Fluorescencyjne obrazowanie przyżyciowe w celu zbadania dynamiki sygnalizacji wapniowej wywołanej obciążeniem w osteocytach myszy
24 lutego 2023
Obecny artykuł opisuje wykonywanie metody obrazowania przyżyciowego w celu obserwacji mechanicznie indukowanej sygnalizacji wapniowej osadzonych osteocytów in vivo w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na mechaniczne obciążenie trzeciej kości śródstopia myszy na poziomie tkankowym.
Protokół ten umożliwia obserwację osadzonych osteocytów in vivo, co stanowi ważny postęp w badaniach nad mechanobiologią kości. Główną zaletą tej techniki jest możliwość obserwacji zdarzeń na poziomie komórkowym i molekularnym w osteocytach in vivo, utrzymanie ich natywnego układu przestrzennego 3D, przepływu krwi i warunków endokrynologicznych oraz pokonanie ograniczeń zwykle narzucanych przez eksperymenty komórkowe in vitro. Technika ta jest przeznaczona do badań podstawowych na modelach mysich. Nie obejmują one jeszcze terapii ani diagnozy, ale dają możliwość uzyskania wglądu, który definiuje następną generację metod leczenia kości.
[Narrator] Na początek wykonaj nacięcie skalpelem przez skórę właściwą między drugą a trzecią kością śródstopia, zaczynając od dystalnego końca i postępując proksymalnie wzdłuż kości. Za pomocą kleszczy otwórz pole operowane, pociągając skórę w kierunku krawędzi przyśrodkowej lub bocznej. Wytnij ścięgna prostowników za pomocą prostych nożyczek Vannas, aby odsłonić trzecią kość śródstopia. Włóż środkowy sworzeń podparcia urządzenia obciążającego śródstopie do małej przestrzeni na dystalnym końcu, gdzie trzecia kość śródstopia styka się z bliższym paliczkiem. Następnie przesuń szpilkę proksymalnie, aż oprze się na środkowym trzonie trzeciej kości śródstopia. Zachowaj szczególną ostrożność, aby zagwarantować bezpośrednie połączenie między kością a szpilką, z wyłączeniem wszelkich mięśni i powięzi. Chwyć kostkę kleszczami i umieść stopę w łaźni wodnej wypełnionej DPBS. Zamocuj łapę na miejscu za pomocą wspornika załadowczego i podłącz wspornik do układu ogniw obciążnikowych siłownika. Ostrożnie podnieś konfigurację urządzenia ładującego za pomocą myszy i umieść je na platformie mikroskopu. Zacznij od obiektywu o małym powiększeniu w trybie epifluorescencji, aby zlokalizować i wyśrodkować środkowy trzon kości. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania przełącz się na większe powiększenie obiektywu zanurzenia w wodzie i przełącz optykę na dwa fotony. Ustaw gęstość pikseli za pomocą ustawień sterowania obszarem Galvo/Resonance. Aby uniknąć wybielania zdjęć, zmniejsz moc za pomocą opcji sterowania mocą i zwiększ wzmocnienie PMT w ustawieniach sterowania skanerem Galvo/Resonance. Zidentyfikuj powierzchnię kości w trybie dwóch fotonów, szukając włóknistej autofluorescencji okostnej w zielonym kanale, który wykorzystuje filtr pasmowo-przepustowy wyśrodkowany na 525 nanometrach. Jeśli podczas ładowania widoczny jest ruch kości, wybierz inny obszar zainteresowania wzdłuż kierunku Y lub Z, aby upewnić się, że znajduje się on bezpośrednio nad środkowym sworzniem podparcia. Jeśli ruch nie ustąpi, należy ręcznie wyregulować chirurgiczne ułożenie szpilki pod trzecią kością śródstopia. Przeprowadź obrazowanie stosu Z z obciążeniem zgodnie z projektem eksperymentalnym, aby zarejestrować morfometryczne zdarzenia sygnalizacyjne, a następnie obrazowanie serii T z obciążeniem, aby zarejestrować zdarzenia sygnalizacyjne wywołane obciążeniem dynamicznym. Pokazano tutaj jednopłaszczyznowy, dwufotonowy obraz osteocytów śródstopia wyrażających GCaMp6f in vivo. Endogenna ekspresja wapiennych konstruktów reporterowych zapewnia cel fluorescencyjny bez konieczności inkubacji. Projekcja 3D Z osteocytów in vivo uchwycona za pomocą dwóch mikroskopów fotonowych jest przedstawiona na tym rysunku. Cięcie poprzeczne w płaszczyźnie XY i cięcie strzałkowe pokazują głębokość stosu Z. Reprezentatywny obraz przedstawia przykładowy przebieg w czasie sygnału fluorescencyjnego GCaMp6f z osadzonego osteocytu. W spoczynku występują wahania hałasu na niskim poziomie. Wraz z obciążeniem wahania wapnia zwiększają się pod względem wielkości i regularności, często występując wraz z zastosowanym obciążeniem.
Metoda ta toruje naukowcom drogę do odpowiedzi na funkcjonalne pytania dotyczące mechanobiologii osteocytów in vivo, które wcześniej były możliwe tylko in vitro lub ex vivo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół obrazowania intravitalnego służący do obserwacji sygnalizacji wapniowej w osteocytach w odpowiedzi na obciążenie mechaniczne in vivo. Rozwiązanie to umożliwia obserwację zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym przy zachowaniu naturalnego środowiska kości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mechanobiologia kości
- Techniki obrazowania in vivo
- Sygnalizacja wapniowa w osteocytach
Wstęp
- Osteocyty odgrywają kluczową rolę w mechanobiologii kości.
