Nadwrażliwość kontaktowa jako mysi model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry

Przedstawiona tu obiektywna metoda laboratoryjna może pomóc w badaniu reakcji nadwrażliwości kontaktowej u myszy, która naśladuje alergiczne kontaktowe zapalenie skóry u ludzi. Reakcję nadwrażliwości kontaktowej można zmierzyć nie tylko za pomocą obrzęku ucha, ale także za pomocą różnych testów laboratoryjnych, które pozwalają na badanie mechanizmów komórkowych biorących udział w tej reakcji. Model nadwrażliwości w bardziej kontaktowym kontakcie może testować różne czynniki środowiskowe i nowe substancje, aby pokazać, czy badane czynniki modulują odpowiedź immunologiczną zależną od limfocytów T, co można wykorzystać do wdrożenia nowych terapii.

Zacznij od ogolenia skóry myszy żyletką i oznaczenia łapy. Sześć godzin przed indukcją nadwrażliwości kontaktowej lub CHS nałóż szare mydło z wodą i ogol dwucentymetrowy kwadratowy obszar na klatce piersiowej i brzuchu myszy. Tego samego dnia należy uczulić myszy, nakładając 150 mikrolitrów świeżo przygotowanego 5% haptenu na wcześniej ogolone miejsce.

W myszy sterującej zastosuj tylko pojazd. Osusz miejsce haptenu przez 30 sekund przed umieszczeniem zwierzęcia z powrotem w klatce. Czwartego dnia zmierz grubość ucha znieczulonej myszy za pomocą mikrometru o godzinie zero przez obserwatora nieświadomego grup eksperymentalnych.

Następnie nałóż 10 mikrolitrów świeżo przygotowanego 04%haptenu po obu stronach uszu w grupie testowej i kontrolnej i pozostaw do wyschnięcia na 30 sekund. W piątym dniu, 24 godziny po poprzedniej aplikacji 0,4% haptenu, powtórz pomiar grubości ucha dla pomiaru 24-godzinnego. 24 godziny po pomiarze grubości ucha, gdy mysz jest jeszcze w głębokim znieczuleniu, odetnij uszy jak najbliżej czaszki za pomocą nożyczek.

Po dystalnej stronie uszu wykonaj stempel o średnicy sześciu milimetrów za pomocą stempla do biopsji. Zmierz masę każdej biopsji ucha na wadze analitycznej i wyraź ją w miligramach. W przypadku testu mieloperoksydazy lub MPO należy umieścić biopsje ucha w dwumililitrowej probówce wirówkowej z kulkami ze stali nierdzewnej i dodać 500 mikrolitrów przygotowanego buforu.

Homogenizować biopsje przez 10 minut w homogenizatorze, a następnie schładzać próbkę przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza przed ponownym homogenizowaniem przez 10 minut. Wyjmij kulki po homogenizacji biopsji. Zamrozić homogenaty w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Rozmrozić i zwirować próbki, a następnie powtórzyć procedurę homogenizacji i zamrażania trzy razy. Po zakończeniu odwirować homogenat o sile 3 000 G przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zebrać supernatant za pomocą pipety, aby zmierzyć aktywność MPO i wyrazić ją w jednostkach na jeden miligram białka.

Aby wykonać test przepuszczalności naczyń krwionośnych, uczulij myszy w dniu zero, a w czwartym dniu bezpośrednio prowokuj, nakładając hapten na uszy, korzystając z wcześniej wspomnianej procedury. 23 godziny później wstrzyknij dożylnie 8,3 mikrolitra na gram masy ciała 1% niebieskiego barwnika Evansa w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco lub DPBS znieczulonej myszy. Po godzinie ponownie znieczulij mysz, aby pobrać biopsję ucha, jak opisano wcześniej.

Aby wyekstrahować barwnik z tkanki, inkubuj biopsje w probówkach zawierających jeden mililitr formamidu w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla przez 18 godzin. Po pobraniu biopsji ucha, gdy mysz jest jeszcze w głębokim znieczuleniu, usuń gałkę oczną pęsetą. Delikatnie naciskaj na mysz i pobieraj krew z zatoki zadoczodołowej do probówki w celu pobrania surowicy.

Odwróć probówkę sześć razy i odczekaj 30 minut, aż krew zacznie krzepnąć. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 1 300 do 2 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Uczulić myszy dawcy haptenem TNCB w dniu zero, stosując wcześniej wspomnianą procedurę Czwartego dnia, po dezynfekcji skóry, odizoluj pachowe i pachwinowe węzły chłonne lub ALN od znieczulonej myszy za pomocą kleszczy, a następnie wyizoluj śledzionę.

Rozgnieć tkankę między oszronionymi końcami dwóch szkiełek mikroskopowych i przepuść zawiesinę komórek przez sitko do komórek o wielkości porów 70 mikrometrów. Następnie umyj komórki DPBS uzupełnionym 1% płodową surowicą bydlęcą i odwiruj je w temperaturze 300 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić pozostałą osadkę komórkową w jednym do pięciu mililitrów DPBS.

Przygotuj mieszaninę 1:1 ALN i śledziony, aby osiągnąć stężenie do 7,0 razy 10 do siódmych komórek w 200 mikrolitrach DBPS przed dożylnym wstrzyknięciem mieszaniny komórek efektorowych CHS znieczulonej myszy. Zmierz grubość ucha o godzinie zero i po 24 godzinach od wyzwania. Dane wykazały, że myszy uwrażliwione na TNCB i prowokowane w uszach cztery dni później rozwinęły znacznie zwiększony obrzęk uszu w porównaniu z myszami kontrolnymi uczulonymi pozorowanymi, a następnie podobnie uproszczonymi.

Wzrost obrzęku ucha w grupie testowej skutkował zwiększoną masą ucha, aktywnością MPO, stężeniem interferonu gamma w ekstraktach z uszu, zmianami obrzęku skóry właściwej w badaniu histologicznym i przepuszczalnością naczyń usznych Przeciwciała IgG1 specyficzne dla TNP były podwyższone w surowicy badanych myszy w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Zwierzęta, które otrzymały komórki efektorowe CHS od dawców uprzednio uczulonych na TNCB, wykazywały znacznie zwiększony obrzęk uszu w porównaniu ze zwierzętami, które nie otrzymały komórek. Najbardziej krytycznym momentem jest wywołanie nadwrażliwości kontaktowej.

Roztwór haptenu jest bardzo lotny i wrażliwy na światło, dlatego należy go szybko nałożyć na skórę zwierząt. Dodatkowe badania można wykonać na wyizolowanych komórkach efektorowych. Na przykład można założyć hodowle komórkowe w celu oceny zdolności do proliferacji w obecności antygenów.