Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Nasz model invitro trójwymiarowego mięśnia sercowego pochodzącego z ludzkich komórek macierzystych poprawia biowierność tradycyjnej dwuwymiarowej hodowli komórkowej, jednocześnie eliminując różnice międzygatunkowe związane z testami laboratoryjnymi na zwierzętach. Nasza wielotkankowa konstrukcja bioreaktora ze stabilnymi słupkami śledzącymi maksymalizuje sukces tkanek i poprawia dokładność dogłębnej charakterystyki funkcji zmodyfikowanej tkanki serca. Ponieważ niewydolność serca nadal jest główną przyczyną zgonów na całym świecie, nasze zmodyfikowane tkanki serca umożliwiają naukowcom modelowanie chorób serca u ludzi, a także badanie potencjalnych terapii.

Na początek umieść cztery aluminiowe ujemne odlewy główne w uchwycie odlewu tak, aby otwory na słupki wyrównały się z martwą przestrzenią naprzeciwko trójkątnych półek. Umieść urządzenie między dwoma równoległymi wspornikami i zaciśnij boki razem, używając prostokątnego kawałka silikonowej folii o grubości 0,5 milimetra jako uszczelki, aby zapobiec wyciekowi płynnego PDMS. W płytkim pojemniku wymieszaj 0,5 mililitra utwardzacza PDMS z pięcioma mililitrami elastomeru PDMS w stosunku jeden do 10 i energicznie mieszaj przez pięć minut.

Mieszaninę PDMS należy odgazować w komorze próżniowej pod silną próżnią, aż do zniknięcia pęcherzyków. Następnie wlej mieszaninę PDMS na aparat odlewniczy, przepełniając, aby zapewnić całkowite pokrycie każdej szczeliny. Dodaj małe kolorowe szklane koraliki do korpusu regałów PDMS po przeciwnej stronie ze słupkami, aby uzyskać unikalną identyfikację każdego stojaka.

Umieścić aparat odlewniczy wypoziomowany poziomo w komorze próżniowej pod silną próżnią na co najmniej 12 godzin. Pozwól PDMS utwardzić się w temperaturze pokojowej z dala od kurzu przez 48 godzin, aby umożliwić całkowite utwardzenie i maksymalną wytrzymałość delikatnych wkładów. Usuń zacisk, wsporniki i folię silikonową z aparatu odlewniczego.

Za pomocą żyletki ze stali nierdzewnej odetnij folię PDMS na górze aparatu odlewniczego i wsporników ramy. Użyj palców, aby oddzielić stojaki PDMS od boków uchwytu odlewu. Włóż żyletkę ze stali nierdzewnej do martwej przestrzeni między odlewem a uchwytem odlewu i podważ je, upewniając się, że PDMS wypełniający martwą przestrzeń pozostaje z uchwytem odlewu.

Następnie za pomocą ostrego ostrza ze stali nierdzewnej odetnij pozostałe folie PDMS i martwą przestrzeń PDMS od końcówek słupków. Palcami powoli oddziel stelaż PDMS od odlewu po stronie przeciwnej do słupków. Kontynuuj zmienianie stron, aż słupki będą wolne od głównych odlewów.

Zwolnij wszystkie stojaki PDMS i słupki, jak pokazano wcześniej, i użyj ostrej żyletki, aby przyciąć pozostały nadmiar PDMS ze stojaków. Za pomocą termoplastycznej drukarki 3D do modelowania osadzania topionego drewna wydrukuj elementy stabilnego urządzenia do śledzenia słupków lub SPoT. Zapewnij bezpieczne dopasowanie wtłaczane między wydrukowanymi w 3D elementami oraz między stojakami PDMS a trójzębnym przyrządem.