- Tradycyjne metody in vitro ograniczają zrozumienie reakcji komórkowych w ich naturalnym środowisku.
- Niniejsza technika umożliwia obserwację osteocytów przy zachowaniu ich przestrzennego układu 3D oraz warunków fizjologicznych.
- Zdobyta wiedza może pomóc w opracowaniu przyszłych strategii leczenia kości.
Cel badania
- Opracowanie metody obserwacji osteocytów in vivo podczas obciążenia mechanicznego.
- Pogłębienie zrozumienia dynamiki sygnalizacji wapniowej w osteocytach.
- Stworzenie podstaw dla przyszłych badań nad zdrowiem i chorobami kości.
Zastosowane metody
- Nacięcie skalpelem w celu uzyskania dostępu do trzeciej kości śródstopia u myszy.
- Wykorzystanie urządzenia do obciążania kości śródstopia w celu zastosowania stresu mechanicznego.
- Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania osteocytów w czasie rzeczywistym.
- Rejestracja zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych dynamicznym obciążeniem za pomocą obrazowania serii Z (Z stack) i serii T (T series).
Główne wyniki
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym ujawniło wahania poziomu wapnia w osteocytach podczas obciążania.
- Amplituda sygnałów fluorescencyjnych wzrastała wraz z naprężeniem mechanicznym.
- Obrazowanie 3D dostarczyło informacji na temat rozmieszczenia przestrzennego osteocytów.
- Wykazano skuteczność tej techniki w badaniu mechanobiologii kości.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia znaczny postęp w badaniach nad mechanobiologią kości.
- Obrazowanie osteocytów w czasie rzeczywistym może prowadzić do lepszego zrozumienia stanu zdrowia kości.
- Technika ta może utorować drogę do przyszłych strategii terapeutycznych w leczeniu kości.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednie obrazowanie in vivo sygnalizacji wapniowej w osteocytach pod wpływem obciążenia mechanicznego wypełnia krytyczną lukę w zrozumieniu mechanotransdukcji kości na poziomie molekularnym. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć, umożliwiając obserwację ścieżek mechanosensorycznych w czasie rzeczywistym w ich rodzimym kontekście fizjologicznym. Podejście to wspiera mitygację ryzyka mechanistycznego i dostarcza informacji niezbędnych do walidacji celów terapeutycznych w portfolio dotyczącym zdrowia kości oraz chorób szkieletu.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków mechanosensorycznych osteocytów w warunkach fizjologicznie istotnych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zachowanie natywnej architektury 3D i wpływów systemowych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla mechanizmów mechanotransdukcji w kościach.
- Zwiększa wiarygodność prognostyczną przy ustalaniu priorytetów dla celów związanych z tkanką kostną.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zwalidowany system in vivo do ilościowego określania dynamiki sygnałów wapniowych w odpowiedzi na określone obciążenia mechaniczne.
- Umożliwia uzyskiwanie powtarzalnych, ilościowych odczytów aktywności osteocytów do dalszego opracowywania testów.
- Wspiera standaryzację testów mechanotransdukcji do oceny związków chemicznych.
- Kładzie podwaliny pod skalowalny screening modulatorów wpływających na mechanoczułość kości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgadza wglądy mechanistyczne z modelami kostnymi istotnymi dla choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój interwencji celowanych w kości w oparciu o mechanistyczne dane in vivo.
- Wspiera identyfikację biomarkerów translacyjnych powiązanych z dynamiką sygnałową osteocytów.
- Łączy odkrycia z etapu poszukiwań z walidacją przedkliniczną w systemach nienaruszonych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda obrazowania in vivo integruje etap wczesnych odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając bezpośrednią weryfikację hipotez oraz wyjaśnienie szlaków sygnałowych w żywej tkance kostnej.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez mechanistycznych dotyczących odpowiedzi osteocytów na bodźce mechaniczne in vivo.
- Przesiewy: Dostarcza ilościowe, powtarzalne pomiary sygnalizacji wapniowej w celu przygotowania analizy.
- Analityka: Zapewnia dynamiczne odczyty fluorescencyjne do porównywania sygnalizacji w różnych warunkach obciążenia.
- Badania translacyjne: Łączy molekularne zdarzenia sygnalizacyjne z funkcjonalnymi efektami w całej kości w modelach istotnych dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badań z zakresu mechanobiologii w ramach programów badawczych nad kośćmi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad mechanotransdukcją kości.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy obrazowania in vivo w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową w obszarze B+R ukierunkowanego na kości.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów w zakresie zdrowia kości i chorób szkieletu z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu intravitalnym oraz w technikach chirurgicznych dla małych zwierząt.
- Wymaga dostępu do mikroskopii dwufotonowej i precyzyjnej aparatury do obciążania mechanicznego.
- Konieczna jest standaryzacja parametrów obrazowania i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych obszarów kostnych lub modeli może wymagać optymalizacji protokołu.
- Ograniczony do badań podstawowych na modelach mysich, zgodnie z aktualnymi danymi.
