Name: Fluorescencyjne obrazowanie przyżyciowe w celu zbadania dynamiki sygnalizacji wapniowej wywołanej obciążeniem w osteocytach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnego obrazowania przyżyciowego do badania dynamiki sygnalizacji wapniowej w osteocytach myszy podczas obciążenia mechanicznego. Technika ta umożliwia obserwację komórek w ich naturalnym środowisku 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Brak.

Wszystkie metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Cornella.
1. Przygotowanie materiałów i sprzętu
<ol>
	<li>Zaprojektuj i zbuduj urządzenie obciążające śródstopie do użytku z górnym mikroskopem wielofotonowym. 
	UWAGA: Szczegóły dotyczące specyfikacji komponentów i działania urządzenia są opisane w dokumentacji uzupełniającej poprzedniego badania25. Krótko mówiąc, główne komponenty składają się z siłownika połączonego szeregowo z ogniwem obciążnikowym i wspornikiem załadowczym, łaźni wodnej i sworznia podparcia. Siłownik i ogniwo obciążnikowe można dostać w sprzedaży i powinny być w stanie pomieścić obciążenia do 300 g. Łaźnia wodna, sworzeń podparcia i wspornik ładunku powinny być wykonane z tytanu lub stali nierdzewnej. Mogą być wytwarzane we własnym zakresie lub komercyjnie za pomocą druku 3D z metalu.</li>
	<li>Skalibruj wartości wielkości odkształcenia do przemieszczenia siłownika z wyprzedzeniem dla poszczególnych grup myszy (tj. płeć, leczenie, genotyp). Odbywa się to za pomocą mapowania odkształceń powierzchniowych w procedurze opisanej w poprzednim badaniu25.</li>
	<li>Użyj myszy z tłem C57BL / 6, w wieku 16-18 tygodni, które wyrażają fluorescencyjne konstrukty wskaźnika wapnia w osteocytach. Ukierunkowaną ekspresję osteocytów osiąga się poprzez krzyżowanie myszy GCaMP6f i Dmp1-Cre aktywowanych floksami. Szczegóły dotyczące strategii hodowlanych i dostawców myszy założycieli są opisane we wcześniej opublikowanym badaniu25.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, wspornik obciążenia, łaźnię wodną i sworzeń podparcia za pomocą autoklawu (57,2 °C, 15 psi, 3-4 min). Zdezynfekuj obiektywy mikroskopu 100% etanolem.</li>
	<li>Włącz komponenty elektroniczne, w tym źródło lasera, mikroskop, ogniwo obciążnikowe i siłownik. Odczekaj 15-20 minut, aby każdy składnik rozgrzał się przed obrazowaniem przyżyciowym.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że elementy siłownika i ogniwa obciążnikowego są połączone i aktywowane w urządzeniu sterującym. Generuj oprogramowanie sterujące za pomocą różnych platform, w tym Matlab, LabView i Python, zgodnie z preferencjami użytkownika. Główny kod Matlaba użyty w tym badaniu nazywa się Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (wewnątrz folderu MT3 Loading Device Control Software.zip Supplementary File 1). 
		UWAGA: Większość dostępnych na rynku mikroskopów dwufotonowych jest dostarczana z solidnym oprogramowaniem do obrazowania. Kluczowymi cechami wymaganymi dla tej metody są możliwość dostrojenia lasera do odpowiedniego wzbudzenia dla GCaMP6f (920 nm), możliwość regulacji natężenia mocy lasera oraz zbiór szeregów czasowych o częstotliwości co najmniej 6 Hz. Przed przystąpieniem do eksperymentów należy potwierdzić połączenie lasera z oprogramowaniem do obrazowania oraz odpowiedni układ ścieżki światła dla obrazowania dwufotonowego. Jest to potwierdzane na różne sposoby w zależności od konfiguracji obrazowania. Zwykle jest to wskaźnik świetlny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Chirurgia
<ol>
	<li>Przygotuj etap chirurgiczny i wysterylizuj powierzchnię 70% etanolem. Upewnij się, że podczas zabiegów chirurgicznych stosowane są techniki aseptyki. Utrzymuj poziom czystości wymagany dla tego protokołu, ponieważ jest to procedura terminalna.</li>
	<li>Znieczulić mysz odparowanym izofluranem zmieszanym z powietrzem lub tlenem klasy medycznej o natężeniu przepływu 1 l/min. Przeprowadzić wstępne znieczulenie w komorze indukcyjnej dla gryzoni za pomocą 3%-5% izofluranu. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1%-2,5% izofluranu w stożku nosowym do zabiegów obrazowania chirurgicznego i przyżyciowego.</li>
	<li>Umieść urządzenie grzewcze pod myszą lub obok niej, aby pomóc w utrzymaniu homeostatycznej temperatury ciała. Monitoruj temperaturę ciała myszy, tętno i saturację tlenem przez cały czas trwania operacji. Utrzymuj częstość oddechów między 60-80 oddechami na minutę i utrzymuj ją, dostosowując dawkę izofluranu.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej. Potwierdź głębokość znieczulenia przed nacięciem za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Zidentyfikuj lokalizację między drugą a trzecią kością śródstopia. Wykonaj nacięcie skalpela przez skórę właściwą między drugą a trzecią kością śródstopia, zaczynając od dystalnego końca i postępując proksymalnie wzdłuż długości kości (~5 mm). 
	UWAGA: Kości śródstopia są dystalne do kości skokowych na łapie i biegną bezpośrednio proksymalnie do dystalnych paliczków. Składają się z kości śródstopia (przyśrodkowej do bocznej) I, II, III, IV i V. Trzecia kość śródstopia jest wyśrodkowana pośrodku zgiętej części tylnej łapy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy otwórz pole operowane, pociągając skórę w kierunku krawędzi przyśrodkowych/bocznych. Wytnij ścięgna prostowników za pomocą prostych nożyczek Vannas, aby odsłonić trzecią kość śródstopia.</li>
	<li>Włożyć środkowy sworzeń podparcia urządzenia obciążającego kość śródstopia pod trzecią kość śródstopia.
	<ol>
		<li>Początkowo włóż szpilkę w małą przestrzeń na dystalnym końcu, gdzie trzecia kość śródstopia styka się z bliższym paliczkiem, a następnie przesuń szpilkę proksymalnie, aż spocznie na środku trzonu trzeciej kości śródstopia.</li>
