Name: Ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę oceny zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc. Technika ta umożliwia badanie aktywacji CAF i ich wpływu na rozwój nowotworu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez SERB-Women Excellence Award Project, Indie (SB/WEA-02/2017) oraz SERB-Early Career Research Award Project, Indie (ECR/2017/000892) do DP. Autorzy, LA i SR, dziękują IIT Ropar i MHRD za ich stypendia naukowe. MK dziękuje ICMR za jej stypendium badawcze.

<ol><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+demonstrates+the+molecular+and+cellular+reprogramming+of+metastatic+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).</li>
<li>Davidson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+a+dynamic+stromal+niche+that+supports+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth.</a> Cell Reports. 31 (7), 107628(2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+of+renal+cell+cancers+reveal+insights+into+tumor+microenvironment%2C+cell+of+origin%2C+and+therapy+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).</li>
<li>Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+patient+specificity+in+the+engineering+of+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Addressing patient specificity in the engineering of tumor models.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217(2019).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTimmins%2C+NE+%22Tissue+Engineering%22">Tissue Engineering</a>. , Humana Press. 141-151 (2007).</li>
<li>Dituri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+tumor+spheroid+formation+and+one-step+cancer-associated+fibroblasts+purification+from+hepatocellular+carcinoma+tissue+promoted+by+inorganic+surface+topography%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography.</a> Nanomaterials. 11 (12), 3233(2021).</li>
<li>Arora, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+multicellular+3D+tumor+model+to+study+cellular+heterogeneity+and+plasticity+in+NSCLC+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 12, 881207(2022).</li>
<li>Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+definitions%3A+Cancer-associated+fibroblasts+and+their+markers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers.</a> International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1%CE%B1+is+necessary+for+activation+and+tumour-promotion+effect+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIF-1α is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).</li>
<li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+heterogeneity+and+versatility+of+cancer-associated+fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).</li>
<li>Whitaker-Menezes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+stromal-epithelial+%26%2334%3Blactate+shuttle%26%2334%3B+in+human+tumors%3A+MCT4+is+a+marker+of+oxidative+stress+in+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Evidence for a stromal-epithelial &#34;lactate shuttle&#34; in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts.</a> Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).</li>
<li>Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-Pérez, J. C., Marín-Hernández, A., Moreno-Sánchez, R., Rodríguez-Enríquez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-mitochondrial+therapy+in+human+breast+cancer+multi-cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).</li>
<li>Bregman, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBregman%2C+AA+%22Laboratory+Investigations+in+Cell+and+Molecular+Biology%22">Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology</a>. , John Wiley & Sons Incorporated. (2002).</li>
<li>Berry, E. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+hemes+a%2C+b%2C+and+c+from+pyridine+hemochrome+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra.</a> Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).</li>
<li>Avagliano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+cancer+associated+fibroblasts%3A+the+slavery+of+stromal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts.</a> BioMed Research International. , (2018).</li>
<li>Lorusso, G., Rüegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li>
<li>Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+build+and+secure+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60(2019).</li>
<li>Sebastian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+of+tumor-derived+fibroblasts+and+normal+tissue-resident+fibroblasts+reveals+fibroblast+heterogeneity+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer.</a> Cancers. 12 (5), 1307(2020).</li>
<li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li>
<li>Ganguly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts%3A+Versatile+players+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment.</a> Cancers. 12 (9), 2652(2020).</li>
<li>Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+the+cancer-associated+fibroblast-T-cell+axis+in+solid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989(2019).</li>
<li>Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+associated+fibroblasts%3A+the+architects+of+stroma+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700167(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Niniejsze badanie przedstawia rozwój wielokomórkowych sferoid nowotworowych składających się z komórek nowotworowych, populacji komórek zrębu (tj. fibroblastów) i populacji komórek odpornościowych (tj. monocytów) przy użyciu zmodyfikowanej metody zwisającej kropli. Fibroblasty i monocyty/makrofagi należą do najważniejszych populacji tworzących mikrośrodowisko guza (TME), a ich obecność często wiąże się ze złym rokowaniem pacjentów16. W obecności TME fibroblasty przekształcają się, wykazując specyf...

