ROSA26 na chromosomie 6.

Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Poznaj metodę CRISPR-EZ do edycji genomu myszy przez elektroporację zygot z niemal 100% wydajnością. Technika umożliwia tworzenie modeli zwierzęcych i badanie wczesnego rozwoju embrionalnego.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Przeglądaj więcej filmów