		<li>Zachowaj szczególną ostrożność, aby zagwarantować bezpośrednie połączenie między kością a szpilką, z wyłączeniem wszelkich mięśni i powięzi. Ma to kluczowe znaczenie dla stabilnego obrazowania podczas ładowania protokołów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chwyć kostkę kleszczami i umieść stopę w łaźni wodnej wypełnionej solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco (8-10 ml). Zamocuj łapę na miejscu za pomocą wspornika załadowczego i podłącz wspornik do układu siłownika/ogniwa obciążnikowego. Ukończone przygotowanie chirurgiczne i rozmieszczenie w urządzeniu jest pokazane na <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
UWAGA: Kompletny zestaw mikroskopii dwufotonowej używany w tym protokole ma dwa pakiety oprogramowania: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 dla lasera (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) i ThorImageLS4.0 dla mikroskopu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Aby wykonać obraz na dwufotonie, naciśnij Live (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3, niebieski przycisk odtwarzania). Przeprowadzając eksperyment w celu zobrazowania i zapisania danych, naciśnij przycisk przechwytywania (Rysunek 3, zakładka u góry, obok opcji Ustawienia przechwytywania). Są one specyficzne dla sprzętu i dostawców użytych w tym eksperymencie, ale wiele alternatyw z niezbędnymi specyfikacjami znajdującymi się w tym protokole (długości fal wzbudzenia, rozmiar widocznego okna, szybkość przechwytywania obrazu itp.) również by działało.
<ol>
	<li>Bardzo ostrożnie podnieś zestaw urządzenia ładującego za pomocą myszy i umieść go na platformie mikroskopu.</li>
	<li>Zacznij od obiektywu o małym powiększeniu w trybie epifluorescencji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3, menu rozwijane u góry z opcjami Multiphoton lub Fluorescence Setup), aby zlokalizować i wyśrodkować środkowy trzon kości.</li>
	<li>Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania przełącz się na większe powiększenie obiektywu zanurzonego w wodzie (20x-40x) i przełącz optykę na dwufotonową (<silna klasa="xfig">Rysunek 3, menu rozwijane u góry z opcjami Ustawienia wielofotonowe lub fluorescencyjne). 
	UWAGA: Zalecany rozmiar pola widzenia to co najmniej 250 μm x 250 μm dla aktywności komórkowej i można go uzyskać z zoomem optycznym lub cyfrowym, w zależności od systemu obrazowania.
	<ol>
		<li>Odpowiednia minimalna gęstość pikseli to 512 x 512 pikseli. Aby ustawić gęstość pikseli, użyj ustawień Galvo/Resonance Area Control (Rysunek 3).</li>
		<li>Szukając zwrotu z inwestycji, unikaj fotowybielania, zmniejszając moc za pomocą opcji Power Control (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3) i zwiększając wzmocnienie PMT w ustawieniach Galvo/Resonance Scanner Control (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3).</li>
		<li>Zidentyfikuj powierzchnię kości w trybie dwufotonowym, szukając włóknistej autofluorescencji okostnej w zielonym kanale, który wykorzystuje filtr pasmowoprzepustowy wyśrodkowany na 525 nm. 
		UWAGA: Autofluorescencja jest najbardziej widoczna przy długości fali wzbudzenia 1,000 nm, ale jest również dostępna przy wzbudzeniu 920 nm (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3, Sterowanie laserem wielofotonowym). Ten punkt orientacyjny jest ważny dla określenia względnej głębokości ROI w korze śródstopia podczas obserwacji osteocytów. Należy zauważyć, że podczas eksperymentów z szeregami czasowymi dokładna głębokość obrazowanej płaszczyzny nie jest rejestrowana, chociaż zwykle waha się ona w granicach 15-30 μm. Jeśli pożądane są dokładne pomiary głębokości, konieczne byłoby wykonanie stosu z.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź testowe ładowanie próbne, aby upewnić się, że przygotowanie chirurgiczne i ustawienie w urządzeniu ładującym skutecznie osiągnęły stabilne pole zwrotu z inwestycji (tj. brak przemieszczenia w płaszczyźnie Z). Krótko mówiąc, uruchom cykl ładowania, aby ocenić stabilność preparatu chirurgicznego. Wykonaj ładowanie, uruchamiając sekcję Switch on Servo and Move w kodzie Matlaba.
	<ol>
		<li>Zastosuj niewielką tarę. Upewnij się, że odpowiednie protokoły ładowania fal haversine są przygotowane z wyprzedzeniem. Wprowadzić odpowiednie parametry obciążenia uzyskane podczas kalibracji w ppkt 1.2. Wykonaj ładowanie, uruchamiając sekcję Switch on Servo and Move w kodzie Matlaba.</li>
		<li>Jeśli na ekranie widoczny jest ruch komórek, który wynika z mikroruchów kości w odpowiedzi na obciążenie lub oddychanie, wybierz inny zwrot z inwestycji wzdłuż kierunków y lub z, aby upewnić się, że znajduje się on bezpośrednio nad środkowym kołkiem podparcia. Jeśli ruch nie ustąpi, należy ręcznie wyregulować chirurgiczne ułożenie szpilki pod trzecią kością śródstopia. 
		UWAGA: Dobry obszar zainteresowania (ROI) to taki, w którym komórki nie poruszają się w płaszczyźnie/ognisku ani poza nią. Ruch w kierunkach x i y można dostosować do przetwarzania końcowego za pomocą wtyczki do dopasowywania szablonów w ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić obrazowanie stosu Z lub serii t z obciążeniem zgodnie z projektem eksperymentalnym, aby rejestrować odpowiednio morfometryczne lub dynamiczne zdarzenia sygnalizacyjne wywołane obciążeniem.
	<ol>
		<li>Ustaw długość fali wzbudzenia dla wskaźnika fluorescencyjnego (np. 920 nm dla GCaMP6f). W przypadku stosu z użyj wystarczająco niskiej rozdzielczości, aby uchwycić cechy osteocytów, takie jak kroki 0,25-1 μm. W przypadku serii t użyj ustawień, aby próbkować co najmniej 6 razy większą szybkość ładowania. W przypadku szybkości ładowania 1 Hz, obrazowanie z szybkością 6 klatek na sekundę (FPS) reprezentuje minimalnie odpowiednią szybkość przechwytywania (<silna klasa="xfig">Rysunek 3, Sterowanie skanerem Galvo/rezonansowym).</li>
