Ludzkie komórki podobne do mikrogleju: różnicowanie z indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi i test fagocytozy żywych komórek in vitro przy użyciu ludzkich synaptosomów

Mikroglej pochodzący z iPS stanowi biologicznie istotne źródło ludzkiego mikrogleju do eksperymentów in vitro i jest ważnym narzędziem do badania biologii mikrogleju w zdrowiu i chorobie. Przedstawiamy prosty protokół różnicowania mikrogleju, który wymaga minimalnego użycia czynników wzrostu i osiąga wysoką czystość i plon. Demonstrujemy również w pełni humanizowany test fagocytozy.

Komórki mikrogleju pochodzące z iPSC są bardzo wrażliwe na parowanie pożywki. Należy unikać korzystania ze studzienek w rogu płytki do hodowli komórkowej i napełnić wszystkie puste studzienki wodą, aby poprawić przeżywalność. Gdy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub iPSC osiągną 80% konfluencji, dysocjuj kolonie, przemywając jednym mililitrem DPBS i dodając jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Usuń kolonie za pomocą podnośnika komórkowego, wielokrotnie zeskrobując, aby utworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Zebrać zawiesinę i przenieść ją do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej dziewięć mililitrów DPBS. Następnie odwirować komórki w temperaturze 500 razy g przez jedną minutę, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w jednym mililitrze pożywki Embryoid Body (EB).

Weź 10 mikrolitrów komórek i rozcieńcz jeden do dwóch błękitem trypanowym. Policz komórki na hemocytometrze i na podstawie liczby komórek rozcieńczyć zapas komórek do końcowego rozcieńczenia 10 000 komórek na 100 mikrolitrów. W przypadku posiewu komórek dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonych komórek na studzienkę do 96-dołkowej płytki okrągłodennej o niskiej przyczepności.

Odwirować płytkę w temperaturze 125 razy g przez trzy minuty i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez cztery dni. Drugiego dnia, używając pipety wielokanałowej, zastąp starą pożywkę połówkową EB świeżą pożywką. Aby wygenerować prymitywne prekursory makrofagów lub PMP, pokryj studzienki sześciodołkowej płytki, dodając jeden mililitr lodowatego roztworu powlekającego Matrigel.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny lub przez noc. W czwartym dniu różnicowania EB, za pomocą jednomililitrowej końcówki do pipety, przenieś EB do studzienek pokrytych Matrigelem. Pipetować w górę iw dół, aby usunąć EB z dołka.

Następnie przytrzymaj płytkę przechyloną, aby EB mogły osiąść na krawędzi studni. Gdy wszystkie EB osiądą, delikatnie odpipetuj i wymień starą pożywkę, trzymając EB na krawędzi studzienki z trzema mililitrami świeżo przygotowanej pożywki PMP complete. Równomiernie rozprowadź komórki w dołkach, ręcznie przesuwając płytkę na boki i od tyłu do przodu.

Następnie inkubuj płytkę przez siedem dni, aby EB mogły przyczepić się do dna studzienki. Po siedmiu dniach sprawdź EB pod mikroskopem pola świetlnego przy czterokrotnym powiększeniu, aby upewnić się, że są przymocowane do dna studzienek. Wykonaj połówkową zmianę pożywki, a w 21 dniu zastąp całe podłoże trzema mililitrami kompletnej pożywki PMP.

W 28 dniu poszukaj w supernatancie okrągłych komórek określanych jako PMP. Następnie zebrać pożywkę zawierającą PMP za pomocą 10-mililitrowej pipety i automatycznego pipetera, nie naruszając EBs. Przenieś PMP w pożywce do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Odwirować zebrane PMP w ilości 200 razy g przez cztery minuty i odessać supernatant przed ponownym zawiesieniem go w jednym do dwóch mililitrów komórek podobnych do mikrogleju lub pożywki podstawowej IMG. Następnie policz komórki na hemocytometrze, jak opisano wcześniej. Odwirować resztę komórek i rozcieńczyć PMP do pożądanego stężenia.

Następnie poszczepić komórki z gęstością od 10 do 5 komórek na centymetr kwadratowy na płytkach poddanych działaniu hodowli komórkowych przy użyciu świeżo przygotowanego kompletnego podłoża IMG. W przypadku testu fagocytozy żywych komórek należy podawać 20 do 30 razy od 10 do czwartego PMP na 96-dołkową płytkę i 100 mikrolitrów kompletnej pożywki IMG i obserwować proces różnicowania przez 10 dni. W dniu testu usunąć 40 mikrolitrów pożywki z dołka i dodać 10 mikrolitrów roztworu do barwienia jądrowego.

Inkubuj płytkę przez dwie godziny. Rozmrozić znakowane synaptosomy na lodzie i delikatnie sonikować za pomocą sonikatora wodnego przez jedną minutę. Ponownie natychmiast umieść synaptosomy na lodzie.

Rozcieńczyć znakowane synaptosomy w kompletnej pożywce IMG w jednym mikrolitrze synaptosomów na 50 mikrolitrów pożywki. W celu kontroli ujemnej należy przygotować 60 mikromolową cytochalazynę D w kompletnym pożywce IMG, aby zahamować polimeryzację aktyny, a tym samym fagocytozę. Następnie dodaj 10 mikrolitrów tego roztworu do każdej studzienki do końcowego stężenia 10 mikromoli i inkubuj przez 30 minut.