Upewnij się również, że stojaki PDMS ściśle przylegają do słupków sięgających dna studni bez zginania. Wymieszaj 0,5 mililitra czarnego PDMS część A z 0,5 mililitra części B w małej łódce wagowej lub płytkim pojemniku, aż roztwór będzie miał jednolity kolor. Odgazować zmieszany PDMS w komorze próżniowej pod silną próżnią przez 20 minut.

Wlej odgazowany PDMS na wydrukowaną w 3D podstawę, aby wypełnić otwory i dotknij, aby upewnić się, że nie pozostały żadne pęcherzyki. Zeskrob jak najwięcej nadmiaru PDMS z podstawy. Zatrzaśnij trójzębny element na podstawie i umieść stojaki PDMS w rowkach na trójzębnym przyrządzie, upewniając się, że końce słupków zanurzają się w czarnych PDMS w okrągłych studzienkach.

Pozostaw PDMS do utwardzenia w temperaturze pokojowej z dala od kurzu przez 48 godzin. Wysuń trójzębny element, minimalizując naprężenia na słupkach. Za pomocą małych kleszczyków zeskrob cienką czarną folię PDMS otaczającą każdy SPoT, a następnie włóż cienkie, wygięte kleszczyki do dobrze SPoT, aby uwolnić go od podstawy wydrukowanej w 3D.

Sprawdź SPoT i odetnij pozostałą czarną folię PDMS z procesu odlewania za pomocą cienkich nożyczek vannas. Upewnij się, że gotowe słupki mają odpowiednią długość, dopasowując stojaki PDMS do ramy telefonu komórkowego polys, a następnie wsuwając je na czarną płytę podstawy. Po autoklawowaniu bioreaktora i przygotowaniu mieszaniny komórek, przystąp do wytwarzania hECT.

Zakładając sterylne rękawice, wyjmij czarną płytkę podstawy z autoklawowanej torby zawierającej części bioreaktora i umieść ją w 60-mililitrowym naczyniu studzienkami skierowanymi do góry. Powoli odpipetować 44 mikrolitry mieszaniny komórek do każdej studzienki, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków. Zakładając świeżą parę sterylnych rękawiczek, wyjmij ramkę polisulfonową ze stojakami PDMS z torby autoklawu.

Opuść ramę na płytę podstawy tak, aby końce ramy pasowały do rowków na końcu płyty podstawy. Upewniając się, że wszystkie słupki są proste, a rama nie jest przechylona, umieść bioreaktor w 60-milimetrowej misce. Dodaj jeden mililitr 10% FBS w pożywce do konserwacji kardiomiocytów do 60-mililitrowego naczynia, aby zwiększyć wilgotność w miarę zestalania się hECT.

Umieść naczynie bez pokrywki w wysokoprofilowym 100-milimetrowym naczyniu i przykryj je 100-milimetrową pokrywką naczynia, a następnie przywróć bioreaktor do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby kolagen mógł utworzyć żel z komórkami w zawiesinie. Po dwóch godzinach wyjmij naczynie z inkubatora. Dodaj 13 mililitrów 10% FBS do pożywki do konserwacji kardiomiocytów, przechylając naczynie, aby umożliwić przepływ pożywki między płytą bazową PTFE a stojakami PDMS.

Sprawdź bioreaktor z boku, czy nie ma pęcherzyków powietrza i włóż naczynie z powrotem do inkubatora. Jeśli powietrze jest uwięzione, przechyl bioreaktor z medium, aby pęcherzyk pękł i powoli opuść go ponownie, lub użyj mikropipety z końcówką ładującą żel, aby zasysać powietrze bez naruszania słupków. Sprawdzić zagęszczenie hECT przez okienko w ramie.

W ciągu 24 do 96 godzin hECT ulegają zagęszczeniu i stają się bardziej nieprzezroczyste. Zdejmij płytę podstawy, gdy hECT są zagęszczone o co najmniej 30% w porównaniu z oryginalną średnicą. Napełnij 60-milimetrową naczynie zawierającą bioreaktor pożywką do konserwacji kardiomiocytów, aż płyn zrówna się z krawędzią naczynia i dodaj 14 mililitrów do nowego 60-milimetrowego naczynia.