		<li>W przypadku wczytywania i obrazowania na żywo zbieraj niezaładowane dane bazowe dla każdego ataku. W tym badaniu preferowane jest 60 s obrazowania bez obciążenia, a następnie 60 s ładowania i obrazowania. Zaprojektuj odpowiednio protokoły ładowania i obrazowania. Aby zebrać dane, naciśnij Capture (Rysunek 3, zakładka u góry, obok Capture Setup).
		<ol>
			<li>Okres refrakcji dla pełnej odpowiedzi sygnalizacyjnej wapnia w komórkach kostnych szacuje się na około 15 min28. Odczekaj co najmniej tyle czasu między sekwencyjnymi atakami ładowania podczas zbierania dynamicznych danych sygnalizacyjnych.</li>
			<li>Przez cały czas trwania eksperymentu nie należy pozostawiać zwierzęcia bez opieki, aby upewnić się, że nie obudzi się niespodziewanie ze znieczulenia lub nie doświadczy stresu bez możliwości interwencji. 
			UWAGA: Eutanazja na końcu procedury powinna być przeprowadzona poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub inne odpowiednie środki zgodnie z metodami zatwierdzonymi przez IACUC. Jest to protokół nieprzeżywalności, co oznacza, że wszystkie zwierzęta są poddawane eutanazji po obrazowaniu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lu, X. L., Huo, B., Park, M., Guo, X. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+response+in+osteocytic+networks+under+steady+and+oscillatory+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Calcium response in osteocytic networks under steady and oscillatory fluid.</a> Bone. 51 (3), 466-473 (2012).</li>
<li>Wu, D., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+adhesion+mediates+network+responses+to+physiological+stimulation+of+the+osteocyte+cell+process%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent adhesion mediates network responses to physiological stimulation of the osteocyte cell process.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12096-12101 (2013).</li>
<li>Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+in+the+osteocyte+mechanical+environment%3A+A+fluid-structure+interaction+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+in+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: A fluid-structure interaction approach.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 85-97 (2013).</li>
<li>Genetos, D. C., Kephart, C. J., Zhang, Y., Yellowley, C. E., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+fluid+flow+activation+of+gap+junction+hemichannels+induces+atp+release+from+MLO-Y4+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oscillating fluid flow activation of gap junction hemichannels induces atp release from MLO-Y4 osteocytes.</a> Journal of Cellular Physiology. 212 (1), 207-214 (2007).</li>
<li>Lu, X. L., Huo, B., Chiang, V., Guo, X. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocytic+network+is+more+responsive+in+calcium+signaling+than+osteoblastic+network+under+fluid+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Osteocytic network is more responsive in calcium signaling than osteoblastic network under fluid flow.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (3), 563-574 (2012).</li>
<li>Schaffler, M. B., Kennedy, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+signaling+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Osteocyte signaling in bone.</a> Current Osteoporosis Reports. 10 (2), 118-125 (2012).</li>
<li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+Wnt%2F+-Catenin+signaling+is+required+for+normal+bone+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteocyte Wnt/ -Catenin signaling is required for normal bone homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li>
<li>Kennedy, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+resorption+in+fatigue-loaded+bone+involves+both+apoptosis+and+active+pro-osteoclastogenic+signaling+by+distinct+osteocyte+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Activation of resorption in fatigue-loaded bone involves both apoptosis and active pro-osteoclastogenic signaling by distinct osteocyte populations.</a> Bone. 50 (5), 1115-1122 (2012).</li>
<li>Rawlinson, S. C. F., Wheeler-Jones, C. P. D., Lanyon, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arachidonic+acid+for+loading+induced+prostacyclin+and+prostaglandin+E2+release+from+osteoblasts+and+osteocytes+is+derived+from+the+activities+of+different+forms+of+phospholipase+A2%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Arachidonic acid for loading induced prostacyclin and prostaglandin E2 release from osteoblasts and osteocytes is derived from the activities of different forms of phospholipase A2.</a> Bone. 27 (2), 241-247 (2000).</li>
<li>David, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+bone+formation+in+bovine+trabecular+bone+cultured+in+a+dynamic+3D+bioreactor+is+enhanced+by+compressive+mechanical+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Ex vivo bone formation in bovine trabecular bone cultured in a dynamic 3D bioreactor is enhanced by compressive mechanical strain.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (1), 117-126 (2008).</li>
<li>Davies, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+loaded+ex+vivo+bone+culture+system+%26%2334%3BZetos%26%2334%3B%3A+systems+and+culture+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cell+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanically loaded ex vivo bone culture system &#34;Zetos&#34;: systems and culture preparation.</a> European Cell & Materials. 11, 57-75 (2006).</li>
