Izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (AAV)
October 18th, 2022
AAV generowanie biblioteki wyświetlania peptydów i późniejsza walidacja poprzez kodowanie kreskowe kandydatów o nowych właściwościach do tworzenia AAV nowej generacji.
Protokół ten wypełnia znaczącą lukę między naturalną ewolucją wirusów a ich wykorzystaniem jako wektorów rekombinowanych w terapii genowej u ludzi, umożliwiając ich inżynierię, dywersyfikację i stratyfikację. Technika ta pozwala na wysokoprzepustowe, równoległe badania przesiewowe pod kątem nowych, izolowanych lub zmodyfikowanych wariantów wirusa związanego z adenowirusem, w skrócie AAV, oszczędzając w ten sposób liczbę zwierząt, pracę, koszty i czas. Zidentyfikowane warianty kapsydu AVV mogą zwiększyć skuteczność i swoistość dostarczania terapeutycznych transgenów na podstawie AAV, zmniejszając w ten sposób wymaganą dawkę wirusa.
Może to poprawić bezpieczeństwo i możliwość zastosowania terapii genowej. To samo podejście można również zastosować w inżynierii kapsydu lub promotora innych nośników dostarczania genów, co poprawia naszą wiedzę na temat ich biologii i zastosowania w terapii genowej. W zademonstrowaniu procedury pomogą doktoranci Jonas Becker i Jixin Liu, post-doc Joanna Szumska i Margarita Zayas, a także asystenci naukowi Emma Gerstmann i Ellen Widtke z mojego laboratorium.
Zacznij od przeanalizowania danych sekwencjonowania NGS za pomocą Pythona 3 i Biopythona. Analiza NGS składa się z dwóch etapów. W pierwszym kroku przeszukaj pliki sekwencji w poszukiwaniu sekwencji, które spełniają określone kryteria, takie jak sekwencje flankujące, długość i lokalizacja, przy użyciu pierwszego skryptu i pliku konfiguracyjnego, który zawiera potrzebne informacje.
W drugim kroku przetłumacz wyodrębnione sekwencje, zaczynając od sekwencji AGWGGC, używając skryptu numer dwa oraz plików konfiguracyjnych i zuordnung. txt, które dostarczają potrzebnych informacji. Przygotuj dwa foldery: skrypt i dane.
Skopiuj skompresowane pliki Gzip powstałe w wyniku sekwencjonowania do folderu danych. Następnie skopiuj pliki Pythona i pliki konfiguracyjne do folderu skryptu zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Przed uruchomieniem skryptów otwórz zuordnung.
txt i dodaj dwie kolumny rozdzielone tabulatorami. Wprowadź nazwy plików Gzip w kolumnie pierwszej i żądaną nazwę końcową w kolumnie drugiej. Zmień zmienne w pliku konfiguracyjnym zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu.
Za pomocą określonego polecenia zainicjuj wykrywanie i wyodrębnianie sekwencji wariantów. Wyjściem będą pliki TXT z wyekstrahowanymi sekwencjami DNA i ich liczbą odczytów. Nagłówek tego pliku zawiera dane statystyczne i dane te zostaną przeniesione do następujących plików.
Te dane TXT będą plikiem wejściowym dla skryptu numer dwa, w którym sekwencje DNA są tłumaczone, klasyfikowane i analizowane. Za pomocą określonego polecenia zainicjuj translację PV i analizę plików wyjściowych tekstu pierwszego skryptu, zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Pliki wyjściowe skryptu numer dwa zostaną nazwane przy użyciu drugiej kolumny tabeli przeglądowej w zuordnung.
TXT z rozszerzeniami w zależności od typu analizy. Upewnij się, że trzy pliki wyjściowe zawierają dane statystyczne w pierwszych wierszach i pierwszą kolumnę z indeksem każdej sekwencji DNA z wejściowych plików tekstowych. Pozostałe kolumny powinny składać się z sekwencji DNA, liczby odczytów, odczytu do przodu lub do tyłu oraz translowanej sekwencji peptydowej.
Nieprawidłowe sekwencje powinny mieć wartość NA i nieprawidłową w dwóch ostatnich kolumnach. Wizualizuj pliki wyjściowe za pomocą dostępnego oprogramowania w zależności od potrzeb użytkownika. Aby przeprowadzić analizę danych sekwencjonowania NGS przy użyciu niestandardowego kodu w Pythonie 3, przepływ pracy obejmuje wykrywanie sekwencji kodów kreskowych kierowanych przez sekwencje flankujące, ich długość i lokalizację, a także analizę wzbogacania i dystrybucji kodów kreskowych w zestawie tkanek.