Zakładając sterylne rękawice, odwróć bioreaktor w naczyniu tak, aby płyta podstawy znalazła się na górze. Po sprawdzeniu, czy nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza, powoli podnieś płytę podstawy, utrzymując ją poziomo. Upewnij się, że wskazówki dotyczące postów są ostre.

Włącz przełącznik progowy i wyreguluj suwak, aż SPoT zostaną ładnie rozgraniczone i nie zmienią kształtu wraz z kurczeniem się hECT. Użyj narzędzia prostokąta, aby narysować prostokąt wokół jednego z SPoT i kliknij przycisk ustaw jeden w polu granic słupka, aby ustawić pozycję prostokąta wokół SPoT, upewniając się, że SPoT zawsze pozostaje w granicach prostokąta. Powtórz ten proces do drugiego postu i nagraj go w zestawie drugim.

Dostosuj ustawienia rozmiaru obiektu, aby zapobiec śledzeniu mniejszych obiektów przez program i upewnić się, że liczba śledzonych obiektów w każdym prostokącie pozostaje stała. Interfejs pokazuje zmierzoną odległość między śledzonymi obiektami w czasie rzeczywistym. Użyj tego wykresu, aby monitorować hałas.

Pod nagłówkiem częstotliwości stymulacji w hercach wskaż zakres żądanych częstotliwości i żądany interwał przechodzenia od min do max. W polach po prawej stronie wybierz żądany czas ustawienia, aby umożliwić hECT dostosowanie się do nowej częstotliwości stymulacji, a następnie określ czas nagrywania i napięcie stymulacji. Uruchom program, klikając przycisk uruchamiania programu.

Po zarejestrowaniu danych z jednej częstotliwości zwiększaj częstotliwość stymulatora o żądany interwał dla nowego nagrania, aż do osiągnięcia maksymalnej częstotliwości. Reprezentatywne obrazy hECT są pokazane tutaj widziane od dołu, utworzone bez SPoT i z SPoT. SPoT zapewnił pojedynczy zdefiniowany kształt do śledzenia podczas pozyskiwania danych.

W niektórych skrajnych przypadkach obiekt śledzący był nawet zasłonięty. Bardziej niezawodny kształt do optycznego śledzenia i redukcji szumów umożliwił pomiar słabych tkanek z wytworzonej siłą wynoszącą zaledwie jeden mikroniuton. SPoT zapewniły geometrię czape, która zapobiegła utracie heECT.

Zmierzona funkcja hECT była stabilna przez dłuższy czas hodowli w obecnej konfiguracji stymulacji z podgrzewanym etapem. W porównaniu z pomiarami w temperaturze fizjologicznej, hECT wykazały zmienioną dynamikę skurczu w temperaturze pokojowej, z wolniejszym tempem skurczu i rozluźnienia. Przy wyższych częstotliwościach hECT były zwykle słabsze w temperaturze pokojowej.

Przy niższych częstotliwościach hECT były zwykle silniejsze w temperaturze pokojowej. W tempie 36 stopni Celsjusza hECT miały wyższy spontaniczny wskaźnik dudnień i bardziej ekspansywny zakres częstotliwości przechwytywania. Środowisko o kontrolowanej temperaturze zapewnia fizjologiczne znaczenie mierzonej funkcji hECT.

Ponadto wspólna kąpiel medialna w bioreaktorze wielotkankowym ułatwia badania nad sygnalizacją parakrynną między hECT o różnym składzie komórkowym. Dodanie SPoT do naszego bioreaktora wielotkankowego pozwala naukowcom skutecznie badać chory mięsień sercowy o nienormalnie wysokim lub niskim napięciu, które w przeciwnym razie zsunęłoby się z końców niezasklepionych wkładów.