<li>Adachi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+calcium+signaling+response+to+bone+matrix+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Osteocyte calcium signaling response to bone matrix deformation.</a> Journal of Biomechanics. 42 (15), 2507-2512 (2009).</li>
<li>Huo, B., Lu, X. L., Guo, X. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+calcium+wave+propagation+in+linear+and+circuit-like+bone+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+A%3A+Mathematical%2C+Physical+and+Engineering+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intercellular calcium wave propagation in linear and circuit-like bone cell networks.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 368 (1912), 617-633 (2010).</li>
<li>Morrell, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+induced+Ca2%2B+oscillations+in+osteocytes+release+extracellular+vesicles+and+enhance+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanically induced Ca2+ oscillations in osteocytes release extracellular vesicles and enhance bone formation.</a> Bone Research. 6, 6(2018).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+intracellular+calcium+oscillations+in+osteocytes+in+intact+mouse+long+bones+under+dynamic+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">In situ intracellular calcium oscillations in osteocytes in intact mouse long bones under dynamic mechanical loading.</a> FASEB Journal. 28 (4), 1582-1592 (2014).</li>
<li>Chen, T. -W., Wardill, T. J., Sun, Y., Pulver, S. R., Renninger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Jacobs, C. R., Temiyasathit, S., Castillo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+mechanobiology+and+pericellular+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Osteocyte mechanobiology and pericellular mechanics.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 369-400 (2010).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+properties+of+intracellular+calcium+signaling+in+osteocytic+and+osteoblastic+cell+networks+under+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal properties of intracellular calcium signaling in osteocytic and osteoblastic cell networks under fluid.</a> Bone. 53 (2), 531-540 (2013).</li>
<li>Thi, M. M., Suadicani, S. O., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensory+responses+of+osteocytes+to+physiological+forces+occur+along+processes+and+not+cell+body+and+require+%CE%B1V%CE%B23+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanosensory responses of osteocytes to physiological forces occur along processes and not cell body and require αVβ3 integrin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21012-21017 (2013).</li>
<li>Wang, Y., McNamara, L. M., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+role+of+integrins+in+flow+induced+mechanotransduction+in+osteyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A model for the role of integrins in flow induced mechanotransduction in osteyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15941-15946 (2007).</li>
<li>McNamara, L. M., Majeska, R. J., Weinbaum, S., Friedrich, V., Schaffler, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+osteocyte+cell+processes+to+the+bone+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Attachment of osteocyte cell processes to the bone matrix.</a> The Anatomical Record. 292 (3), 355-363 (2009).</li>
<li>Franz-Odendaal, T. A., Hall, B. K., Witten, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buried+alive%3A+How+osteoblasts+become+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Buried alive: How osteoblasts become osteocytes.</a> Developmental Dynamics. 235 (1), 176-190 (2005).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li>
<li>Lewis, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+calcium+signals+encode+strain+magnitude+and+loading+frequency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Osteocyte calcium signals encode strain magnitude and loading frequency in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11775-11780 (2017).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMP1-targeted+Cre+expression+in+odontoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes.</a> Journal of Dental Research. 86 (4), 320-325 (2007).</li>
<li>Rubin, C. T., Lanyon, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+strain+similarity+in+vertebrates%3B+an+alternative+to+allometric+limb+bone+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic strain similarity in vertebrates; an alternative to allometric limb bone scaling.</a> Journal of Theoretical Biology. 107 (2), 321-327 (1984).</li>
<li>Jacobs, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+steady+versus+oscillating+flow+on+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Differential effect of steady versus oscillating flow on bone cells.</a> Journal of Biomechanics. 31 (11), 969-976 (1998).</li>
<li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+osteocyte-like+cell+line%2C+MLO-Y4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>vander Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li>
<li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Trudno jest eksperymentalnie badać osteocyty ze względu na ich osadzone w macierzy tkanek twardych, do której szybko się pogarszają lub różnicują po usunięciu tej niszy. Badania nad osteocytami wymagały ogromnej pomysłowości w ciągu ostatnich 3 dekad, takich jak stworzenie linii podobnych do osteocytów 29,30,31, ustanowienie protokołów izolacji pierwotnych osteocytów32,33, a nawet wysiłki mając...