Guzy lite składają się z heterogenicznych populacji komórek, które są kierowane przez mikrośrodowisko guza (TME), jednak pochodzenie większości komórek nie zostało jeszcze odkryte. Głównie komórki zrębu i odpornościowe (fibroblasty, komórki śródbłonka, monocyty, makrofagi, komórki dendrytyczne, limfocyty B, limfocyty T i ich podzbiory) odzwierciedlają niejednorodność guza w raku płuc, piersi, nerki i innych nowotworach litych1,2,3. Zrozumienie pochodzenia każdego podtypu i jego potencjału transdyferencjacji jest niezwykle potrzebne do opracowania zaawansowanych terapii przeciwko tym nowotworom. Analiza tej zróżnicowanej populacji komórek w biopsjach u ludzi wiąże się z kilkoma wyzwaniami ze względu na typ guza, miejsce, stadium, ograniczenie ilości próbki i zmienność specyficzną dla pacjenta4. W związku z tym potrzebny jest model eksperymentalny, który jest nie tylko wiarygodny, ale może również symulować stan guza in vivo, okazując się idealny do badania przesłuchów guz-zręb i ich udziału w patofizjologii choroby.
Trójwymiarowe (3D) wielokomórkowe hodowle sferoidalne guzów (MCTS) są korzystnym systemem modelowym in vitro nowotworów ze względu na ich podobieństwo do naturalnych odpowiedników. MCTS może lepiej odtworzyć aspekty guzów litych niż modele hodowli komórkowych 2D, w tym ich architekturę przestrzenną, reakcje fizjologiczne, uwalnianie rozpuszczalnych mediatorów, wzorce ekspresji genów i mechanizmy oporności na leki. Co więcej, jedną z głównych zalet MCTS jest to, że można go wykorzystać do badania niejednorodności guza i mikrośrodowiska guza (TME). Metoda hanging-drop jest najczęściej stosowanym narzędziem do tworzenia i analizowania MCTS5. W tej metodzie różne komórki z pożywką są zawieszone w postaci kropel, co pozwala na ich wzrost w spójny sposób zagregowany 3D i jest łatwo dostępne do badania. Technika jest prosta; Nie wymaga wielu komórek i eliminuje potrzebę specjalistycznego substratu, takiego jak agaroza, do rozwoju sferoidów<klasa SUP="xref">6. Dodatkową zaletą tej metody jest powtarzalność jej techniki. Co więcej, metoda ta została również wykorzystana do wspólnej hodowli mieszanych populacji komórek, takich jak komórki śródbłonka i komórki nowotworowe, w celu symulacji wczesnej angiogenezy guza7.
W tym badaniu, wielokomórkowe sferoidy 3D guza płuc zostały przygotowane z komórkami gruczolakoraka płuc, fibroblastami i monocytami przy użyciu metody wiszącej kropli, która naśladuje mikrośrodowisko guza płuc. Następnie wyizolowano populację fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w celu zbadania zdrowia mitochondriów. Główną ideą stojącą za opracowaniem tych sferoid jest wyizolowanie CAF, ponieważ przesłuch między komórkami w sferoidach może przekształcić fibroblasty w aktywowany stan CAF podobny do miofibroblastów. Po drugie, badanie to może również obrazować, w jaki sposób nieprawidłowa produkcja ROS i dysfunkcja mitochondriów popychają normalne fibroblasty w kierunku bardziej agresywnego fenotypu CAF. Stwierdzono, że fibroblasty zgromadzone w sferoidach guza uzyskały cechy miofibroblastyczne ze zwiększoną aktywnością ROS i indukcją metabolicznej ekspresji genów. Protokół ten podkreśla znaczenie mikrośrodowiska guza w aktywacji CAF i może być doskonałym modelem do generowania in vitro i badania cech fenotypowych CAF.

