Name: Izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Odkryj metodę inżynierii i kodowania kreskowego wektorów AAV do terapii genowej. Technika umożliwia szybkie badania przesiewowe wariantów kapsydu, zwiększając skuteczność i specyficzność dostarczania transgenów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.G. bardzo docenia wsparcie ze strony Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) za pośrednictwem Centrów Badawczych DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) i TRR179 (Projektnummer 272983813), a także przez Niemieckie Centrum Badań nad Infekcjami (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

<ol><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li>
<li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li>
<li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li>
<li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+community+grapples+with+toxicity+issues%2C+as+pipeline+matures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).</li>
<li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+at+the+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene therapy at the crossroads.</a> Nature Biotechnology. 40 (5), 621(2022).</li>
<li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification%2C+Rational+Design+and+Machine+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756(2022).</li>
<li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li>
<li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li>
<li>Sahel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+recovery+of+visual+function+in+a+blind+patient+after+optogenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy.</a> Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).</li>
<li>Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+a+high-resolution+functional+map+of+adeno-associated+virus+capsid+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing.</a> Nature Communications. 5, 3075(2014).</li>
<li>Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+biodistribution+analysis+of+adeno-associated+virus+variants+by+double+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041(2015).</li>
<li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li>
<li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li>
<li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li>
<li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li>
<li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li>
<li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li>
<li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432(2020).</li>
<li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li>
<li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li>
<li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3819(2012).</li>
<li>Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+droplet+digital+PCR+as+a+tool+for+titration+and+integrity+evaluation+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).</li>
<li>Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+DNA+barcode+library+generation+for+biomolecule+identification+in+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13899(2017).</li>
<li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+design+and+production+strategies+for+novel+adeno-associated+viral+display+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries.</a> Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).</li>
<li>Korbelin, J., Trepel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+successfully+screen+random+adeno-associated+virus+display+peptide+libraries+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo.</a> Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).</li>
<li>Herrmann, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+all-inclusive+pipeline+for+shuffling+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses.</a> American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).</li>
<li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li>
<li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272(2013).</li>
<li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNABarcodes%3A+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+mouse+transcriptomic+BodyMap+across+17+tissues+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4200(2017).</li>
<li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li>
<li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+design%3A+A+Goldilocks+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li>
<li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825(2021).</li>
</ol>

D.G. jest współzałożycielem AaviGen GmbH. D.G. i K.R. są wynalazcami w oczekującym zgłoszeniu patentowym związanym z generowaniem unikających odporności wariantów kapsydu AAV. Reszta autorów nie ma nic do ujawnienia.

W tym protokole przedstawiono kroki potrzebne do inżynierii kapsydu AAV z wyświetlaczem peptydów oraz do badań przesiewowych biblioteki AAV z kodami kreskowymi, a także do bioinformatycznej analizy składu biblioteki i wydajności kapsydu. Protokół ten koncentruje się na krokach, które ułatwiają analizę bioinformatyczną tego typu bibliotek, ponieważ większość laboratoriów wirusologicznych pozostaje w tyle w umiejętnościach programowania, aby dopasować się do ich biegłości w technikach biologii molekularnej. Oba typy biblio...