Macierz kostna jest zorganizowana zgodnie z zapotrzebowaniem mechanicznym1,2 i może zmieniać się dynamicznie, aby uwzględnić zmieniające się wymagania mechaniczne3,4,5. Przełomowe prace dotyczące mechanizmu mechanosensorycznego w kości zostały opublikowane jako praca modelowa około 30 lat temu6,7,8, gdzie zaproponowano, że osteocyty osadzone w kości odczuwają mechaniczną deformację na poziomie tkanki poprzez ruch płynów w swoim lokalnym środowisku. Model ten został zweryfikowany eksperymentalnie w eksperymentach in vitro i ex vivo, w których wyraźnie wykazano, że osteocyty są dość wrażliwe mechanicznie1,2,3,4,5,6 a także wyrażają cytokiny, które kierują zachowaniem osteoblastów budujących kości7 oraz osteoklasty8,9,10,11,12.
Sygnalizacja wapniowa jest wszechobecnym drugim przekaźnikiem, który został uznany za centralną postać i niezawodny cel eksperymentalny w mechanobiologii osteocytów13,14,15,16. Sygnalizacja wapniowa ma tę zaletę, że jest szeroko badana w biologii komórki17, co oznacza, że wiele wiadomo o jej dalszych skutkach i odpowiednich narzędziach fluorescencyjnych dostępnych do obserwacji eksperymentalnych. W analizach in vitro wykorzystano sygnalizację wapniową jako sposób identyfikacji mechanicznej aktywacji osteocytów i scharakteryzowania dynamicznego zachowania sygnalizacyjnego5,18,19. Warto zauważyć, że obserwacja sygnalizacji wapniowej w linii komórkowej osteocytów dostarczyła ostatecznych dowodów na to, że aktywacja płynu w przyczepach integryny wzdłuż procesu komórkowego jest prawdopodobnie główną formą aktywacji przepływu płynu20. To badanie jest jednym z wielu, które pokazują użyteczność sygnalizacji wapniowej. Jest niezawodnie indukowany poprzez mechaniczną aktywację osteocytów i dlatego służy jako silny cel do badania mechanobiologii osteocytów.
Mechanotransdukcja osteocytów in vivo jest wysoce zależna od ich bezpośredniego mikrośrodowiska. Białka wiążące macierz (np. proteoglikany, integryny) zapewniają funkcjonalne przyłączenia między błonami komórkowymi osteocytów w układzie, który ma kluczowe znaczenie dla aktywacji płynów w komórce21,22. Chociaż dwuwymiarowe (2D) analizy in vitro są pomocne, są one ograniczone, ponieważ nie obejmują tych krytycznych cech trójwymiarowych (3D). Preparaty ex vivo sygnalizacji wapniowej osteocytów przy użyciu mikroskopii konfokalnej rzuciły nieco światła na to, jak osteocyty reagują, zachowując otaczającą macierz w stanie nienaruszonym13,16. Uważa się jednak, że usunięcie dopływu krwi z kości zmienia składniki odżywcze i dynamikę płynów w układzie lacunokanicznym. Badanie mechanobiologii osteocytów wymaga zbadania in vivo sygnalizacji osteocytów indukowanej obciążeniem.
Badania in vivo komórek osadzonych w kości były znacznie utrudnione przez ograniczenia tradycyjnych technik obrazowania, takich jak jasne pole i mikroskopia konfokalna. Osteocyty są umieszczone w zmineralizowanej macierzy 23 składającej się z hydroksyapatytu, kolagenu typu 1 i innych białek niekolagenowych, które ograniczają dostępność optyczną24 i sprawiają, że badanie in vivo jest technicznie trudne. Jednak ostatnie postępy w nieliniowym obrazowaniu fluorescencyjnym i genetycznie kodowanych reporterach wapnia stwarzają możliwość przezwyciężenia tych wyzwań.
Tutaj przedstawiamy nowatorskie podejście z możliwością obrazowania osteocytów in vivo w celu pomiaru sygnalizacji wapniowej z rozdzielczością na poziomie komórkowym25. Osiągnięto to dzięki zastosowaniu dynamicznego markera fluorescencyjnego wykorzystującego genetycznie kodowany wskaźnik wapnia po raz pierwszy w osteocytach myszy. Myszy z ekspresją GCaMP6f sterowaną przez osteocyty DMP1-Cre wykazują widoczną fluorescencję w osteocytach w całej korze trzonowej śródstopia myszy17,26. Używamy trzypunktowego systemu gięcia w celu zastosowania fizjologicznych poziomów wielkości odkształcenia w zakresie 250-2,000 με27. Technika ta pozwala na wizualizację in vivo dynamiki sygnalizacji wapniowej osteocytów podczas mechanicznego obciążenia całej kości i może być przydatna dla każdego, kto chce zrozumieć mechanobiologię osteocytów. Metoda ta byłaby odpowiednia dla badaczy chcących rozszerzyć swoją pracę z analiz in vitro na zastosowania in vivo, zwłaszcza przy zachowaniu funkcjonalnych analiz molekularnych (tj. badania aktywności komórkowej poprzez sygnalizację wapniową) w przeciwieństwie do szeroko zakrojonych badań fenotypowania.