Wyjąć płytkę z inkubatora i inkubować w temperaturze 10 stopni Celsjusza przez 10 minut. Utrzymuj płytkę na lodzie i dodaj 50 mikrolitrów pożywki zawierającej synaptosomy. Odwirować płytkę o ciśnieniu 270 razy g przez trzy minuty w temperaturze 10 stopni Celsjusza i utrzymywać płytkę na lodzie aż do uzyskania obrazowania.

Włóż płytkę do czytnika obrazowania żywych komórek i wybierz studzienki do analizy. Następnie wybierz obiektyw 20X. Następnie dostosuj ostrość, diodę elektroluminescencyjną lub diodę LED, intensywność, czas integracji i wzmocnienie kanałów jasnego pola i niebieskiego.

Fluorescencja synaptosomów powinna być znikoma w początkowym punkcie czasowym. Wybierz liczbę pojedynczych płytek, które mają zostać pozyskane w montażu na studzienkę. Zdobądź 16 pól w środku studni, obrazując około 5% całkowitej powierzchni studni.

Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza i żądany przedział czasu dla obrazowania. Następnie otwórz oprogramowanie do analizy. Następnie otwórz eksperyment zawierający obrazy i kliknij ikonę Redukcja danych.

W menu wybierz opcję Imaging Stitching (Łączenie obrazowe) w obszarze Imaging Processing (Przetwarzanie obrazu), aby utworzyć kompletny obraz z pojedynczych kafelków cztery na cztery w montażu z parametrami opisanymi w rękopisie tekstowym. Zdefiniuj próg intensywności przy użyciu kanałów DAPI i RFP dla tych obrazów. Otwórz obraz i kliknij Analizuj.

W obszarze Analiza wybierz pozycję Analiza komórkowa, a następnie w obszarze Kanał wykrywania wybierz zszyty obraz w kanałach DAPI lub RFP. Następnie przejdź do zakładki Maska podstawowa i liczba i ustal wartość progową oraz wartości rozmiaru obiektu, które prawidłowo wybierają jądra komórkowe w kanale DAPI lub sygnał synaptosomu w kanale RFP. Aby policzyć liczbę jąder, przejdź do menu Redukcja danych, a następnie w obszarze Analiza obrazu wybierz opcję Analiza komórkowa.

Ponownie przejdź do zakładki Maska podstawowa i liczba, a następnie w obszarze Kanał wybierz zszyte obrazy DAPI i użyj parametrów opisanych w rękopisie tekstowym. Następnie przejdź do karty Metryki obliczeniowe i wybierz pozycję Liczba komórek. Następnie, aby uzyskać obszar sygnału synaptosomu, przejdź do menu Redukcja danych i w obszarze Analiza wybierz Analiza komórkowa.

Ponownie przejdź do zakładki Maska podstawowa i liczba, a następnie w obszarze Kanał wybierz obrazy zszyte w zapytaniu ofertowym i użyj parametrów wyszczególnionych w rękopisie tekstowym. Następnie przejdź do zakładki Metryki obliczeniowe i wybierz pozycję Obszar sumy obiektów. W zakładce Redukcja danych kliknij OK, aby umożliwić oprogramowaniu analizę wszystkich pozyskanych obrazów.

Po przeanalizowaniu obrazów wyeksportuj wartości Obiekt Suma powierzchni i Liczba komórek dla każdego punktu czasowego. Następnie podziel obszar sumy obiektów przez liczbę komórek, aby obliczyć znormalizowany obszar na punkt czasu. W przypadku porównywania wielu zabiegów lub genotypów oblicz wskaźnik fagocytozy za pomocą podanego równania.

Niezróżnicowane iPSC wykazują zwartą morfologię kolonii z dobrze zaznaczonymi krawędziami. Zdysocjowane iPSC utworzyły sferyczne agregaty zwane EB i rosną do czwartego dnia różnicowania. Kiedy EB są powlekane w celu wytworzenia PMP, przyczepiają się do płytek pokrytych Matrigelem, a warstwa komórek rozprzestrzenia się i otacza kuliste agregaty.

W 28 dniu w zawiesinie pojawiają się okrągłe komórki o dużym stosunku cytoplazmy do jądra. Zdecydowanie zaleca się hodowlę iPSC na płytkach powlekanych Laminin 521 zamiast Matrigel, ze względu na wyższą wydajność PMP w płytkach powlekanych Laminin 521. Po wystawieniu PMP na pożywkę IMG komórki uzyskują morfologię podobną do mikrogleju z małą cytoplazmą w obecności wydłużonych procesów.

Ponadto tożsamość mikrogleju zweryfikowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Zazwyczaj ponad 95% komórek wyraża IB1, a około 90% komórek wyraża P2RY12 i TMEM119. Analiza Western blot potwierdziła, że iPSC wywodzi dolne neurony ruchowe dla wyrażonych markerów synaptycznych ludzkich synaptosomów, synaptofizyny i białka o gęstości postsynaptycznej 95.

W grupie kontrolnej w porównaniu z początkowym punktem czasowym, po 10 godzinach, sygnał czerwonej fluorescencji był silny, ponieważ większość synaptosomów została pochłonięta i była zlokalizowana w kwaśnych przedziałach wewnątrzkomórkowych. W IMG leczonych cytochalazyną D silne zmniejszenie czerwonego sygnału przez zero i 10 godzin wskazywało, że wykryty sygnał wynika ze zdarzeń fagocytarnych. Powierzchnia pochłoniętych synaptosomów zwiększała się z czasem, aż do 16 godzin.

Jednak obszar czerwonego sygnału z komórek leczonych cytochalazyną D nie zwiększył się z czasem. Komórki podobne do mikrogleju pochodzące z iPS mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań, w tym do fagocytozy i odpowiedzi zapalnej w badaniu chorób neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych.