Name: Śledzenie transportu limfocytów T indukowanych przez bispecyficzne przeciwciała przy użyciu ludzkich limfocytów T transdukowanych lucyferazą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj metodę transdukcji ludzkich limfocytów T lucyferazą w celu śledzenia ich migracji do guzów in vivo. Technika umożliwia ocenę skuteczności przeciwciał dwuspecyficznych bez konieczności poświęcania zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Vladimirowi Ponomariowowi za podzielenie się konstruktami lucyferazy użytymi w eksperymentach opisanych w sekcji reprezentatywnych wyników tego artykułu.

Następujące procedury zostały ocenione i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Memorial Sloan Kettering.
1. Transfekcja komórek 293T lucyferazy i pobranie supernatantu wirusa
<ol>
	<li>Posiew komórek 293T
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę, dodając do litra DMEM każdy: 110 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 11 ml penicyliny-streptomycyny.</li>
		<li>Rozmrozić 5 x 106 komórek 293T i przenieść je do kolby T175 z pożywką przygotowaną w sposób opisany powyżej.</li>
		<li>Podziel komórki 293T 1:10 co 3 dni przez 6 dni. Nie pozwól, aby komórki stały się zlewające się w więcej niż 90%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja komórek 293T 
	UWAGA: Następujące ilości odczynników są obliczane dla transfekcji jednej kolby T175 z komórkami 293T. Odpowiednio dostosować, jeżeli ma być przeprowadzony większy przepływ kolb.
	<ol>
		<li>Przenieś 1,5 ml pożywki do każdej z dwóch probówek o pojemności 50 ml za pomocą pipety. Do jednej probówki dodaj 10 μg plazmidu VSV-G, 20 μg Gag/pol i 20 μg plazmidu lucyferazy pomidora TD z czerwonego chrząszcza (CBR-TDR) i wymieszaj. Do drugiej probówki dodać 100 μl odczynnika do transfekcji DNA in vitro i wymieszać. Inkubować obie probówki w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min. 
		UWAGA: Wszystkie plazmidy opisane w tym manuskrypcie zostały dostarczone przez dr Vladimira Ponomareva.</li>
		<li>Przenieść pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji DNA in vitro kroplami do probówki zawierającej plazmidy DNA (przez około 30 s) i delikatnie wymieszać pipetą. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Podczas tej 20-minutowej inkubacji odłącz komórki 293T, dodając 5-10 ml 0,05% trypsyny. Po odłączeniu komórek dodać 10 ml pożywki i wirować przy 800 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml pożywki.</li>
		<li>Dodać pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji DNA in vitro i plazmidy DNA do komórek 293T i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Przenieść do kolby T175 i dodać 18 ml pożywki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Następnego dnia ostrożnie odessać pożywkę szklaną pipetą, nie odłączając komórek. Zastąp 18 ml świeżego podłoża. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie supernatantu wirusowego
	<ol>
		<li>Usunąć wirusowy supernatant za pomocą pipety umieszczonej na lodzie. Wirować przy 800 x g przez 5 minut, aby granulować komórki i zanieczyszczenia. 
		UWAGA: Jeśli osad komórkowy jest duży, komórki zostały prawdopodobnie oderwane od kolby po usunięciu supernatantu. Komórki te można ponownie posiać w nowej kolbie ze świeżą pożywką.</li>
		<li>Przefiltrować supernatant wirusa za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
		<li>Wirusowy supernatant należy natychmiast zużyć. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C do 24 godzin lub zamrażać w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekspansja i transdukcja aktywowanych ludzkich limfocytów T za pomocą lucyferazy
<ol>
	<li>Aktywacja ludzkich limfocytów T in vitro
	<ol>
		<li>Przemyć kulki, dodając 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do sterylnej probówki o pojemności 15 ml, dodając kulki (jedna kulka na dwie limfocyty T), umieszczając w stojaku magnetycznym na 2 minuty i odsysając PBS.</li>
		<li>Przygotować pożywkę zgodnie z opisem w kroku 1.1.1, następnie dodać IL-2 do końcowego stężenia 30 j.m./ml i dodać umyte kulki. Przygotuj 2,5 ml pożywki na każde dwa miliony limfocytów T, które mają być aktywowane.</li>
		<li>Policz limfocyty T (świeżo oczyszczone lub wcześniej oczyszczone, zamrożone, rozmrożone i umyte) za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym. Dodaj limfocyty T do pożywki przygotowanej w kroku 2.1.2 i delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać. Limfocyty T rozszerzą się co najmniej 20 razy w zależności od źródła i ogólnego stanu zdrowia komórek. Określ liczbę limfocytów T do aktywacji, obliczając liczbę potrzebną do leczenia myszy i dzieląc przez 20. W tym przypadku użyto 20 x 106 limfocytów T na mysz na podstawie wstępnych eksperymentów.</li>
		<li>Płytka 2,5 ml pożywki zawierającej dwa miliony limfocytów T, kulek i IL-2 w każdym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Hodowla w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
		<li>Badaj limfocyty T pod mikroskopem 20x codziennie przez następne 3 dni, aby określić, kiedy należy transdukować lucyferazy. Komórki są gotowe, gdy zlepiają się ze sobą i wyczerpują pożywkę, zmieniając ją z czerwono-różowej na jasnopomarańczową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płytek z retronektyną 
	UWAGA: Retronektyna jest używana do powlekania płytek używanych w transdukcji, ponieważ wzmacnia transdukcję genów15.
	<ol>
		<li>Dodać 2 ml 20 μg/ml retronektyny w PBS do dołka na niepoddanej działaniu 6-dołkowej płytki. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Do transdukcji każdych dwóch milionów limfocytów T potrzebna jest jedna studzienka pokryta retronektyną.</li>
		<li>Odessać retronektynę bez drapania dna płytki.</li>
		<li>Dodać 3 ml 2% BSA w PBS (sterylnie przefiltrowany) na studzienkę na płytkę 6-dołkową. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spinokulacja
	<ol>
		<li>Zassać BSA bez rysowania dolnej części płytki.</li>
		<li>Umyj studzienki raz 3 ml PBS na studzienkę. Kontynuować lub zastąpić nowym PBS i pozostawić płytkę pod przykryciem w temperaturze 4 °C na noc.</li>
		<li>Dodać 2 ml supernatantu wirusa lucyferazy CBR-TDR (zebranego w kroku 1.3) do dołka.</li>
		<li>Wirować przy 1,240 x g przez 90 minut w temperaturze 32 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transdukcji
	<ol>
		<li>Policz limfocyty T.</li>
		<li>Odessać wirusowy supernatant bez drapania dna płytki.</li>
		<li>Płytka dwa miliony limfocytów T na studzienkę w 6 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 30 IU / ml ludzkiej IL-2.</li>
		<li>Codziennie badaj limfocyty T. Limfocyty T są gotowe do namnażania, gdy są prawie zlewające się, zwykle po 2 dniach.</li>
		<li>Gdy komórki są już prawie zlewające się, delikatnie zmyj je z dna płytki za pomocą pipety i przenieś każdą studzienkę do oddzielnej kolby T75. Dodać 9 ml pożywki, co daje w sumie 15 ml pożywki na kolbę.</li>
		<li>Następnego dnia dodaj dodatkowe 15 ml pożywki. Komórki powinny być gotowe do wstrzyknięcia myszom następnego dnia po dodaniu pożywki. Potwierdź pomyślną transdukcję, wykonując cytometrię przepływową (konstrukt lucyferazy zawiera fluorofor pomidora TD, który jest widoczny w kanale PE)16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wszczepienie limfocytów T transdukowanych lucyferazą u myszy z obniżoną odpornością
<ol>
	<li>Przygotować i policzyć limfocyty T do wstrzyknięcia.
	<ol>
		<li>Usunąć limfocyty T z kolb i policzyć. Komórki są gotowe do wstrzyknięcia, gdy rozszerzą się 20-30 razy, zwykle do 7 dnia po aktywacji.</li>
		<li>Odwirować limfocyty T przy 800 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić w 2 ml pożywki i usunąć kulki za pomocą stojaka magnetycznego.</li>
		<li>W przypadku eksperymentów, w których limfocyty T będą wstrzykiwane oddzielnie od przeciwciał bispecyficznych, należy policzyć limfocyty T i zawiesić ponownie, tak aby końcowe stężenie wynosiło 20 milionów limfocytów T na 100 μl pożywki. Przejdź do kroku 3.2. W przypadku eksperymentów z użyciem uzbrojonych limfocytów T ex vivo (EAT) należy przejść do kroku 3.1.4.</li>
		<li>W przypadku eksperymentów z użyciem uzbrojonych limfocytów T ex vivo, policz limfocyty T i rozdziel je na indywidualne probówki o pojemności 1,5 ml dla każdej grupy, z 20 milionami komórek na mysz. Na przykład, jeśli istnieją trzy grupy po pięć myszy każda, przygotuj trzy probówki o pojemności 1,5 ml z 100 milionami limfocytów T każda.</li>
		<li>Odwirować probówki o pojemności 1,5 ml o stężeniu 800 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć pożywkę, nie naruszając osadu limfocytów T. Zawiesić w nie więcej niż 50 μl pożywki zawierającej przeciwciała bispecyficzne. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min. 
		UWAGA: Na potrzeby eksperymentów przeprowadzonych w tym badaniu wykorzystano opatentowane bispecyficzne przeciwciała IgG-[L]-scFv angażujące limfocyty T wytworzone w laboratorium. Do uzbrajania limfocytów T użyj 5 μg przeciwciała na 20 x 106 limfocytów T. Można również zastosować dostępne na rynku przeciwciała bispecyficzne.</li>
		<li>Zmyj nadmiar przeciwciał, dodając 1 450 μl pożywki do każdej probówki. Wirować przy 800 x g przez 5 minut, ostrożnie zassać pożywkę i ponownie zawiesić w stężeniu 20 milionów uzbrojonych limfocytów T na 100 μl pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknięcie i wszczepienie myszom
	<ol>
		<li>Znieczulenie myszy należy umieścić w komorze dostarczającej 3,5% (v/v) wdychanego izofluranu w ilości 1 l/min tlenu. Myszy są w pełni znieczulone, gdy zniknie odruch wycofania pedału tylnej kończyny. 
		UWAGA: Zapewnij wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu.</li>
		<li>Za pomocą igły 26 G wstrzyknij 20 milionów limfocytów T w 100 μl pożywki zaoczodołowo na mysz.</li>
		<li>Podawać podskórnie rekombinowaną IL-2 1,000 U, aby wspomóc przeżycie limfocytów T in vivo.</li>
		<li>Przeciwciała bispecyficzne podawać zaoczodołowo (do oka nieużywanego do wstrzykiwania limfocytów T) lub dootrzewnowo. Pozwól myszom dojść do siebie po znieczuleniu i wrócić do klatek. 
		UWAGA: Ponownie, w tym przypadku, użyto zastrzeżonych przeciwciał, które zostały wygenerowane w laboratorium, ale zamiast nich można było użyć komercyjnie dostępnych przeciwciał. W eksperymentach podano 0,3-10 μg przeciwciał na mysz na dawkę. Przeciwciała podawano dwa razy w tygodniu przez 3-4 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie in vivo myszy wszczepionych komórkami T transdukowanymi lucyferazy
UWAGA: Ten krok należy wykonać w dniu obrazowania, który niekoniecznie jest tym samym dniem, w którym limfocyty T i/lub przeciwciała są podawane myszom. Zazwyczaj obrazowanie wykonujemy 24 godziny po podaniu limfocytów T transdukowanych lucyferazy.
<ol>
	<li>Przygotowanie D-lucyferyny
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1 g D-lucyferyny w 33,3 ml sterylnego PBS (końcowe stężenie: 30 mg/ml).</li>
		<li>Rozpuszczoną D-lucyferynę rozmieścić w probówkach do mikrowirówek o pojemności 33 x 1,5 ml i utrzymywać probówki w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>W dniu obrazowania rozmrozić wystarczającą ilość porcji 30 mg/ml D-lucyferyny, aby liczba zwierząt została zobrazowana. Jedna tuba wystarcza na 10 zwierząt. 
		UWAGA: Po użyciu ponownie zamrozić pozostałą D-lucyferynę. D-lucyferyna jest stabilna przez co najmniej pięć cykli zamrażania/rozmrażania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podawanie D-lucyferyny myszom 
	UWAGA: Przed podaniem D-lucyferyny myszom otwórz oprogramowanie do obrazowania i zainicjuj system. Aparat może potrzebować kilku minut, aby ostygnąć, i należy to zrobić przed wstrzyknięciem myszom D-lucyferyny, aby upewnić się, że obrazowanie może odbyć się 5 minut po podaniu substratu.
	<ol>
		<li>Znieczulić do pięciu myszy w komorze dostarczającej 3,5% (v/v) wdychany izofluran w 1 l/min tlenu. Myszy są w pełni znieczulone, gdy zniknie odruch wycofania pedału tylnej kończyny.</li>
		<li>Gdy myszy zostaną w pełni znieczulone, podaj 100 μl 30 mg / ml D-lucyferyny na mysz (3 mg na mysz) przez wstrzyknięcie zaoczodołowe za pomocą igły 26 G. Wyobraź sobie tę grupę myszy przed podaniem D-lucyferyny następnej grupie. Umieść następną grupę myszy w komorze izofluranu w celu znieczulenia, podczas gdy poprzednia grupa jest obrazowana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie limfocytów T transdukowanych lucyferazą
	<ol>
		<li>Przenieś znieczulone myszy do światłoszczelnej komory kamery, a następnie kontynuuj podawanie 3% izofluranu w dawce 0,5 l/min. Ułóż myszy na boku tak, aby bok, na którym znajduje się ksenoprzeszczep, był skierowany do góry w kierunku kamery. Wykonaj kolejny zestaw zdjęć z myszami w pozycji leżącej, aby ocenić obecność limfocytów T w płucach.</li>
		<li>Korzystając z panelu sterowania akwizycją, wybierz opcje Luminescencyjne, Fotografia i Nakładka. Ustaw czas ekspozycji na automatyczny, binning na średni, a F/Stop na 1. Pobieranie obrazów. Po pierwszym zdjęciu ustaw czas ekspozycji tak, aby odpowiadał czasowi, który został automatycznie obliczony dla pierwszego obrazu, aby można było bezpośrednio porównywać kolejne obrazy. Przydatne może być przechwytywanie obrazów z wielokrotnymi czasami naświetlania w celu określenia optymalnego czasu ekspozycji w celu uzyskania najjaśniejszego sygnału bez nasycenia pikseli.</li>
		<li>Usuń myszy z izofluranu, wróć do ich klatek i obserwuj, aż się obudzą i będą chodzić.</li>
		<li>Powtarzaj kroki od kroku 4.2.1, aż wszystkie grupy zostaną zobrazowane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gökbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li>
<li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50(2018).</li>
<li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-%2FCD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li>
<li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li>
<li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005(2020).</li>
<li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-%5BL%5D-scFv+T+cell+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315(2020).</li>
<li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li>
<li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172(2020).</li>
<li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33%2Fanti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li>
<li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114(2021).</li>
<li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626(2020).</li>
<li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li>
<li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509(2021).</li>
<li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li>
<li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+in+human+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57(2021).</li>
<li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li>
<li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222(2021).</li>
<li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142(2021).</li>
<li>Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li>
<li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li>
<li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors%3A+Translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li>
</ol>

NKC informuje o otrzymaniu komercyjnych grantów badawczych od Y-mAbs Therapeutics. NKC jest wynalazcą i właścicielem wydanych patentów licencjonowanych przez MSK dla Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand i Abpro-labs. MSK i NKC mają interesy finansowe w Y-mAb. NKC informuje o otrzymaniu opcji na akcje od Eureka Therapeutics. HFG i MEC nie ujawniają żadnych informacji na ten temat.

Podczas gdy blinatumomab T-BsAb został zatwierdzony do stosowania w nowotworach hematologicznych CD19-dodatnich, pomyślne wdrożenie T-BsAbs w guzach litych okazało się znacznie trudniejsze. Katumaxomab, T-BsAb skierowany przeciwko cząsteczce adhezji komórek nabłonka (EPCAM), został zatwierdzony do leczenia złośliwego wodobrzusza u pacjentek z rakiem jajnika, ale produkcja leku została następnie wstrzymana z powodów komercyjnych19. Żadne inne T-BsAb nie zostały zatwierdzone do leczenia guzów litych...