<table><tbody><tr><td>#3 Uchwyt skalpela</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72040-03</td><td>Materiały chirurgiczne</td></tr><tr><td>20x Obiektyw do zanurzenia w wodzie</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN20XW</td><td>Jest to obiektyw 20x, ale 40x może być również używany do tego protokołu. Zalecamy zanurzenie w wodzie, ponieważ podczas obrazowania należy ją zanurzyć w kąpieli, więc obiektyw na świeżym powietrzu może powodować aberracje</td></tr><tr><td>A.M. Bickford Omnicon F/AIR</td><td>AM Bickford</td><td>80120</td><td>Rozsądna odpowiedź na problemy z gazem anestezjologicznym na sali operacyjnej, filtr gazu anestezjologicznego F/AIR został specjalnie zaprojektowany do usuwania odpadowych gazów anestezjologicznych, takich jak izofluran, Halothane, Enfluran itp. ze środowiska sali operacyjnej.</td></tr><tr><td>Zestaw A.M. Bickford Omnicon F/AIR&nbsp;</td><td>AM Bickford</td><td>80000</td><td>Cały zestaw z rurką i adapterami do podłączenia F/AIR do konfiguracji</td></tr><tr><td>B6J. Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>28865</td><td>GCaMP6f Myszy do krzyżowania z myszami Dmp1-Cre</td></tr><tr><td>B6N. FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>23047</td><td>Dmp1-Cre Myszy do krzyżowania z myszami GCaMP6f&nbsp;</td></tr><tr><td>Kompresyjne ogniwo obciążnikowe</td><td>FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.</td><td>905898</td><td>LCM100 , 1000 g , Subminiaturowe ogniwo obciążnikowe do rozciągania i ściskania (z gwintem miniaturowym/liniowym) , RoHS bezołowiowe, Materiał - 17-4 PH SS , Gwint M3x0.5 , 34 Awg 4-żyłowy poliestrowy w oplocie, 5 stóp</td></tr><tr><td>Long Corning 500 mL DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco), 1x [+] wapń, magnez</td><td>VWR International</td><td>21-030-CV</td><td>Wanna zrównoważona jonowo, która zawiera wapń, zanurza śródstopie podczas obrazowania</td></tr><tr><td>Narzędzie dentystyczne</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td></td><td>Materiały chirurgiczne</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy czysty 200-procentowy odczynnik ACS >99,5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SIAL-459844-500ML</td><td>Cele sterylizacji</td></tr><tr><td>Sworzeń podparcia</td><td>Fathom</td><td>N/A</td><td>Wytwarzany przez bezpośrednie spiekanie laserowe 3D stali nierdzewnej (stop PH1) z plików 3D SolidWorks STL. Pierwotnym dostawcą był GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, obecnie przejęta przez FATHOM, specyfikacje są podane we wcześniej opublikowanym dokumencie</td></tr><tr><td>Zestaw wyjściowy USB220 o wysokiej rozdzielczości i szybkości</td><td>FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.</td><td>717435</td><td>Służy do podłączenia ogniwa obciążnikowego do laptopa</td></tr><tr><td>ImageJ 1.53t z Javą 1.8.0_172 (dla 64-bitowego systemu Windows)</td> <td>NIH</td><td>Nie dotyczy</td><td>Zainstaluj tutaj https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>66794-013-25</td><td>100% wziewny płyn</td></tr> parowy <tr><td>Wspornik załadunkowy</td><td>Fathom</td><td>N/A</td><td>Wykonane przez bezpośrednie spiekanie laserowe 3D stali nierdzewnej (stopu PH1) z plików 3D SolidWorks STL. Pierwotnym dostawcą był GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, obecnie przejęta przez FATHOM, specyfikacje są podane we wcześniej opublikowanym dokumencie</td></tr><tr><td>MATLAB R2019a</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Do uruchomienia urządzenia ładującego</td></tr><tr><td>Matrx VIP 3000 waporyzator dobrze napełnij izofluran</td><td>Butler Schein Animal Health</td><td>14309</td><td>Parownik do znieczulenia</td></tr><tr><td>Pulsoksymetr Nonin Model 2500A Vet</td><td></td><td>2500A Vet</td><td></td></tr><tr><td>Serwo piezoelektryczne sterownik</td><td>PI-USA</td><td>E-625</td><td>Element elektroniczny zalecany przez firmę do stosowania z siłownikiem</td></tr><tr><td>Liniowy siłownik piezoelektryczny PiezoMove o wysokiej sztywności</td><td>PI-USA</td><td>P-602.5SL</td><td>Siłownik do urządzenia załadowczego</td></tr><tr><td>Ostrza skalpela, nr 10 do uchwytu nr 3, opakowanie 100 szt</td>. <td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72044-10</td><td>Materiały chirurgiczne</td></tr><tr><td>Pęseta ze stali nierdzewnej z ostrymi, cienkimi końcówkami. Długość: 120 mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>78326-42</td><td>Materiały chirurgiczne</td></tr><tr><td>Mikroskop wielofotonowy Thorlabs Bergamo</td><td>ThorLabs</td><td>N/A Jest</td><td>to tylko system obrazowania i nie ma dołączonego lasera, chociaż ThorLabs ma opcje laserowe w razie potrzeby</td></tr><tr><td>Tytanowo-szafirowy kameleon Discovery NX z całkowitą kontrolą mocy (TPC)</td> <td>Koherentny</td><td>Nie dotyczy</td><td>Technicznie rzecz biorąc, system ten ma dwa lasery, oba przestrajalne i stałe. Jednak do protokołu potrzebne jest tylko przestrajanie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas - krawędź tnąca 4 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>Materiały chirurgiczne</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fathom</td><td>N/A</td><td>Wykonane przez bezpośrednie spiekanie laserowe 3D stali nierdzewnej (stop PH1) z plików 3D SolidWorks STL. Pierwotnym dostawcą był GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, obecnie przejęta przez FATHOM, specyfikacje znajdują się w wcześniej opublikowanym dokumencie</td></tr></tbody></table>

