Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Produkcja genetycznie zmodyfikowanych myszy i analiza ich fenotypu pozwala nam na szczegółowe zrozumienie konkretnych funkcji genów in vivo. Odkryto wiele ważnych odkryć przy użyciu zmodyfikowanych genetycznie modeli zwierzęcych. Metoda, którą tutaj opisujemy, umożliwia wszczepianie komórek macierzystych z długim DNA z akceptowalną wydajnością bez konieczności wyboru leków.

Technika ta jest korzystna nie tylko dla podstawowych nauk przyrodniczych, ale jej odkrycia zostaną również wdrożone w naukach stosowanych, takich jak nauki medyczne i nauki o zwierzętach. Procedurę zademonstrują dr Chihiro Emori, adiunkt i dr Manabu Ozawa, profesor nadzwyczajny z mojego laboratorium. Po przygotowaniu mysiego fibroblastu embrionalnego przygotuj pokryte żelatyną naczynie do hodowli komórek, jak opisano w manuskrypcie i inkubuj je przez dwie godziny w wilgotnym inkubatorze.

Usuń roztwór żelatyny, umyj naczynie dwukrotnie PBS i przechowuj je w temperaturze pokojowej do czasu użycia. Rozmrażać mitotycznie inaktywowany zamrożony wywar MEF za pomocą łaźni wodnej odhartowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Dzień przed wysiewem ESC umieść MEF na 60-milimetrowym naczyniu pokrytym żelatyną.

Rozmrozić zamrożoną probówkę z ESC, jak pokazano wcześniej, i umieść jeden razy 10 do piątego ESC na 60-milimetrowej szalce zawierającej wstępnie zasiew MEF. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki hodowlanej ESC i inkubuj naczynie, aż ESC osiągnie 50 do 70% konfluencji. Po umyciu wyhodowanego ESC czterema mililitrami PBS, trawić je 800 mikrolitrami 0,25% roztworu trypsyny EDTA przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Gdy trypsyna zostanie inaktywowana jednym mililitrem ESCM, dodaj jeden mililitr świeżego ESCM do komórek, przenieś pożywkę do probówki i osadzaj komórki przez odwirowanie w temperaturze 280 G przez pięć minut. Po ponownym zawieszeniu komórek w jednym mililitrze świeżego ESCM, policz stężenie komórek za pomocą licznika komórek z barwieniem błękitem trypanowym. Po przeniesieniu jednego razy 10 do piątego ESC do nowej 1,5-mililitrowej probówki i trzykrotnym umyciu ich PBS przez odwirowanie, ponownie zawieś osad ESC w 12 mikrolitrach mieszaniny DNA Cas9 RNP i dobrze wymieszaj przez delikatne pipetowanie, aby uniknąć bulgotania.

Następnie podać zawieszony ESC do elektroporacji. Następnie hoduj elektroporowane ESC w 60-milimetrowej naczyniu zawierającej cztery mililitry ECSM z mitotycznie inaktywowanym MEF i zmieniaj pożywkę codziennie. Trzy do pięciu dni po elektroporacji przemyj ESC czterema mililitrami PBS, a następnie strawij je 800 mikrolitrami 0,25% trypsyny EDTA i poprowadź hodowlę w wilgotnym inkubatorze.

Następnie dodaj dwa mililitry ESCM, aby zatrzymać trawienie trypsyny. Po granulowaniu mieszaniny komórek ponownie zawieś osad w jednym mililitrze świeżego ESCM i policz stężenie komórek za pomocą licznika komórek z barwieniem błękitem trypanowym. Przejść przez ESC raz od 10 do trzeciej komórki na 60-milimetrową szalkę zawierającą ESCM i MEF podajnika.

Upewnij się, że zmieniasz podłoże, aż kolonia się podniesie. Pięć do siedmiu dni po pierwszym pasażu, po odessaniu ESCM z szalki hodowlanej ESC, dodaj cztery mililitry PBS. Za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów pobierz pojedyncze kolonie ESC z pięcioma mikrolitrami PBS pod mikroskopem stereoskopowym.

Umieść poszczególne kolonie w studzience z okrągłodenną 96-dołkową płytką zawierającą 15 mikrolitrów 0,25% roztworu EDTA trypsyny. Po inkubacji 96-dołkowej płytki przerwij trawienie trypsyny, dodając 80 mikrolitrów ESCM i dysocjując kolonie ESC na pojedyncze komórki przez pipetowanie. W przypadku genotypowania PCR przenieść 40 mikrolitrów zawiesiny ESC na pokrytą żelatyną, niepodawaną, 96-dołkową płytkę zawierającą 50 mikrolitrów ESCM na dołek.