Terapia transferu genów polega na wprowadzeniu materiału genetycznego do komórek w celu naprawy, wymiany lub zmiany komórkowego materiału genetycznego w celu zapobiegania, leczenia, leczenia lub łagodzenia choroby. Transfer genów, zarówno in vivo, jak i ex vivo, opiera się na różnych systemach dostarczania, niewirusowych i wirusowych. Wirusy ewoluowały w sposób naturalny, aby skutecznie transdukować swoje komórki docelowe i mogą być wykorzystywane jako wektory dostarczania. Spośród różnych typów wektorów wirusowych stosowanych w terapii genowej, wirusy związane z adenowirusami są coraz częściej stosowane, ze względu na ich brak chorobotwórczości, bezpieczeństwo, niską immunogenność, a co najważniejsze, ich zdolność do podtrzymywania długotrwałej, nieintegrującej ekspresji1,2,3. Terapia genowa AAV przyniosła znaczące osiągnięcia w ciągu ostatniej dekady; Trzy terapie zostały zatwierdzone przez Europejską Agencję Leków i Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków do stosowania u ludzi3,4. Prowadzonych jest również kilka badań klinicznych mających na celu leczenie różnych chorób, takich jak hemofilia, choroby mięśni, serca i neurologiczne, jak omówiono w innym miejscu3. Pomimo dziesięcioleci postępu, dziedzina terapii genowej doświadczyła serii niepowodzeń w ostatnich latach4, przede wszystkim zgonów w badaniach klinicznych5, które zostały wstrzymane z powodu toksyczności ograniczającej dawkę, szczególnie dla tkanek masywnych, takich jak mięśnie, lub trudno dostępnych, takich jak brain6.
Wektory AAV obecnie używane w badaniach klinicznych należą do naturalnych serotypów z kilkoma wyjątkami1. Inżynieria AAV daje możliwość opracowania wektorów o doskonałej specyficzności i wydajności narządów lub komórek. W ciągu ostatnich dwóch dekad z powodzeniem zastosowano kilka podejść, takich jak wyświetlanie peptydów, zamiana pętli, tasowanie DNA kapsydu, podatny na błędy PCR i projektowanie celowane, w celu wygenerowania indywidualnych wariantów AAV lub ich bibliotek o różnych właściwościach7. Są one następnie poddawane wielu rundom ukierunkowanej ewolucji, aby wybrać warianty w nich o pożądanych właściwościach, zgodnie z przeglądem w innym miejscu1,3. Spośród wszystkich strategii ewolucji kapsydu, biblioteki AAV z wyświetlaczem peptydów są najczęściej stosowane, ze względu na pewne unikalne właściwości: są stosunkowo łatwe do wygenerowania i mogą osiągnąć wysoką różnorodność i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, co pozwala śledzić ich ewolucję.
Pierwsze udane biblioteki AAV do wprowadzania peptydów zostały opisane prawie 20 lat temu. W jednym z pierwszych, Perabo i wsp.8 skonstruowali bibliotekę zmodyfikowanych kapsydów AAV2, w której pula losowo generowanych oligonukleotydów została umieszczona w plazmidzie w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 587 białka kapsydu VP1, w trzykrotnej osi wystającej z kapsydu. Wykorzystując koinfekcję adenowirusem, biblioteka AAV ewoluowała przez wiele rund selekcji, a końcowe warianty ponownie ukierunkowane okazały się zdolne do transdukcji linii komórkowych opornych na leczenie do rodzicielskiego AAV28. Wkrótce potem Müller i in.9 wprowadzili dwuetapowy system tworzenia bibliotek, co stanowiło znaczące ulepszenie protokołu. Początkowo biblioteka plazmidów, wraz z plazmidem pomocniczym adenowirusa, jest używana do wytworzenia biblioteki AAV, która zawiera chimeryczne kapsydy. Ta biblioteka wahadłowców AAV służy do infekowania komórek przy niskiej wielokrotności infekcji (MOI), w celu wprowadzenia jednego genomu wirusa na komórkę. Koinfekcja adenowirusem zapewnia produkcję AAV o pasującym genomie i capsid9. Około dekadę później Dalkara10 wykorzystał ewolucję ukierunkowaną in vivo do stworzenia wariantu 7m8. Ten wariant ma insercję 10 aminokwasów (LALGETTRPA), z których trzy działają jako łączniki i skutecznie celuje w zewnętrzną siatkówkę po wstrzyknięciu doszklistkowym10. Ten zmodyfikowany kapsyd jest wyjątkową historią sukcesu, ponieważ jest to jeden z niewielu zmodyfikowanych kapsydów, które do tej pory trafiły do kliniki11.
Dziedzina doświadczyła drugiego impulsu wraz z wprowadzeniem technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Dwie publikacje z Adachi et al.12 w 2014 r. oraz z Marsic et al.13 w 2015 r., pokazały moc NGS w śledzeniu dystrybucji bibliotek kapsydów AAV z kodami kreskowymi z dużą dokładnością. Kilka lat później NGS regionów oznaczonych kodem kreskowym został dostosowany do regionu insercji peptydu, aby podążać za ewolucją kapsydu. Körbelin i wsp.14 przeprowadzili badanie przesiewowe pod kontrolą NGS w celu zidentyfikowania kapsydu opartego na AAV2 ukierunkowanego na płuca. Analiza NGS pomogła obliczyć trzy wyniki oceny: wynik wzbogacenia między rundami selekcji, ogólny wynik swoistości w celu określenia swoistości tkankowej i wreszcie łączny wynik14. W tym samym roku Gradinaru lab15 opublikował system ukierunkowanej ewolucji AAV oparty na rekombinacji Cre (CREATE), który ułatwia selekcję specyficzną dla typu komórki. W tym systemie biblioteka kapsydów zawiera przełącznik odwracalny Cre, ponieważ sygnał polyA jest otoczony przez dwa miejsca loxP. Biblioteka AAV jest następnie wstrzykiwana myszom Cre, gdzie sygnał poliA jest odwracany tylko w komórkach Cre +, zapewniając matrycę do wiązania startera odwrotnego PCR ze starterem do przodu w genie kapsydu. Ten wysoce specyficzny ratunek PCR umożliwił identyfikację AAV-PHP. Wariant B, który może przekroczyć barierę krew-mózg15. System ten został następnie rozwinięty w M-CREATE (Multiplexed-CREATE), w którym NGS i generowanie bibliotek syntetycznych zostały zintegrowane w pipeline16.