fluorescencyjne obrazowanie przyżyciowe w celu zbadania dynamiki sygnalizacji wapniowej wywołanej obciążeniem w osteocytach myszy

A Fluorescent Intravital Imaging Approach to Study Load-Induced Calcium Signaling Dynamics in Mouse Osteocytes

Tkanka kostna jest niezwykle wrażliwa na różnice w wielkości obciążenia mechanicznego. Osteocyty, komórki dendrytyczne, które tworzą syncytium w całej kości, są odpowiedzialne za funkcję mechanosensoryczną tkanki kostnej. Badania wykorzystujące histologię, modelowanie matematyczne, hodowle komórkowe i hodowle narządów kostnych ex vivo znacznie poszerzyły wiedzę na temat mechanobiologii osteocytów. Jednak podstawowe pytanie, w jaki sposób osteocyty reagują i kodują informacje mechaniczne na poziomie molekularnym in vivo, nie jest dobrze poznane. Wewnątrzkomórkowe wahania stężenia wapnia w osteocytach stanowią użyteczny cel do dowiedzenia się więcej o ostrych mechanizmach mechanotransdukcji kości. W tym miejscu przedstawiamy metodę badania mechanobiologii osteocytów in vivo, łącząc szczep myszy z fluorescencyjnie kodowanym genetycznie wskaźnikiem wapnia wyrażonym w osteocytach z systemem ładowania i obrazowania in vivo w celu bezpośredniego wykrywania poziomu wapnia w osteocytach podczas ładowania. Osiąga się to za pomocą trzypunktowego urządzenia do zginania, które może dostarczać dobrze zdefiniowane obciążenia mechaniczne do trzeciej kości śródstopia żywych myszy, jednocześnie monitorując fluorescencyjnie wskazywane odpowiedzi wapniowe osteocytów za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Technika ta pozwala na bezpośrednią obserwację in vivo zdarzeń sygnalizacji wapniowej osteocytów w odpowiedzi na obciążenie całej kości i jest przydatna w dążeniu do ujawnienia mechanizmów w mechanobiologii osteocytów.

Niniejszym przedstawiamy metodologię badania sygnalizacji wapniowej w wbudowanych osteocytach in vivo przy użyciu ostrej preparatyki chirurgicznej oraz wielofotonowego obrazowania fluorescencyjnego. Zielony sygnał fluorescencyjny można obserwować w genetycznie kodowanych wskaźnikach wapnia w osteocytach poprzez Ekspresja DMP1-Cre. Rysunek 4 jest obrazem w jednej płaszczyźnie osadzonych osteocytów. Należy zauważyć, że wszystkie komórki są znakowane i wykazują podstawową ziel...

Obecny artykuł opisuje wykonywanie metody obrazowania przyżyciowego w celu obserwacji mechanicznie indukowanej sygnalizacji wapniowej osadzonych osteocytów in vivo w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na mechaniczne obciążenie trzeciej kości śródstopia myszy na poziomie tkankowym.

Fluorescencyjne obrazowanie przyżyciowe w celu zbadania dynamiki sygnalizacji wapniowej wywołanej obciążeniem w osteocytach myszy

Bone tissue is exquisitely sensitive to differences in mechanical load magnitude. Osteocytes, dendritic cells that form a syncytium throughout the bone, ...