(T-BsAbs) są zmodyfikowanymi przeciwciałami używanymi do zapewnienia sztucznej specyficzności poliklonalnym limfocytom T poprzez angażowanie limfocytów T przez jedno ramię wiążące i antygenu nowotworowego przez inne ramię wiążące. Technologia ta została z powodzeniem zastosowana w nowotworach hematologicznych (blinatumomab ukierunkowany na CD19 < klasa sup = "xref">1), a liczne T-BsAb są również w fazie rozwoju przedklinicznego i klinicznego dla różnych guzów litych2. T-BsAb angażują poliklonalne limfocyty T w sposób niezależny od głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC), a zatem nawet nowotwory, które obniżają poziom ludzkich antygenów leukocytów (HLA), są podatne na tego typu terapię3,4. T-BsAb zostały opracowane w dziesiątkach różnych formatów, z różnicami w wartościowości i układzie przestrzennym ramion wiążących limfocyty T i guza, odległościami międzydomenowymi i włączeniem domeny Fc, która wpływa na okres półtrwania i może indukować funkcje efektorowe, jeśli jest obecna5. Wcześniejsze prace w naszym laboratorium wykazały, że czynniki te znacząco wpływają na skuteczność przeciwnowotworową T-BsAbs, z nawet 1000-krotnymi różnicami w sile działania6. Dzięki tym pracom zidentyfikowaliśmy format IgG-[L]-scFv jako idealną platformę dla T-BsAb (więcej szczegółów na temat formatów T-BsAb znajduje się w sekcji Reprezentatywne wyniki) i zastosowaliśmy tę platformę do celów, w tym GD2 (nerwiak zarodkowy), HER2 (rak piersi i kostniakomięsak), GPA33 (rak jelita grubego), STEAP1 (mięsak Ewinga), CD19 (nowotwory złośliwe komórek B) i CD33 (nowotwory złośliwe komórek B)7, 8,9,10,11,12,13.
Jednym z głównych wyzwań dla skutecznego wdrożenia terapii T-BsAb w guzach litych jest pokonanie immunosupresyjnego mikrośrodowiska guza (TME), które kieruje transport limfocytów T do guzów14. Czynniki wpływające na skuteczność T-BsAb opisane powyżej mają znaczący wpływ na zdolność T-BsAb do skutecznego indukowania naprowadzania limfocytów T na nowotwory, ale efekt ten jest trudny do oceny w systemie in vivo w czasie rzeczywistym. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy opis zastosowania limfocytów T transdukowanych lucyferazą w badaniach przedklinicznych T-BsAb w celu oceny transportu limfocytów T do różnych tkanek w eksperymentalnych modelach myszy z obniżoną odpornością podczas leczenia. Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie środków do oceny infiltracji limfocytów T w guzach i innych tkankach, a także wgląd w czasie rzeczywistym w kinetykę naprowadzania i trwałość limfocytów T, bez konieczności poświęcania zwierząt podczas leczenia. Dla coraz większej liczby badaczy koncentrujących się na immunoterapiach komórkowych możliwość śledzenia limfocytów T in vivo w przedklinicznych modelach zwierzęcych ma kluczowe znaczenie. Naszym celem jest dostarczenie dokładnego, szczegółowego opisu metody, którą zastosowaliśmy do śledzenia limfocytów T transdukowanych lucyferazy, aby umożliwić innym badaczom łatwe powtórzenie tej techniki.

