Śledzenie transportu limfocytów T indukowanych przez bispecyficzne przeciwciała przy użyciu ludzkich limfocytów T transdukowanych lucyferazą

Metoda ta umożliwia użytkownikom łatwe śledzenie limfocytów T in vivo w celu oceny kinetyki naprowadzania i monitorowania trwałości limfocytów T. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją powtórzyć w wielu punktach czasowych na tym samym zwierzęciu bez konieczności poświęcania w cytometrii przepływowej lub immunohistochemii. Technika ta może być również modyfikowana w celu śledzenia innych typów komórek odpornościowych.

Aby wyhodować komórki 293T, przygotuj jeden litr DMEM, dodając 110 mililitrów inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i 11 mililitrów penicyliny streptomycyny. Rozmrozić pięć razy po 10 do szóstych komórek 293T i przenieść je do kolby T175 zawierającej DMEM. Podziel komórki od jednej do 10 co trzy dni przez sześć dni, zanim komórki staną się zlewające się w ponad 90%.

W celu transfekcji przenieś 1,5 mililitra pożywki do dwóch 50-mililitrowych probówek za pomocą pipety. Do jednej probówki dodaj 10 mikrogramów plazmidu VSVG, 20 mikrogramów knebla pol i 20 mikrogramów czerwonego chrząszcza TDtomato lub plazmidu lucyferazy CBRTDR i wymieszaj. Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika do transfekcji DNA in vitro do innej probówki i wymieszaj.

Inkubować obie probówki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Przenieść pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji DNA in vitro kroplami do probówki zawierającej plazmidy DNA i delikatnie wymieszać pipetą. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Podczas inkubacji odłącz komórki 293T, dodając od pięciu do 10 mililitrów 0,05% trypsyny. Po odłączeniu komórek dodać 10 mililitrów pożywki i wirować przy 800 G przez pięć minut. Ponownie zawieś ogniwa w 1,5 mililitra pożywki.

Dodać pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji DNA in vitro i plazmidy DNA do komórek 293T i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji przenieść zawiesinę do kolby T175. Dodaj 18 mililitrów pożywki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia ostrożnie odessać pożywkę szklaną pipetą bez odłączania komórek i zastąpić ją 18 mililitrami świeżej pożywki. Ponownie inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia usunąć supernatant wirusa za pomocą pipety umieszczonej na lodzie i odwirować przy 800 G przez pięć minut w celu osadzenia komórek i zanieczyszczeń.

Przefiltruj supernatant wirusa za pomocą filtra 0,22 mikrona i natychmiast umieść go na lodzie. W celu aktywacji ludzkich limfocytów T in vitro dodaj 10 mililitrów PBS zawierających 0,1% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA i dwa milimolowe EDTA do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie, aby umyć koraliki, dodaj koraliki do rurki i umieść rurkę w stojaku magnetycznym.

Po dwóch minutach wyjmij PBS z probówki. Po przygotowaniu DMEM dodać umyte kulki i interleukinę-2 lub IL-2 do końcowego stężenia 30 jednostek międzynarodowych na mililitr. Policz limfocyty T za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypana.

Po zliczeniu dodaj żądaną liczbę limfocytów T do pożywki i delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać. Płytka 2,5 mililitra pożywki zawierającej dwa miliony limfocytów T, kulek i IL-2 w każdym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Hodowla w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym 5% dwutlenku węgla.

Badaj limfocyty T pod obiektywem 20X codziennie przez trzy dni, aby określić, kiedy należy transdukować lucyferazy. Następnie, aby przygotować płytkę RetroNectin, dodaj dwa mililitry po 20 mikrogramów na mililitr RetroNectin w PBS do dołka niepoddanej działaniu substancji płytki sześciodołkowej i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Zassać RetroNectin bez drapania dna płytki i dodać trzy mililitry 2% BSA w PBS na dołek w płytce sześciodołkowej.

Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, w celu spinokulacji, odessać BSA i raz umyć studzienki trzema mililitrami PBS. Kontynuuj lub zastąp świeżym PBS i pozostaw płytkę pod przykryciem w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc.

Następnego dnia dodać dwa mililitry supernatantu wirusa lucyferazy CBRTDR do dołka i odwirować przy 1,240 G przez 90 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza. W celu transdukcji, po zliczeniu limfocytów T, odessać supernatant wirusa i umieścić dwa miliony limfocytów T na studzience w sześciu mililitrach DMEM zawierających 30 jednostek międzynarodowych na mililitr ludzkiej IL-2. Badaj limfocyty T przez dwa dni.