Przygotuj dwa foldery: skrypt i dane. Skopiuj skompresowane pliki Gzip powstałe w wyniku sekwencjonowania do folderu danych. Następnie skopiuj pliki Pythona i pliki konfiguracyjne do folderu skryptu zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.
Przed wykonaniem skryptu utwórz dwa pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami: plik capsidvariance. txt z sekwencjami kodów kreskowych przypisanymi do nazw wariantów kapsydu AAV oraz plik contamination. txt z sekwencjami kodów kreskowych, które pochodzą z możliwego zanieczyszczenia.
Na koniec edytuj plik konfiguracyjny, aby zawierał informacje o ścieżce do folderu z danymi sekwencjonowania, kolejności obszarów flankujących kody kreskowe, ich położeniu i rozmiarze okna do wykrywania kodów kreskowych. Wykonaj skrypt wykrywania kodów kreskowych z podanymi ścieżkami i plikami konfiguracyjnymi za pomocą odpowiedniego polecenia. Danymi wyjściowymi tego wykonania polecenia będą pliki TXT z przeliczeniami na wariant capsid i łączną liczbą odczytów odzyskanych z nieprzetworzonych danych.
Aby ocenić rozkład kapsydu AAV z kodem kreskowym w tkankach lub narządach, w pliku zuordnung. txt przypisz nazwę każdego pliku tekstowego uzyskanego w wyniku wykrywania kodów kreskowych do nazwy tkanki lub narządu. Dodaj nazwy plików tekstowych w pierwszej kolumnie i odpowiadające im nazwy tkanek lub narządów w przypisaniu rozdzielanym tabulatorami.
Utwórz plik organs. txt z listą nazw narządów docelowych i pozadocelowych, które odpowiadają nazwom podanym w pliku zuordnung. txt przypisania.
Następnie utwórz pliki tekstowe rozdzielane normalization_organ. txt normalization_variant. txt tabulatorami ze znormalizowanymi wartościami dla wszystkich wariantów kapsydu oraz wszystkich narządów i tkanek.
W pierwszej kolumnie z plikiem normalization_organ. txt wpisz nazwy podane dla każdego narządu, a w drugiej kolumnie z wartościami normalizacji dla odpowiedniej tkanki. Wypełnij pierwszą kolumnę normalization_variant.
txt z listą nazw capsID i drugą kolumną ze znormalizowanymi wartościami liczby odczytów dla każdego capsID w bibliotece w puli. Edytuj plik konfiguracyjny, określając pełne ścieżki do wszystkich dodatkowych plików i wykonaj skrypt analizy kodów kreskowych za pomocą tego konkretnego polecenia. Skrypt analizy kodów kreskowych generuje kilka plików, takich jak pliki tekstowe ze względnym stężeniem lub wartościami RC rozkładu kapsydu w różnych tkankach w oparciu o wiele opisanych wcześniej etapów normalizacji oraz plik arkusza kalkulacyjnego, który łączy dane z pliku tekstowego w scalone dane macierzy.
Wizualizuj dane i przeprowadź analizę skupień danych macierzowych zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Skrypt wprowadzi relativeconcentration. xls i wygeneruj dwa wykresy hierarchicznej mapy cieplnej klastra i analizy głównych składowych.
Aby zmodyfikować wykresy lub parametry PNG, otwórz skrypt języka R i postępuj zgodnie z instrukcjami w sekcji komentarzy. Ilościowo określone regiony genu przedstawiciela AAV2 wykazały, że 99,2% było dodatnich dla ITR, co sugeruje, że kapsydy AAV zawierały całe genomy wirusa. We wszystkich trzech zestawach wyodrębnione odczyty oparte na sekwencjach sygnatur specyficznych dla biblioteki stanowiły około 94% wszystkich odczytów, co wskazuje na dobrą jakość.
Spośród nich ponad 99% stanowiły prawidłowe odczyty PV, a ponad 99% ważnych odczytów PV było unikalnych, co sugeruje, że biblioteka była zrównoważona z dużą różnorodnością wewnętrzną. Dwie główne gałęzie hierarchii mapy cieplnej odzwierciedlały różnicę w wydajności transdukcji wariantów kapsydu. Lewa gałąź z większością wariantów kapsydu zawierała wszystkie kapsydy, które wykazywały wysoką względną wartość stężenia w większości tkanek.
Oprócz uderzająco wysokiej specyficzności wątrobowej, trzy inne kapsydy wykazywały swoistość w przeponie, mięśniach szkieletowych, bicepsach i mózgu. Prawa gałąź hierarchicznego grupowania obejmowała warianty kapsydu, o ogólnie niższej wydajności transdukcji, najbardziej widocznej w dwunastnicy i trzustce. Analiza głównych składowych dla pierwotnego podzbioru tworzy klaster wariantów kapsydu o wysokiej swoistości wątrobowej i nakreśla wyjątkowy tropizm mięśniowy kapsydu VAR60.
