Termoobrazownik o żywotności fluorescencji do zastosowań biomedycznych
7 kwietnia 2023
Ten artykuł opisuje użycie nowego, szybkiego imagera optycznego do makroskopowego obrazowania czasu życia fotoluminescencji próbek emitujących długie rozpady. Opisano procedury integracji, akwizycji i analizy obrazu, a także przygotowanie i charakterystykę materiałów sensorów do obrazowania oraz zastosowania imagera w badaniu próbek biologicznych.
Nasz protokół zapewnia szczegółowe mapowanie 2D czasu życia fosforescencji i stężenia tlenu w obiektach makroskopowych, w szczególności w żywych tkankach zwierzęcych i całych zwierzętach, za pomocą dedykowanych sond i materiałów pomiarowych. Informacje te są ważne dla wielu obszarów badań. Nasz protokół wykorzystuje zintegrowany i kompaktowy moduł obrazowania, który działa w trybie TCSPC i zapewnia łatwą i dokładną wizualizację żywotności i dystrybucji tlenu w złożonych próbkach biologicznych, takich jak żywe tkanki.
Weź adapter Cricket i sprawdź go z różnych stron. Zdejmij adapter C-mount z przodu, aby pokazać wzmacniacz Photonis PP0360EF umieszczony w Cricket, a następnie włóż adapter C-mount z powrotem. Zdejmij adapter C-mount z przodu Cricketa i włóż filtr emisji 650 plus/minus 50 nanometrów.
Napraw to, wkładając z powrotem C-mount. Następnie podłącz moduł kamery TPX z trzema krzywkami z tyłu modułu Cricket za pomocą adapterów pierścieniowych. Podłącz obiektyw do przedniej części modułu Cricket za pomocą adaptera C-mount.
Podłącz diodę LED do zasilacza i generatora impulsów. Teraz zamontuj super jasną diodę LED o długości 390 nm na słupku przymocowanym do płytki stykowej wewnątrz czarnej skrzynki. Włącz diodę LED i ustaw na niej ostrość, aby zapewnić skuteczne i równomierne wzbudzenie obrazowanej próbki.
Zamontuj zespół kamery na górze czarnej skrzynki optycznej skierowanej w dół w kierunku stolika, na którym próbki będą obrazowane. Podłącz kamerę i diodę LED do dwuimpulsowych generatorów i czterokanałowego oscyloskopu. Korzystając z ustawień oscyloskopu i generatorów impulsów, zsynchronizuj impulsy wysyłane do kamery i diody LED.
Użyj specjalnego i gniazda w urządzeniu Cricket, aby podłączyć wzmacniacz do standardowego źródła zasilania i ustawić wzmocnienie na 2.7 wolta. Umieść próbkę przed obiektywem aparatu. Następnie włącz kamerę i wszystkie moduły elektryczne, z wyjątkiem wzmacniacza.
Aktywuj oprogramowanie SOFI, aby dostroić parametry operacyjne, takie jak ustawianie ostrości i wyrównanie próbki. W modułach ustaw ekspozycję klatki na 0.01 sekundy. Wybierz opcję Nieskończona liczba klatek i ustaw tryb działania pikseli na przekroczenie progu.
Następnie przejdź do Podglądu i wybierz Aktywny moduł, aby otworzyć okno ramek Medipix/Timepix. W kolejnym kroku, po rozpoczęciu nagrywania, dostosuj skalę kolorów i obróć obraz do żądanej orientacji. Następnie wyłącz światła w pomieszczeniu i włącz wzmacniacz.
Ustaw ostrość optykę kamery na stoliku próbki dzięki możliwościom ustawiania ostrości obiektywu i adaptera Cricket, aby generować wyraźne obrazy próbek o dobrym kontraście i jasności. Po zakończeniu ustawiania ostrości zamknij oprogramowanie SOFI. Następnie przejdź do terminala, wykonaj polecenia niestandardowego oprogramowania, aby uzyskać surowe dane w formacie binarnym i zamknij terminal.
Otwórz nowy terminal, aby przetworzyć pozyskane dane. Załaduj plik danych i uruchom reduktor danych. Analizuj dane po przetworzeniu za pomocą dedykowanego programu napisanego w języku C, który zapisze dane do pliku obrazu ICS.
Następnie otwórz pliki obrazów ICS za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania Time Resolution Imaging i użyj dwóch funkcji wykładniczych, aby dopasować rozpady fosforescencji. Na koniec otwórz Dopasowane. ICS z dostępnym oprogramowaniem do analizy obrazu.
Generuj obrazy czasu życia fosforescencji za pomocą tabel przeglądowych i koduj je w pseudo skali kolorów. Użyj funkcji Miara, aby obliczyć średnie wartości czasu życia dla całego obrazu lub obszarów zainteresowania. Przedstawiono obrazy mikroskopowe intensywności fosforescencji i czasu życia fosforescencji plamki czujnika barwnika oktaetyloporfiryny platyny w stanach natlenionym i odtlenionym.