Ulepszona, oparta na RNA wersja tego systemu z laboratorium Maguire'a17, iTransduce, umożliwia selekcję na poziomie DNA kapsydów, które funkcjonalnie przekształcają komórki i wyrażają ich genomy. Genom wirusa w bibliotece wyświetlającej peptydy składa się z genu Cre pod kontrolą wszechobecnego promotora i genu kapsydu pod kontrolą promotora p41. Biblioteka jest wstrzykiwana myszom, które mają kasetę loxP-STOP-loxP przed tdTomato. Komórki transdukowane wariantami AAV, które wyrażają genom wirusa, a tym samym Cre wyrażają tdTomato i, w połączeniu z markerami komórkowymi, można sortować i wybierać17. Podobnie, Nonnenmacher et al.18 i Tabebordbar et al.19 umieścili bibliotekę genów kapsydu pod kontrolą specyficznych tkankowo promotorów. Po wstrzyknięciu w różne modele zwierzęce, wirusowe RNA użyto do wyizolowania wariantów kapsydu.
Alternatywnym podejściem jest użycie kodów kreskowych do oznaczania bibliotek capsid. Björklund lab20 wykorzystał to podejście do bibliotek kapsydu do wstawiania peptydów z kodami kreskowymi i opracował racjonalną ewolucję wektorów AAV z kodami kreskowymi (BRAVE). W jednym plazmidzie kaseta Rep2Cap jest klonowana obok transgenu z odwróconym zakończeniem (ITR), eksprymującego żółte białko fluorescencyjne (YFP), oznaczonego kodem kreskowym. Wykorzystując miejsca loxP między końcem nakrętki a początkiem kodu kreskowego, rekombinacja Cre in vitro generuje fragment wystarczająco mały dla NGS, umożliwiając w ten sposób powiązanie insercji peptydu z unikalnym kodem kreskowym (tabela przeglądowa, LUT). Produkcja AAV odbywa się przy użyciu biblioteki plazmidów, a kody kreskowe wyrażone w mRNA są badane przesiewowo po zastosowaniu in vivo, ponownie za pomocą NGS20. Gdy biblioteki kapsydu zawierają warianty całego genu kapsydu (tj. biblioteki przetasowane), należy zastosować sekwencjonowanie z długim odczytem. Kilka grup użyło kodów kreskowych do oznaczania tych różnorodnych bibliotek, co umożliwia NGS większą głębokość odczytu. Kay lab21 oznaczył bardzo zróżnicowane biblioteki tasowania kapsydów z kodami kreskowymi poniżej sygnału poliA czapeczki. W pierwszym kroku wygenerowano bibliotekę plazmidów z kodami kreskowymi, a następnie sklonowano do niej bibliotekę genów kapsydu. Następnie użyto kombinacji MiSeq (krótki odczyt, wyższa głębokość odczytu) i PacBio (długi odczyt, mniejsza głębokość odczytu) NGS, a także sekwencjonowania Sangera, aby wygenerować ich klasę LUT<sup="xref">21. W 2019 roku Ogden i jego koledzy z Church lab22 określili przydatność kapsydu AAV2 do wielu funkcji za pomocą bibliotek, które miały pojedyncze mutacje punktowe, insercje i delecje w każdej pozycji, co ostatecznie umożliwiło projektowanie sterowane maszynowo. W celu wygenerowania biblioteki zsyntetyzowano mniejsze fragmenty genu kapsydu, oznaczono kodem kreskowym, zsekwencjonowano nową generację, a następnie sklonowano do pełnego genu kapsydu. Dane NGS zostały wykorzystane do wygenerowania tablicy LUT. Biblioteka została następnie prześwietlona przy użyciu samych kodów kreskowych i sekwencjonowania krótkiego odczytu, co z kolei pozwala na większą głębokość odczytu22.
Biblioteki z kodami kreskowymi były głównie używane do badania puli znanych, naturalnych i zmodyfikowanych wariantów po kilku rundach selekcji bibliotek kapsydu lub niezależnie od badania ewolucji kapsydu. Zaletą takich bibliotek jest możliwość badania przesiewowego wielu kapsydów, przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby zwierząt i zminimalizowaniu zmienności między zwierzętami. Pierwsze badania, które wprowadziły tę technologię do dziedziny AAV, zostały opublikowane prawie dekadę temu. Nakai lab12 oznaczył 191 podwójnych mutantów alaniny pokrywających aminokwasy od 356 do 736 na VP1 z AAV9 parą 12-nukleotydowych kodów kreskowych. Korzystając z NGS, biblioteka została przebadana in vivo pod kątem wiązania galaktozy i innych właściwości12. Marsic i współpracownicy nakreślili biodystrybucję wariantów AAV, korzystając również z podwójnej analizy linkowej 1 rok później13. W nowszym badaniu na naczelnych porównano biodystrybucję w ośrodkowym układzie nerwowym 29 kapsydów przy użyciu różnych dróg dostarczania23. Nasze laboratorium opublikowało niedawno ekrany biblioteki AAV z kodami kreskowymi dla 183 wariantów, które zawierały naturalne i zmodyfikowane AAV. Te badania przesiewowe na poziomie DNA i RNA doprowadziły do identyfikacji wysoce miotropowego wariantu AAV 24 u myszy, a także innych wykazujących wysoką swoistość typu komórkowego w mózgu myszy 25.
Tutaj opisujemy metodologię użytą w tej pracy i rozszerzamy ją o badania przesiewowe bibliotek wyświetlania peptydów AAV. Obejmuje to generowanie bibliotek wyświetlania peptydów AAV2, metodę cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) do oznaczania ilościowego, a na koniec potok NGS do analizy wariantów AAV, częściowo oparty na pracy Weinmanna i współpracowników24. Na koniec przedstawiono opis generowania bibliotek AAV z kodami kreskowymi oraz potoku NGS wykorzystanego w tej samej publikacji.