Próbując tego protokołu, należy zwrócić uwagę na błędy w pisowni. Składnia jest również inna, jeśli używasz wiersza polecenia systemu Windows w porównaniu z systemem Linux. Po zidentyfikowaniu nowych wariantów AAV należy zweryfikować potencjał terapeutyczny i translacyjny na martwym lub większym modelu zwierzęcym.
Technika ta umożliwia bezpośrednie porównanie wariantów AAV w identycznych warunkach i jest niezwykle wszechstronna, torując drogę do jej translacji u dużych zwierząt, a nawet u ludzi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół dotyczy inżynierii i dywersyfikacji adeno-związanych wirusów (AAV) dla zastosowań w terapii genowej. Umożliwia przesiewowe badanie AAV wariantów w celu poprawy ich skuteczności i specyficzności w dostarczaniu terapeutycznych transgenów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Inżynieria wektorów wirusowych
- Adeno-związane wirusy
Tło
- AAV są powszechnie stosowane jako rekombinantne wektory w terapii genowej.
- Inżynieria AAV może poprawić ich zdolności dostarczania.
- Przesiewowe badania mogą zmniejszyć zużycie zasobów w badaniach.
- Zrozumienie biologii AAV jest kluczowe dla zastosowań terapeutycznych.
Cel badania
- Generowanie biblioteki do wyświetlania peptydów dla AAV.
- Walidacja kandydatów AAV o nowych właściwościach.
- Poprawa specyficzności i skuteczności dostarczania genów opartego na AAV.
Stosowane metody
- Generowanie bibliotek do wyświetlania peptydów AAV.
- Kodowanie kandydatów AAV dla identyfikacji.
- Techniki przesiewowych badań.
- Współpraca z doktorantami i asystentami badań.
Główne wyniki
- Identyfikacja nowych wariantów kapsydu AAV.
- Demonstracja poprawionej skuteczności dostarczania.
- Zmniejszenie wymaganych dawek wirusowych dla terapii.
- Potencjalne zastosowania dla innych nośników dostarczania genów.
Konkluzje
- Protokół łączy luki w inżynierii AAV dla terapii genowej.
- Oferuje ramy dla poprawy specyficzności wektorów wirusowych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne systemy dostarczania genów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput engineering, barcoding, and screening of AAV capsid variants enable rapid identification of gene therapy vectors with optimized tissue specificity and transduction efficiency. This approach streamlines early vector discovery, reduces animal usage, and accelerates the translation of next-generation gene delivery systems. The methodology supports portfolio-wide de-risking and prioritization of candidates for preclinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of AAV capsid diversity for functional target validation.
- Supports biological de-risking by clarifying tissue tropism and transduction profiles.
- Facilitates predictive confidence in vector selection for downstream development.
Screening & Assay Development
- Prepares barcoded AAV libraries for robust, parallel in vivo screening across multiple tissues.
- Standardizes quantitative readouts via NGS-based barcode analysis for reproducibility.
- Enables scalable, side-by-side evaluation of capsid variants under identical conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns vector selection with disease-relevant tissue targeting and translational biomarker needs.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct comparison in relevant models.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative tissue distribution data.
Pipeline & Workflow Integration
This methodology integrates from early discovery through lead identification and preclinical vector validation, providing a reusable platform for gene therapy vector optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of capsid function and tissue targeting via high-throughput screening.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative barcode-based outputs for robust variant comparison.
- Analytics: Provides statistical analysis of variant distribution, enrichment, and tissue specificity using NGS data.
- Translational Research: Enables alignment of vector properties with preclinical and disease-relevant endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a modular workflow adaptable to new capsid libraries and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vector selection.
- Operational Value: Standardizes and scales vector screening, reducing resource and animal use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by focusing on high-performing candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of gene therapy vectors.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, NGS library preparation, and bioinformatics analysis.
- Depends on access to sequencing infrastructure and computational resources for data processing.
- Demands rigorous cross-team standardization of barcode assignment and normalization protocols.
- Adaptable to various AAV libraries and tissue models with appropriate configuration.
- Attention to data integrity, file management, and error minimization is critical for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:16
Analysis of the AAV Viral Library (In Vitro) by NGS
3:42
Analysis of AAV Viral Library (In Vivo) by NGS
7:08
Results: Peptide Display AAV Capsid Engineering and Barcoded AAV Library Screening for Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors
8:36
Conclusion