Upewnij się, że wewnątrz Cricketa zamontowany jest odpowiedni filtr emisyjny i używana jest odpowiednia dioda LED, połączenia kablowe i ustawienia impulsów. Obecnie protokół ten jest ograniczony do modeli zwierzęcych, ale potencjalnie może być stosowany do diagnozowania i leczenia stanów patologicznych związanych z niedotlenieniem tkanek, takich jak rak, udar i stan zapalny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowy obrazownik optyczny zaprojektowany do makroskopowego obrazowania czasu życia fotoluminescencji, szczególnie przydatny w przypadku próbek biologicznych, takich jak żywa tkanka zwierzęca. Protokół ten umożliwia szczegółowe mapowanie czasu życia fosforescencji oraz stężenia tlenu, co jest kluczowe dla zrozumienia różnych procesów biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Obrazowanie biologiczne
- Analiza czasu życia fosforescencji
- Pomiar stężenia tlenu
Wstęp
- Obrazowanie makroskopowe jest niezbędne do badania złożonych próbek biologicznych.
- Istniejące metody mogą nie analizować efektywnie próbek ulegających długotrwałemu rozkładowi.
- Celem niniejszych badań jest ulepszenie technik wizualizacji w żywych tkankach.
Zastosowane metody
- Obrazowanie optyczne w trybie korelacji pojedynczych fotonów w czasie (TCSPC)
- Zastosowanie w tkankach żywych zwierząt
- Wykorzystanie specjalnie zaprojektowanych modułów obrazowania i oprogramowania do przetwarzania danych
Główne wyniki
- Efektywna wizualizacja czasu życia i rozkładu tlenu
- Zdolność do generowania obrazów czasu życia fosforescencji o wysokim kontraście
- Skuteczne zastosowanie w obserwacji warunków hipoksyjnych w tkance
Wnioski
- Badanie prezentuje innowacyjne podejście do obrazowania w badaniach biologicznych.
- Potencjalne zastosowania w diagnostyce i leczeniu schorzeń związanych z hipoksją tkanek.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe mapowanie natlenienia tkanek przy użyciu obrazowania czasu życia fosforescencji odpowiada na krytyczną potrzebę dokładnej oceny hipoksji w badaniach przedklinicznych. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w modelowaniu chorób i wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego przy walidacji celów w onkologii i badaniach metabolicznych. Szybkie, wysokoczułe obrazowanie tej platformy umożliwia rzetelną ocenę mikrośrodowisk tkankowych, co dostarcza istotnych informacji przy podejmowaniu decyzji dotyczących portfela projektów we wczesnych fazach badań.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę utlenowania tkanek jako funkcjonalnego biomarkera w modelach chorób.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie danych o niedotlenieniu z rozdzielczością przestrzenną w tkankach żywych i ex vivo.
- Ułatwia walidację celu poprzez powiązanie rozkładu tlenu z aktywnością ścieżek biologicznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zwalidowane modele tkankowe do dalszego przesiewania związków w kontrolowanych stanach natlenienia.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary czasu życia dla standaryzacji testów.
- Umożliwia wysokoprzepustową analizę dzięki skróceniu czasu obrazowania do mniej niż 20 sekund na próbkę.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele przedkliniczne do sygnatur niedotlenienia istotnych dla danej choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera obrazowanie metaboliczne zarówno w układach ex vivo, jak i w żywych organizmach zwierzęcych.
- Zapewnia ilościowe punkty końcowe dla dostosowanego do ryzyka rozwoju kandydatów na leki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta platforma obrazowania integruje procesy od wczesnego etapu odkrywania po walidację przedkliniczną, wspierając cykle pracy w zakresie walidacji celu, identyfikacji związków wiodących oraz badań translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów zależnych od tlenu w modelach tkankowych.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzowane, ilościowe odczyty dla opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Generuje ilościowe mapy czasu życia i stężenia tlenu z rozdzielczością przestrzenną do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy etapy odkryć i fazy przedkliniczne poprzez zestawianie wyników obrazowania z istotnymi dla choroby biomarkerami hipoksji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułową, rekonfigurowalną możliwość obrazowania, którą można dostosować do różnych sond i systemów tkankowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach chorób indukowanych hipoksją.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybkie, powtarzalne obrazowanie dzięki standaryzowanym protokołom i elastycznej kompatybilności sond.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz alokację kapitału poprzez dostarczenie wiarygodnych punktów końcowych analizy ilościowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane dane dotyczące natlenienia tkanek.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie obrazowania optycznego i analizy czasu życia fosforescencji.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury, w tym kamer z funkcją TCSPC i wzmacniaczy obrazu.
- Wymaga standaryzacji protokołów obrazowania i schematów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Możliwość dostosowania do różnych modeli tkanek i chemii sond przy odpowiedniej konfiguracji.
- Obecnie ograniczone do modeli zwierzęcych; rozszerzenie na inne systemy wymaga dalszej walidacji.