<table><tbody><tr><td>Podkład amplifikacyjny</td><td>ELLA Biotech (Monachium, Niemcy)</td><td>-</td><td>Synteza drugiej nici wkładki oligonukleotydowej Odczynniki</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td><td>5067-1504</td><td>Walidacja fragmentów DNA</td></tr><tr><td>System Bioanalyzer Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td><td>Walidacja fragmentów DNA</td> <td>G2938C</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Zestaw&nbsp;</td><td>Qiagen (Venlo, Holandia)</td><td>80204</td><td>Ekstrakcja DNA/RNA</td></tr><tr><td>Odczynniki Agilent DNA 1000</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td><td>5067-1504</td><td>Przygotowanie biblioteki NGS</td></tr><tr><td>System Bioanalyzer Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td><td>G2938C</td><td>Przygotowanie biblioteki NGS</td></tr><tr><td>BC-seq fw:&nbsp;</td><td>IDT (San Joce, Kalifornia, Kalifornia, Stany Zjednoczone)</td><td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&nbsp;</td><td>Przygotowanie biblioteki NGS</td></tr><tr><td>BC-seq rv:&nbsp; &nbsp;</td><td>IDT (San Joce, Kalifornia, Kalifornia, Stany Zjednoczone)</td><td>GGCTGGCAACTAGAAGGCA&nbsp;</td><td>Przygotowanie biblioteki NGS</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td><td>44-420-3250ML</td><td>Ekstrakcja DNA/RNA</td></tr><tr><td>BglI</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td><td>R0143</td><td>Trawienie dwuniciowej wkładki</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1851196</td><td>Cykler dd-PCR</td></tr><tr><td>dNTPS&nbsp;</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td><td>N0447S</td><td>NGS Przygotowanie biblioteki</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1863024</td><td>dd-PCR supermix</td></tr><tr><td>Olej do generowania kropelek do sond</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1863005</td><td>Olej do generowania kropelek dd-PCR</td></tr><tr><td>Wkłady DG8 do generatora kropel QX100 / QX200</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1864008</td><td>Kartridże do generowania kropelek dd-PCR</td></tr><tr><td>Uchwyt na kartridże DG8</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1863051</td><td>Uchwyt na kartridże dd-PCR</td></tr><tr><td>Generator kropel DG8 Uszczelka</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1863009</td><td>Osłona dd-PCR do płytki</td></tr><tr><td>ddPCR 96-dołkowe, półosłonowe</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>12001925</td><td>dd-PCR 96-dołkowa płytka</td></tr><tr><td>E.cloni 10G SUPREME Elektrokompetentny Ogniwa</td><td>Lucigen (Middleton, WI, USA)</td><td>60081-1</td><td>Ogniwa elektrokompetentne</td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji, 1mm</td><td>Biozym Scientific (Oldendorf, Niemcy)</td><td>748050</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>GAPDH mieszanka startera/sondy</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>Mm00186825_cn</td><td>Starter Taqman qPCR</td></tr><tr><td>Genepulser Xcell</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td> do elektroporacji <td>Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)</td><td>4368814</td><td>odwrotna transkrypcja cDNA</td></tr><tr><td>ITR_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>starter dd-PCR</td></tr><tr><td>ITR_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)starter</td> <td>dd-PCR</td></tr><tr><td>ITR_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>Sonda HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR</td></tr><tr><td>System Illumina NextSeq 500</td><td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td><td>Biblioteka SY-415-1001</td><td>NGS sekwencjonowanie</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td> <td>Roche AG (Bazylea, Szwajcaria)</td><td>KK2600 07958919001</td><td>przygotowanie próbki NGS</td></tr><tr><td>MagnaBot 96 Magnetyczne urządzenie separacyjne Promega</td><td>GmbH (Madison, WI, USA)</td><td>V8151</td><td>Przygotowanie próbki do biblioteki NGS</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>ND-2000</td><td>Trawienie wkładki dwuniciowej</td></tr><tr><td>NGS_frw</td><td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td><td>Starter GTT CTG TAT CCA, CCA, ACC NGS</td><td></td></tr><tr><td>NGS_rev</td><td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td><td>Podkład CGC CTT GTG TGT TGA CAT</td><td>C NGS</td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cykli)</td><td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td><td>FC-404-2005</td><td>NGS Biblioteka sekwencjonowania</td></tr><tr><td>System biblioteki Ovation dla próbek o niskiej złożoności Zestaw&nbsp;</td><td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)</td><td>9092-256</td><td>NGS Przygotowanie biblioteki</td></tr><tr><td>PX1 Zgrzewarka do płyt&nbsp;</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1814000</td><td>Zgrzewarka do płytek dd-PCR</td></tr><tr><td>Zgrzewany folia przebijana</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1814040</td><td>Folia uszczelniająca dd-PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>F530S</td><td>Synteza drugiej nici wkładki oligonukleotydowej</td></tr><tr><td>PEI MAX - Liniowy chlorowodorek polietyleniminy klasy transfekcyjnej (MW 40,000)</td><td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)</td><td>24765-1G</td><td>Przygotowanie biblioteki AAV</td></tr><tr><td>ProNex Size-Selective Purification System</td><td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td><td>NG2002</td><td>Przygotowanie próbki dla biblioteki NGS</td></tr><tr><td>Polimeraza Phusion Hot Start II&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>F549L</td><td>NGS Przygotowanie biblioteki</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Roche AG (Bazylea, Szwajcaria)</td><td>5963117103</td><td>Ekstrakcja DNA/RNA</td></tr><tr><td>pRep2Cap2_PIS</td><td></td><td></td><td>wektor ITR-Rep2Cap2-ITR. Miejsce insercji peptydów w Cap2 ORF, wyprodukowane/przygotowane w laboratorium&nbsp;</td></tr><tr><td>Generator kropel QX200</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1864002</td><td>Generator kropel dd-PCR</td></tr><tr><td>Czytnik kropel QX200</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1864003</td><td>Analiza kropel dd-PCR Zestaw</td></tr> do <tr><td>usuwania nukleotydów QIAquick</td><td>Qiagen (Venlo, Holandia)</td><td>28306</td><td>Synteza drugiej nici oczyszczania wkładki oligonukleotydowej</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick</td><td>Qiagen (Venlo, Holandia)</td><td>28704</td><td>Oczyszczanie wektorów plazmidowych</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Holandia)</td><td>12162</td><td>Biblioteka plazmidów Przygotowanie DNA</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCR</td><td>Qiagen (Venlo, Holandia)</td><td>28104</td><td>Przygotowanie próbki do biblioteki NGS</td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Invitrogen (Waltham, MA, USA)</td><td>Q32857</td><td>NGS Przygotowanie biblioteki</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>Q32851</td><td>NGS Przygotowanie biblioteki</td></tr><tr><td>QuantiFast PCR Master Mix</td><td>Qiagen (Venlo, Holandia)</td><td>1044234</td><td>Taqman qPCR</td></tr><tr><td>rep_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td><td>starter dd-PCR</td></tr><tr><td>rep_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>CAATCACGGCGCACATGT</td><td>starter dd-PCR</td></tr><tr><td>rep_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td><td>sonda dd-PCR</td></tr><tr><td>Wolna od RNaz DNaza</td><td>Qiagen (Venlo, Holandia)</td><td>79254</td><td>Ekstrakcja DNA/RNA</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td><td>R0123</td><td>Trawienie wektora</td></tr><tr><td>5 mm, stal Koraliki</td><td>Qiagen (Venlo, Holandia)</td><td>69989</td><td>Ekstrakcja DNA/RNA</td></tr><tr><td>TRIMER-OLIGONUKLEOTYDY</td><td>ELLA Biotech (Monachium, Niemcy)</td><td>-</td><td>Zdegenerowany oligonukleotyd</td></tr><tr><td>T4 Ligaza</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td><td>M0202L</td><td>Ligacja biblioteki plazmidów</td></tr><tr><td>TissueLyserLT</td><td>Qiagen (Venlo, Holandia)</td><td>Ekstrakcja DNA/RNA</td> <td>85600</td></tr><tr><td>YFP_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td><td>starter dd-PCR</td></tr><tr><td>YFP_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>Starter dd-PCR TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td><td></td></tr><tr><td>YFP_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td><td>sonda dd-PCR</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped)</td><td>Badania Zymo (Irvine, CA, USA)</td><td>D4013</td><td>Oczyszczanie wektorów i ligacji</td></tr></tbody></table>

izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (aav)

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Wektory dostarczania genów pochodzące z wirusa związanego z adenowirusem (AAV) są jednym z najbardziej obiecujących narzędzi do leczenia chorób genetycznych, czego dowodem są zachęcające dane kliniczne i zatwierdzenie kilku terapii genowych AAV. Dwa główne powody sukcesu wektorów AAV to (i) wcześniejsza izolacja różnych naturalnie występujących serotypów wirusowych o odrębnych właściwościach oraz (ii) późniejsze opracowanie potężnych technologii inżynierii molekularnej i ponownego wykorzystania w wysokiej przepustowości. Potencjał tych technik dodatkowo zwiększają niedawno wdrożone strategie kodowania kreskowego wybranych kapsydów AAV na poziomie DNA i RNA, co pozwala na ich kompleksową i równoległą stratyfikację in vivo we wszystkich głównych narządach i typach komórek u jednego zwierzęcia. W tym miejscu przedstawiamy podstawowy rurociąg obejmujący ten zestaw uzupełniających się ścieżek, wykorzystując wyświetlacz peptydów AAV do reprezentowania różnorodnego arsenału dostępnych technologii inżynieryjnych kapsydu. W związku z tym najpierw opisujemy kluczowe etapy generowania biblioteki wyświetlania peptydów AAV w celu selekcji in vivo kandydatów o pożądanych właściwościach, a następnie pokazujemy, jak kodować kreskowo najciekawsze warianty kapsydu do wtórnych badań przesiewowych in vivo. Następnie przedstawimy przykładową metodologię tworzenia bibliotek do sekwencjonowania nowej generacji (NGS), w tym wzmacniania kodów kreskowych i ligacji adapterów, a na koniec omówimy najważniejsze kroki podczas analizy danych NGS. Ponieważ przedstawione tutaj protokoły są wszechstronne i można je dostosować, naukowcy mogą je łatwo wykorzystać do wzbogacenia optymalnych wariantów kapsydu AAV w swoim ulubionym modelu choroby i do zastosowań w terapii genowej.