Gdy komórki są już prawie zlewające się, delikatnie zmyj je z dna płytki za pomocą pipety i przenieś każdą studzienkę do oddzielnej kolby T75. Dodaj dziewięć mililitrów pożywki, co daje w sumie 15 mililitrów objętości na kolbę. Następnego dnia dodaj 15 mililitrów pożywki i potwierdź pomyślną transdukcję, wykonując cytometrię przepływową.

Po znieczuleniu myszy, za pomocą igły o rozmiarze 26, wstrzyknij 20 milionów limfocytów T w 100 mikrolitrach pożywki zaoczodoczodołowo. Podaj podskórnie 1 000 jednostek rekombinowanej IL-2, aby wspomóc przeżycie limfocytów T in vivo. Następnie podać bispecyficzne przeciwciało zaoczodołowo lub dootrzewnowo.

W przypadku obrazowania in vivo należy podać 100 mikrolitrów trzech miligramów D-lucyferyny przez wstrzyknięcie zaoczodołowe za pomocą igły o rozmiarze 26 w znieczulonej myszy. Aby uchwycić obrazy, umieść mysz w szczelnej komorze kamery tak, aby bok, w którym znajduje się ksenoprzeszczep, był skierowany do góry w kierunku kamery. Korzystając z panelu sterowania akwizycją, wybierz luminescencyjną, fotograficzną i nakładkę.

Ustaw czas ekspozycji na automatyczny, binning na średni, a przysłonę na jeden i rejestruj obrazy. Po pierwszym zdjęciu ustaw czas ekspozycji tak, aby był zgodny z czasem automatycznie obliczonym dla pierwszego obrazu, aby można było bezpośrednio porównywać kolejne obrazy. Wykonaj kolejny zestaw zdjęć z leżącym na wznak myszy, aby ocenić obecność limfocytów T w płucach.

Uzbrojone limfocyty T transportowały się do guza szybciej niż nieuzbrojone limfocyty T, opuszczając płuca dwa dni wcześniej. Ilościowość infiltracji limfocytów T do guzów w czasie mierzono za pomocą bioluminescencji i wyrażano jako całkowite stada lub promieniowanie na piksel zintegrowane z konturem guza. Ruch limfocytów T można monitorować przez 28 dni po wstrzyknięciu limfocytów T transdukowanych lucyferazy, co pozwala na śledzenie naprowadzania limfocytów T i utrzymywania się przez cały okres leczenia.

Pokazano transport limfocytów T do HER2-dodatnich ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z ludzkim rakiem piersi u myszy DKO. Leczenie bispecyficznym przeciwciałem HER2 z niewyciszonym FC nie miało wpływu na wzrost guza w porównaniu z kontrolowanym przeciwciałem bispecyficznym. Natomiast leczenie bispecyficznym przeciwciałem HER2 zawierającym mutację N297A samodzielnie lub w połączeniu z mutacją K322A było w stanie całkowicie zatrzymać wzrost guza.

W przypadku grup z mutacjami wyciszającymi sygnał luminescencji limfocytów T osiągnął wyższy szczyt w trzecim dniu po wstrzyknięciu i utrzymywał się na wyższym poziomie w porównaniu z kontrolowanym przeciwciałem bispecyficznym i niewyciszonym bispecyficznym przeciwciałem HER2. Myszy z ksenoprzeszczepami pochodzącymi od pacjentów z nerwiakiem zarodkowym wykazały wyczerpanie makrofagów Ly6C dodatnich znacznie zwiększyło naprowadzanie limfocytów T do guzów, co skutkowało zmniejszonym wzrostem guza i wydłużonym przeżyciem. Efekt był bardziej wyraźny w ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów z kostniakomięsakiem.

Wśród bispecyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi nowotworowemu STEAP1, format IGGL SCFV powodował znacznie większą infiltrację limfocytów T w szóstym dniu po pierwszej dawce limfocytów T, która utrzymywała się przez cały czas leczenia. Takich obserwacji nie przewidywano w testach cytotoksyczności in vitro. Po śledzeniu limfocytów T in vivo, użytkownicy mogą nadal przeprowadzać immunohistochemię, aby dokładniej określić, gdzie limfocyty T znajdują się w guzie lub innych normalnych tkankach.