<table><tbody><tr><td><silne>przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC anty-ludzkie &alfa;-SMA</td><td>R& Systemy D</td><td>Cat# IC1420A</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki antyfibroblastowe</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-050-601</td><td></td></tr><tr><td>Linie komórkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549 komórki gruczolakoraka płuc</td><td>NCCS</td> Pune-MRC-5 <td></td><td></td></tr><tr><td>płodowe fibroblasty płuc</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 Ludzkie monocyty</td><td>NCCS Pune</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Himedia</td><td>Cat# 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>2,6-dichloroindofenol (DCPIP)</td><td>SRL</td><td>Cat# 55287</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# C3099</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# D1306</td><td></td></tr><tr><td>DCFDA</td><td>Sigma</td><td>Kot# D6883</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11995073</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>Cat# 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>Cat# 17892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>SRL</td><td>Cat# 62858</td><td></td></tr><tr><td>EZcoun Zestaw do oznaczania komórek dehydrogenazy mleczanowej</td><td>HiMedia</td><td>Cat# CCK036</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>Cat# </td><td></td>10082147</tr><tr><td>Halt Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 87786</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 15630080</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>serca konia Kot SRL</td><td># 81551</td><td></td></tr><tr><td>Image-iT Czerwony odczynnik do hipoksji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# H10498</td><td></td></tr><tr><td>JC-1 Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# T3168</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>Cat# P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck</td><td>Cat# M8266</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 69824</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH MB Grade</td><td>SRL</td><td>Cat# 54941</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr kat.# 85124</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Metosiarczan fenazyny (PMS)</td><td>SRL</td><td>Cat# 55782</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>Cat# P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11875093</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do lizy jednokomórkowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 4458235</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Merck</td><td>Cat# A7631</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanek sodu</td><td>Sigma</td><td>Cat# 205222</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 89904</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L3771</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian sodu sześciowodny</td><td>SRL</td><td>Cat# 36313</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>Cat# S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO zestaw do syntezy cDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 11754-050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>Cat# T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25% EDTA</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25200072</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny SYBR Green Supermix</td><td>BIO-RAD</td><td>Cat# 172-5124</td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumny MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Główny system obrazowania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Numer seryjny F0518-1727-0191</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie LAS X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny Leica</td><td>s</td><td>DMi8 zautomatyzowany S/N 424150)</td><td></td></tr><tr><td>Separator Midi MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-042-302</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3d guza płuc

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Fibroblasty związane z rakiem (CAF) są jednymi z najliczniejszych komórek zrębu obecnych w mikrośrodowisku guza, ułatwiając wzrost i progresję guza. Złożoność mikrośrodowiska guza, w tym sekretom guza, stan zapalny o niskim stopniu nasilenia, niedotlenienie i nierównowaga redoks, sprzyja interakcji heterotypowej i umożliwia transformację nieaktywnych rezydentnych fibroblastów w aktywne CAF. CAF różnią się metabolicznie od normalnych fibroblastów (NF), ponieważ są bardziej aktywne glikolitycznie, wytwarzają wyższe poziomy reaktywnych form tlenu (ROS) i nadekspresję eksportera mleczanu MCT-4, co prowadzi do otwarcia porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów (MPTP). W tym miejscu opisano metodę analizy zdrowia mitochondriów aktywowanych CAF wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid guza 3D składających się z ludzkich komórek gruczolakoraka płuc (A549), ludzkich monocytów (THP-1) i ludzkich komórek fibroblastów płuc (MRC5). Sferoidy guza uległy dezintegracji w różnych odstępach czasu, a poprzez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie wyizolowano CAF. Potencjał błony mitochondrialnej CAF oceniano za pomocą barwnika JC-1, produkcji ROS przez barwienie dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFDA) oraz aktywności enzymatycznej w izolowanych CAF. Analiza zdrowia mitochondriów izolowanych CAF zapewnia lepsze zrozumienie odwróconego efektu Warburga i może być również zastosowana do badania konsekwencji zmian mitochondrialnych CAF, takich jak strumienie metaboliczne i odpowiadające im mechanizmy regulacyjne dotyczące heterogeniczności raka płuc. W związku z tym niniejsze badanie opowiada się za zrozumieniem interakcji guz-zrąb na zdrowie mitochondriów. Stanowiłoby to platformę do sprawdzania kandydatów na leki specyficzne dla mitochondriów pod kątem ich skuteczności przeciwko CAF jako potencjalnym terapiom w mikrośrodowisku guza, zapobiegając w ten sposób udziałowi CAF w progresji raka płuc.

Rycina 1 przedstawia rozwój wielokomórkowych sferoidów nowotworowych z wykorzystaniem trzech różnych populacji komórek – A549 (gruczolak prądrzewny płuc), MRC-5 (fibroblasty) i THP-1 (monocyty) – metodą wiszących kropel, obserwowanych pod mikroskopem w 7. i 10. dniu. W 7. dniu sferoidy były zwarte i sztywne, o średnicy 260 ± 5.3 µm średnica, a w 10. dniu sferoidy miały wymiar 480 ± 7.5 µm o średnicy (Rysunek 1A górny panel, Rycina 1B...