Generowanie biblioteki AAV2 z ekspozycją peptydów. W pierwszym kroku w kierunku selekcji zmodyfikowanych AAV opisano generowanie biblioteki plazmidowej. Wstawka peptydowa jest wytwarzana przy użyciu starterów degenerowanych. Redukcja kombinacji kodonów z 64 do 20 ma na celu wyeliminowanie kodonów stop oraz ułatwienie analizy NGS poprzez zmniejszenie różnorodności biblioteki na poziomie DNA, przy jednoczesnym zachowaniu jej różnorodności na poziomie białka. Oligonukleotydowa wstawka jest zamawiana w formi...

AAV generowanie biblioteki wyświetlania peptydów i późniejsza walidacja poprzez kodowanie kreskowe kandydatów o nowych właściwościach do tworzenia AAV nowej generacji.

Izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (AAV)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Protokół ten wypełnia znaczącą lukę między naturalną ewolucją wirusów a ich wykorzystaniem jako wektorów rekombinowanych w terapii genowej u ludzi, umożliwiając ich inżynierię, dywersyfikację i stratyfikację. Technika ta pozwala na wysokoprzepustowe, równoległe badania przesiewowe pod kątem nowych, izolowanych lub zmodyfikowanych wariantów wirusa związanego z adenowirusem, w skrócie AAV, oszczędzając w ten sposób liczbę zwierząt, pracę, koszty i czas. Zidentyfikowane warianty kapsydu AVV mogą zwiększyć skuteczność i swoistość dostarczania terapeutycznych transgenów na podstawie AAV, zmniejszając w ten sposób wymaganą dawkę wirusa.Może to poprawić bezpieczeństwo i możliwość zastosowania terapii genowej. To samo podejście można również zastosować w inżynierii kapsydu lub promotora innych nośników dostarczania genów, co poprawia naszą wiedzę na temat ich biologii i zastosowania w terapii genowej. W zademonstrowaniu procedury pomogą doktoranci Jonas Becker i Jixin Liu, post-doc Joanna Szumska i Margarita Zayas, a także asystenci naukowi Emma Gerstmann i Ellen Widtke z mojego laboratorium.Zacznij od przeanalizowania danych sekwencjonowania NGS za pomocą Pythona 3 i Biopythona. Analiza NGS składa się z dwóch etapów. W pierwszym kroku przeszukaj pliki sekwencji w poszukiwaniu sekwencji, które spełniają określone kryteria, takie jak sekwencje flankujące, długość i lokalizacja, przy użyciu pierwszego skryptu i pliku konfiguracyjnego, który zawiera potrzebne informacje.W drugim kroku przetłumacz wyodrębnione sekwencje, zaczynając od sekwencji AGWGGC, używając skryptu numer dwa oraz plików konfiguracyjnych i zuordnung. txt, które dostarczają potrzebnych informacji. Przygotuj dwa foldery: skrypt i dane.Skopiuj skompresowane pliki Gzip powstałe w wyniku sekwencjonowania do folderu danych. Następnie skopiuj pliki Pythona i pliki konfiguracyjne do folderu skryptu zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Przed uruchomieniem skryptów otwórz zuordnung.txt i dodaj dwie kolumny rozdzielone tabulatorami. Wprowadź nazwy plików Gzip w kolumnie pierwszej i żądaną nazwę końcową w kolumnie drugiej. Zmień zmienne w pliku konfiguracyjnym zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu.Za pomocą określonego polecenia zainicjuj wykrywanie i wyodrębnianie sekwencji wariantów. Wyjściem będą pliki TXT z wyekstrahowanymi sekwencjami DNA i ich liczbą odczytów. Nagłówek tego pliku zawiera dane statystyczne i dane te zostaną przeniesione do następujących plików.Te dane TXT będą plikiem wejściowym dla skryptu numer dwa, w którym sekwencje DNA są tłumaczone, klasyfikowane i analizowane. Za pomocą określonego polecenia zainicjuj translację PV i analizę plików wyjściowych tekstu pierwszego skryptu, zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Pliki wyjściowe skryptu numer dwa zostaną nazwane przy użyciu drugiej kolumny tabeli przeglądowej w zuordnung.TXT z rozszerzeniami w zależności od typu analizy. Upewnij się, że trzy pliki wyjściowe zawierają dane statystyczne w pierwszych wierszach i pierwszą kolumnę z indeksem każdej sekwencji DNA z wejściowych plików tekstowych. Pozostałe kolumny powinny składać się z sekwencji DNA, liczby odczytów, odczytu do przodu lub do tyłu oraz translowanej sekwencji peptydowej.Nieprawidłowe sekwencje powinny mieć wartość NA i nieprawidłową w dwóch ostatnich kolumnach. Wizualizuj pliki wyjściowe za pomocą dostępnego oprogramowania w zależności od potrzeb użytkownika. Aby przeprowadzić analizę danych sekwencjonowania NGS przy użyciu niestandardowego kodu w Pythonie 3, przepływ pracy obejmuje wykrywanie sekwencji kodów kreskowych kierowanych przez sekwencje flankujące, ich długość i lokalizację, a także analizę wzbogacania i dystrybucji kodów kreskowych w zestawie tkanek.Przygotuj dwa foldery: skrypt i dane. Skopiuj skompresowane pliki Gzip powstałe w