Protokół ten umożliwia obserwację osadzonych osteocytów in vivo, co stanowi ważny postęp w badaniach nad mechanobiologią kości. Główną zaletą tej techniki jest możliwość obserwacji zdarzeń na poziomie komórkowym i molekularnym w osteocytach in vivo, utrzymanie ich natywnego układu przestrzennego 3D, przepływu krwi i warunków endokrynologicznych oraz pokonanie ograniczeń zwykle narzucanych przez eksperymenty komórkowe in vitro. Technika ta jest przeznaczona do badań podstawowych na modelach mysich. Nie obejmują one jeszcze terapii ani diagnozy, ale dają możliwość uzyskania wglądu, który definiuje następną generację metod leczenia kości.[Narrator] Na początek wykonaj nacięcie skalpelem przez skórę właściwą między drugą a trzecią kością śródstopia, zaczynając od dystalnego końca i postępując proksymalnie wzdłuż kości. Za pomocą kleszczy otwórz pole operowane, pociągając skórę w kierunku krawędzi przyśrodkowej lub bocznej. Wytnij ścięgna prostowników za pomocą prostych nożyczek Vannas, aby odsłonić trzecią kość śródstopia. Włóż środkowy sworzeń podparcia urządzenia obciążającego śródstopie do małej przestrzeni na dystalnym końcu, gdzie trzecia kość śródstopia styka się z bliższym paliczkiem. Następnie przesuń szpilkę proksymalnie, aż oprze się na środkowym trzonie trzeciej kości śródstopia. Zachowaj szczególną ostrożność, aby zagwarantować bezpośrednie połączenie między kością a szpilką, z wyłączeniem wszelkich mięśni i powięzi. Chwyć kostkę kleszczami i umieść stopę w łaźni wodnej wypełnionej DPBS. Zamocuj łapę na miejscu za pomocą wspornika załadowczego i podłącz wspornik do układu ogniw obciążnikowych siłownika. Ostrożnie podnieś konfigurację urządzenia ładującego za pomocą myszy i umieść je na platformie mikroskopu. Zacznij od obiektywu o małym powiększeniu w trybie epifluorescencji, aby zlokalizować i wyśrodkować środkowy trzon kości. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania przełącz się na większe powiększenie obiektywu zanurzenia w wodzie i przełącz optykę na dwa fotony. Ustaw gęstość pikseli za pomocą ustawień sterowania obszarem Galvo/Resonance. Aby uniknąć wybielania zdjęć, zmniejsz moc za pomocą opcji sterowania mocą i zwiększ wzmocnienie PMT w ustawieniach sterowania skanerem Galvo/Resonance. Zidentyfikuj powierzchnię kości w trybie dwóch fotonów, szukając włóknistej autofluorescencji okostnej w zielonym kanale, który wykorzystuje filtr pasmowo-przepustowy wyśrodkowany na 525 nanometrach. Jeśli podczas ładowania widoczny jest ruch kości, wybierz inny obszar zainteresowania wzdłuż kierunku Y lub Z, aby upewnić się, że znajduje się on bezpośrednio nad środkowym sworzniem podparcia. Jeśli ruch nie ustąpi, należy ręcznie wyregulować chirurgiczne ułożenie szpilki pod trzecią kością śródstopia. Przeprowadź obrazowanie stosu Z z obciążeniem zgodnie z projektem eksperymentalnym, aby zarejestrować morfometryczne zdarzenia sygnalizacyjne, a następnie obrazowanie serii T z obciążeniem, aby zarejestrować zdarzenia sygnalizacyjne wywołane obciążeniem dynamicznym. Pokazano tutaj jednopłaszczyznowy, dwufotonowy obraz osteocytów śródstopia wyrażających GCaMp6f in vivo. Endogenna ekspresja wapiennych konstruktów reporterowych zapewnia cel fluorescencyjny bez konieczności inkubacji. Projekcja 3D Z osteocytów in vivo uchwycona za pomocą dwóch mikroskopów fotonowych jest przedstawiona na tym rysunku. Cięcie poprzeczne w płaszczyźnie XY i cięcie strzałkowe pokazują głębokość stosu Z. Reprezentatywny obraz przedstawia przykładowy przebieg w czasie sygnału fluorescencyjnego GCaMp6f z osadzonego osteocytu. W spoczynku występują wahania hałasu na niskim poziomie. Wraz z obciążeniem wahania wapnia zwiększają się pod względem wielkości i regularności, często występując wraz z zastosowanym obciążeniem.Metoda ta toruje naukowcom drogę do odpowiedzi na funkcjonalne pytania dotyczące mechanobiologii osteocytów in vivo, które wcześniej były możliwe tylko in vitro lub ex vivo.

a-fluorescent-intravital-imaging-approach-to-study-load-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Źródło: Heredia, D. J., et. al. Obrazowanie ex vivo specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy. J. Vis. Exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne dynamiki wapnia w połączeniach nerwowo-mięśniowych (NMJ) u transgenicznej myszy wykazującej ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. NJM jest identyfikowany przez fluorescencyjnie znakowane receptory acetylocholiny w przeponie z nerwem przeponowym . Rozdzielacz obrazu służy do...

Obrazowanie fluorescencyjne dynamiki wapnia w połączeniach nerwowo-mięśniowych w przeponie transgenicznej myszy

Ładowanie barwnikiem indukowane przez esterazy celowane (TED) wspiera analizę dynamiki wewnątrzkomórkowego magazynowania wapnia za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda opiera się na ukierunkowaniu rekombinowanej karboksylesterazy na retikulum endoplazmatyczne (ER), gdzie poprawia miejscowe demaskowanie syntetycznych barwników wskaźnikowych Ca2+ o niskim powinowactwie w świetle ER.

Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED)

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

To badanie przedstawia metodę wizualizacji i rozwoju trójwymiarowych (3D) modeli osteocytów w sieci lacunarno-kanalicznej (LCN) do analizy obliczeniowej dynamiki płynów (CFD). Wygenerowane modele wykorzystujące tę metodę pomagają zrozumieć mechanosensację osteocytów w zdrowych lub chorych kościach.

Analiza i obrazowanie osteocytów

Poznaj metodę fluorescencyjnego obrazowania przyżyciowego do badania dynamiki sygnalizacji wapniowej w osteocytach myszy podczas obciążenia mechanicznego. Technika ta umożliwia obserwację komórek w ich naturalnym środowisku 3D.

Fluorescencyjne obrazowanie przyżyciowe w celu zbadania dynamiki sygnalizacji wapniowej wywołanej obciążeniem w osteocytach myszy (Wideo) | JoVE Journal

Fluorescencyjne obrazowanie przyżyciowe w celu zbadania dynamiki sygnalizacji wapniowej wywołanej obciążeniem w osteocytach myszy

Przeglądaj więcej filmów