Wielokomórkowe sferoidy guza 3D zostały przygotowane z komórkami gruczolakoraka płuc, fibroblastami i monocytami, a następnie wyizolowano fibroblasty związane z rakiem (CAF) z tych sferoidów. Izolowane CAF porównano z normalnymi fibroblastami w celu oceny zdrowia mitochondriów poprzez badanie potencjału transbłonowego mitochondriów, reaktywnych form tlenu i aktywności enzymatycznej.

Ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Protokół ten podkreśla znaczenie mikrośrodowiska guza w aktywacji fibroblastów związanych z rakiem lub CAF. Może to być doskonały model in vitro do badania cech fenotypowych. Główne ograniczenia w biologii CAF polegają na ograniczonej dostępności CAF z próbek biopsji pierwotnego guza.Tak więc ta technika może być wykorzystana do badania różnych aspektów biologii CAF. Badanie to przedstawia nieprawidłową produkcję krzyżową i dysfunkcję mitochondriów związaną z aktywacją CAF, co prowadzi do złego rokowania w przypadku nowotworu. Zastosowanie tej metody byłoby przydatne do oceny interakcji urazowych guza, w szczególności aktywacji CAF i zdrowia mitochondriów.W celu zbadania nowych celów leków. Osoby muszą mieć doświadczenie w procedurze komórkowej przed wykonaniem tej techniki. Wizualna demonstracja tej techniki pozwoli zrozumieć krytyczne etapy izolowania populacji CAF od sferoid guza i dalszych zastosowań w celu zbadania biologii CAF.Panna Leena Arora, panna Moyna Kalia i pani Soumyajit Roy, asystentki mojego laboratorium, przeprowadzają eksperymenty. Aby rozpocząć, należy wyhodować ludzkiego gruczolakoraka płuc A549 i ludzkie komórki adherentne fibroblastów płuc MRC-5 w DMEM i ludz

assessment-mitochondrial-health-cancer-associated-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten protokół opisuje technikę przeprowadzania testu przepływu zewnątrzkomórkowego na sferoidach 3D wygenerowanych z kohodowli komórek raka trzustki (Patu8902) i aktywowanych fibroblastów trzustki (PS1) w celu zmierzenia dwóch głównych szlaków produkcji energii, glikolizy i oddychania mitochondrialnego.

Test strumienia zewnątrzkomórkowego w sferoidach 3D: metoda pomiaru aktywności metabolicznej sferoid guza trzustki

Tutaj opisana jest metoda przygotowania trójwymiarowej (3D) sferoidalnej kokultury komórek raka trzustki i fibroblastów, a następnie pomiaru funkcji metabolicznych za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Otrzymywanie i oznaczanie metaboliczne 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów

Naszym celem było opracowanie praktycznego protokołu do oceny dysfunkcji mitochondriów związanych ze zmęczeniem u pacjentów z rakiem. Ten innowacyjny protokół jest zoptymalizowany do użytku klinicznego, obejmującego tylko standardową flebotomię i podstawowe procedury laboratoryjne.

Ocena roli funkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Powstaje nowy trójwymiarowy model sferoidalny oparty na heterotypowym oddziaływaniu komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu. Tutaj prezentujemy kokulturę komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną w celu wizualizacji powstawania sferoid. Ten trójwymiarowy model stanowi istotną platformę do badania interakcji między guzem a zrębem i testowania terapii przeciwnowotworowych.

Nowatorski, modulowany fibroblastami zrębu model sferoidalny 3D guza do badania interakcji guz-zręb i odkrywania leków

Brakuje kompleksowych modeli in vitro, które wiernie odwzorowują daną chorobę ludzką. Obecne badanie przedstawia trójwymiarowe (3D) tworzenie i hodowlę sferoidów guza, wiarygodne narzędzie in vitro do badania interakcji guz-zręb w ludzkim raku wątrobowokomórkowym.

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

W tym miejscu tworzymy platformę profilowania metabolicznego integrującą trójwymiarowe (3D) sferoidy glejaka i normalizację opartą na obrazowaniu za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Podejście to umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi metabolicznych guza na leczenie farmakologiczne i zapewnia wgląd w potencjalne mechanizmy oporności.

Postępy w profilowaniu metabolicznym trójwymiarowych sferoid guza mózgu do badań przesiewowych leków

Poznaj metodę oceny zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc. Technika ta umożliwia badanie aktywacji CAF i ich wpływu na rozwój nowotworu.

Ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc

Przeglądaj więcej filmów