wyniku sekwencjonowania do folderu danych. Następnie skopiuj pliki Pythona i pliki konfiguracyjne do folderu skryptu zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.Przed wykonaniem skryptu utwórz dwa pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami: plik capsidvariance. txt z sekwencjami kodów kreskowych przypisanymi do nazw wariantów kapsydu AAV oraz plik contamination. txt z sekwencjami kodów kreskowych, które pochodzą z możliwego zanieczyszczenia.Na koniec edytuj plik konfiguracyjny, aby zawierał informacje o ścieżce do folderu z danymi sekwencjonowania, kolejności obszarów flankujących kody kreskowe, ich położeniu i rozmiarze okna do wykrywania kodów kreskowych. Wykonaj skrypt wykrywania kodów kreskowych z podanymi ścieżkami i plikami konfiguracyjnymi za pomocą odpowiedniego polecenia. Danymi wyjściowymi tego wykonania polecenia będą pliki TXT z przeliczeniami na wariant capsid i łączną liczbą odczytów odzyskanych z nieprzetworzonych danych.Aby ocenić rozkład kapsydu AAV z kodem kreskowym w tkankach lub narządach, w pliku zuordnung. txt przypisz nazwę każdego pliku tekstowego uzyskanego w wyniku wykrywania kodów kreskowych do nazwy tkanki lub narządu. Dodaj nazwy plików tekstowych w pierwszej kolumnie i odpowiadające im nazwy tkanek lub narządów w przypisaniu rozdzielanym tabulatorami.Utwórz plik organs. txt z listą nazw narządów docelowych i pozadocelowych, które odpowiadają nazwom podanym w pliku zuordnung. txt przypisania.Następnie utwórz pliki tekstowe rozdzielane normalization_organ. txt normalization_variant. txt tabulatorami ze znormalizowanymi wartościami dla wszystkich wariantów kapsydu oraz wszystkich narządów i tkanek.W pierwszej kolumnie z plikiem normalization_organ. txt wpisz nazwy podane dla każdego narządu, a w drugiej kolumnie z wartościami normalizacji dla odpowiedniej tkanki. Wypełnij pierwszą kolumnę normalization_variant.txt z listą nazw capsID i drugą kolumną ze znormalizowanymi wartościami liczby odczytów dla każdego capsID w bibliotece w puli. Edytuj plik konfiguracyjny, określając pełne ścieżki do wszystkich dodatkowych plików i wykonaj skrypt analizy kodów kreskowych za pomocą tego konkretnego polecenia. Skrypt analizy kodów kreskowych generuje kilka plików, takich jak pliki tekstowe ze względnym stężeniem lub wartościami RC rozkładu kapsydu w różnych tkankach w oparciu o wiele opisanych wcześniej etapów normalizacji oraz plik arkusza kalkulacyjnego, który łączy dane z pliku tekstowego w scalone dane macierzy.Wizualizuj dane i przeprowadź analizę skupień danych macierzowych zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Skrypt wprowadzi relativeconcentration. xls i wygeneruj dwa wykresy hierarchicznej mapy cieplnej klastra i analizy głównych składowych.Aby zmodyfikować wykresy lub parametry PNG, otwórz skrypt języka R i postępuj zgodnie z instrukcjami w sekcji komentarzy. Ilościowo określone regiony genu przedstawiciela AAV2 wykazały, że 99,2% było dodatnich dla ITR, co sugeruje, że kapsydy AAV zawierały całe genomy wirusa. We wszystkich trzech zestawach wyodrębnione odczyty oparte na sekwencjach sygnatur specyficznych dla biblioteki stanowiły około 94% wszystkich odczytów, co wskazuje na dobrą jakość.Spośród nich ponad 99% stanowiły prawidłowe odczyty PV, a ponad 99% ważnych odczytów PV było unikalnych, co sugeruje, że biblioteka była zrównoważona z dużą różnorodnością wewnętrzną. Dwie główne gałęzie hierarchii mapy cieplnej odzwierciedlały różnicę w wydajności transdukcji wariantów kapsydu. Lewa gałąź z większością wariantów kapsydu zawierała wszystkie kapsydy, które wykazywały wysoką względną wartość stężenia w większości tkanek.Oprócz uderzająco wysokiej specyficzności wątrobowej, trzy inne kapsydy wykazywały swoistość w przeponie, mięśniach szkieletowych, bicepsach i mózgu. Prawa gałąź hierarchicznego grupowania obejmowała warianty kapsydu, o ogólnie niższej wydajności transdukcji, najbardziej widocznej w dwunastnicy i trzustce. Analiza głównych składowych dla pierwotnego podzbioru tworzy klaster wariantów kapsydu o wysokiej swoistości wątrobowej i nakreśla wyjątkowy tropizm mięśniowy kapsydu VAR60.Próbując tego protokołu, należy zwrócić uwagę na błędy w pisowni. Składnia jest również inna, jeśli używasz wiersza polecenia systemu Windows w porównaniu z systemem Linux. Po zidentyfikowaniu nowych wariantów AAV należy zweryfikować potencjał terapeutyczny i translacyjny na martwym lub większym modelu zwierzęcym.Technika ta umożliwia bezpośrednie porównanie wariantów AAV w identycznych warunkach i jest niezwykle wszechstronna, torując drogę do jej translacji u dużych zwierząt, a nawet u ludzi.