Aby przygotować zamrożony bulion ESC, należy przenieść pozostałe 60 mikrolitrów zawiesiny ESC do studzienki z 24-dołkową płytką pokrytą żelatyną, zawierającą 500 mikrolitrów ESCM i podajnika MEF. Umieść indywidualne klony ESC hodowane na 24-dołkowej płytce, aż osiągną 60 do 80% konfluencji i odzyskaj indywidualne klony ESC przez trypsynizację, jak wykazano wcześniej. Po uzyskaniu osadu komórkowego przez odwirowanie, ponownie zawieś w 500 mikrolitrach pożywki do zamrażania komórek, aby zamrozić komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

W przypadku genotypowania PCR należy przeprowadzić hodowlę klonów ESC, jak wykazano wcześniej, i usunąć ESCM z każdej studzienki przez aspirację, a następnie dwukrotnie przemyć ją 100 mikrolitrami PBS. Po odessaniu PBS dodać 100 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego proteinazę K i dobrze wymieszać. Teraz przenieś lizat ESC do nowej 1,5-mililitrowej probówki i trzymaj go w komorze grzewczej w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę.

Po rozpuszczeniu genomowego DNA w 20 mikrolitrach wody wolnej od DNaz należy określić czystość i stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Po wykonaniu genomowej reakcji PCR przy użyciu zestawów starterów specyficznych dla locus w celu amplifikacji regionu docelowego, sprawdź sekwencję i wybierz klony ESC z pożądanymi sekwencjami knock-in. Po skojarzeniu samic leczonych hormonem z samcami ICR i zebraniu jajowodu, umieść zebrane jajowody w kroplach FHM i odzyskaj zarodki w stadium dwukomórkowym lub czterokomórkowym poprzez przepłukanie jajowodu FHM za pomocą igły płuczącej wprowadzonej do lejka.

Umyj pobrane zarodki, przenosząc je do kilku świeżych kropli FHM za pomocą pipety doustnej. Hoduj zarodki w 50 mikrolitrach KSOM na 35-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowej pokrytym olejem mineralnym, jak wykazano wcześniej, przez jeden dzień, aż do osiągnięcia stadium ośmiokomórkowego lub moruli. Przygotuj szklane pipety do przetrzymywania zarodków i wstrzykiwania ESC za pomocą ściągacza i mikrokuźni.

Po zintegrowaniu pipety podtrzymującej zawierającej FHM w uchwycie kapilarnym podłączonym do mikrowtryskiwacza, należy ustawić ją po lewej stronie mikromanipulatora. Podłącz pipetę iniekcyjną do innego mikrowstrzykiwacza i ustaw ją po prawej stronie. Ustaw dwie pipety prosto w polu widzenia mikroskopu.

Zrób pięciomikrolitrowe krople 12% poliwinylopirolidonu i pięciomikrolitrowe krople FHM na tej samej pokrywie 60-milimetrowego naczynia, obok siebie. Przykryj krople olejem mineralnym. Przenieś zarodki w pięciu mikrolitrach kropli FHM i dodaj od jednego do pięciu mikrolitrów zawiesiny ESC do kropli FHM zawierającej zarodek.

Po umyciu pipety iniekcyjnej poliwinylopirolidonem należy przesunąć pipetę do wstrzykiwań do kropli zawierającej zarodki i ESC. Wybierz trzy pojedyncze dublety ESC, które właśnie zakończyły podział komórek w pipecie iniekcyjnej. Za pomocą pipety podtrzymującej przytrzymać ośmiokomórkowy zarodek lub zarodek w stadium moruli, który zakończył zagęszczenie przez aspirację i wykonać otwór w osłonie przejrzystej za pomocą impulsu piezoelektrycznego.

Wydalić sześciokomórkowy ESC do wnętrza osłonki przejrzystej i wyciągnąć pipetę z zarodków. Delikatnie umyj zarodki, którym wstrzyknięto ESC, kilkoma kroplami KSOM za pomocą pipety doustnej i inkubuj je w nowej kropli KSOM o pojemności 50 mikrolitrów pokrytej olejem mineralnym, jak pokazano wcześniej, aż zarodki rozwiną się do stadium blastocysty. Uzyskuje się amplikon PCR o wielkości specyficznej dla celu knock-in, a 9 z 22 klonów wykazało pasmo specyficzne dla knock-in.

Wyniki te są skuteczne i powtarzalne w przypadku knock-in genów bez doboru leków. Wybranie optymalnej wielkości kolonii ESC jest bardzo ważne dla tej procedury. Unikaj wybierania kolonii, które są za duże lub za małe.

Bezpośrednia edycja genomu za pośrednictwem CRISPR Cas9 przy użyciu zygoty miałaby zastosowanie do tworzenia prostych myszy z nokautem genów. Ten protokół kierowania genów ESC za pośrednictwem CRISPR Cas9 ułatwia produkcję różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy do przyszłej analizy w naukach przyrodniczych.