isolation-next-generation-gene-therapy-vectors-through-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Prezentujemy podstawową technikę inżynierii molekularnej i ewolucji syntetycznych wektorów do terapii genowej opartych na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA (DNA family shuffling). Ponadto przedstawiamy ogólne wytyczne oraz reprezentatywne przykłady selekcji i analizy poszczególnych chimerycznych kapsydów o ulepszonych właściwościach w odniesieniu do komórek docelowych w hodowli lub u myszy.

Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji dobrych praktyk laboratoryjnych w zakresie zgodnego wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wsparcia klinicznego rozwoju wektorów terapii genowej.

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Ten protokół ma na celu przedstawienie metody produkcji i oczyszczania biomimetyków pochodzących od mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) dla terapii genowej. Nanowezykul jest ograniczony MSC-pochodnymi dwuwarstwowami lipidowymi i zawiera rekombinowane AAV przenoszące gen interesujący się w świetle. Ta nanowezykul oferuje ulepszony wektor dla in vivo dostarczania genów.

Opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów

Odkryj metodę inżynierii i kodowania kreskowego wektorów AAV do terapii genowej. Technika umożliwia szybkie badania przesiewowe wariantów kapsydu, zwiększając skuteczność i specyficzność dostarczania transgenów terapeutycznych.

Izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (AAV)

Przeglądaj więcej filmów