<table><tbody><tr><td>Komórki 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030-10G</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki CD3/CD28</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11161D</td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferyna, Sól potasowa</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji DNA in vitro (PolyJet)</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid Gag/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid GFP</td><td>Addgene</td><td>11150-DNA.cg</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-2</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Retronektyna</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td> <td>25-300-120</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid VSV-G</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie transportu limfocytów t indukowanych przez bispecyficzne przeciwciała przy użyciu ludzkich limfocytów t transdukowanych lucyferazą

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Przeciwciała bispecyficzne angażujące limfocyty T (T-BsAbs) są na różnych etapach rozwoju przedklinicznego i badań klinicznych dla guzów litych. Czynniki takie jak wartościowość, układ przestrzenny, odległość międzydomenowa i mutacje Fc wpływają na skuteczność przeciwnowotworową tych terapii, zwykle poprzez wpływ na naprowadzanie limfocytów T do guzów, co pozostaje głównym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy metodę transdukcji aktywowanych ludzkich limfocytów T za pomocą lucyferazy, umożliwiając śledzenie in vivo limfocytów T podczas badań nad terapią T-BsAb. Zdolność T-BsAb do przekierowywania limfocytów T do nowotworów może być oceniana ilościowo w wielu punktach czasowych podczas leczenia, co pozwala naukowcom skorelować skuteczność przeciwnowotworową T-BsAbs i innych interwencji z utrzymywaniem się limfocytów T w nowotworach. Metoda ta łagodzi potrzebę poświęcania zwierząt podczas leczenia w celu histologicznej oceny infiltracji limfocytów T i może być powtarzana w wielu punktach czasowych w celu określenia kinetyki transportu limfocytów T w trakcie i po leczeniu.

Jak opisano w kroku 4.3, myszy można orientować w różnych pozycjach podczas obrazowania, aby ocenić obecność limfocytów T w różnych tkankach. Pozycja na plecach umożliwia ocenę limfocytów T w płucach, co jest częste we wczesnych punktach czasowych po wstrzyknięciu. Pozycja boczna z podskórnym ksenoprzeszczepem skierowanym do góry jest wykorzystywana do najlepszej oceny migracji limfocytów T do guza. W wszystkich eksperymentach opisanych w niniejszym piśmie wykorzystano samice myszy C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rg<su...

Tutaj opisujemy metodę transdukcji ludzkich limfocytów T za pomocą lucyferazy, aby ułatwić śledzenie in vivo transportu limfocytów T wywołanego przez bispecyficzne przeciwciała do nowotworów w badaniach oceniających skuteczność przeciwnowotworową i mechanizm bispecyficznych przeciwciał angażujących limfocyty T.

Śledzenie transportu limfocytów T indukowanych przez bispecyficzne przeciwciała przy użyciu ludzkich limfocytów T transdukowanych lucyferazą

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Metoda ta umożliwia użytkownikom łatwe śledzenie limfocytów T in vivo w celu oceny kinetyki naprowadzania i monitorowania trwałości limfocytów T. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją powtórzyć w wielu punktach czasowych na tym samym zwierzęciu bez konieczności poświęcania w cytometrii przepływowej lub immunohistochemii. Technika ta może być również modyfikowana w celu śledzenia innych typów komórek odpornościowych.Aby wyhodować komórki 293T, przygotuj jeden litr DMEM, dodając 110 mililitrów inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i 11 mililitrów penicyliny streptomycyny. Rozmrozić pięć razy po 10 do szóstych komórek 293T i przenieść je do kolby T175 zawierającej DMEM. Podziel komórki od jednej do 10 co trzy dni przez sześć dni, zanim komórki staną się zlewające się w ponad 90%.W celu transfekcji przenieś 1,5 mililitra pożywki do dwóch 50-mililitrowych probówek za pomocą pipety. Do jednej probówki dodaj 10 mikrogramów plazmidu VSVG, 20 mikrogramów knebla pol i 20 mikrogramów czerwonego chrząszcza TDtomato lub plazmidu lucyferazy CBRTDR i wymieszaj. Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika do transfekcji DNA in vitro do innej probówki i wymieszaj.Inkubować obie probówki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Przenieść pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji DNA in vitro kroplami do probówki zawierającej plazmidy DNA i delikatnie wymieszać pipetą. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Podczas inkubacji odłącz komórki 293T, dodając od pięciu do 10 mililitrów 0,05% trypsyny. Po odłączeniu komórek dodać 10 mililitrów pożywki i wirować przy 800 G przez pięć minut. Ponownie zawieś ogniwa w 1,5 mililitra pożywki.Dodać pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji DNA in vitro i plazmidy DNA do komórek 293T i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji przenieść zawiesinę do kolby T175. Dodaj 18 mililitrów pożywki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia ostrożnie odessać pożywkę szklaną pipetą bez odłączania komórek i zastąpić ją 18 mililitrami świeżej pożywki. Ponownie inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia usunąć supernatant wirusa za pomocą pipety umieszczonej na lodzie i odwirować przy 800 G przez pięć minut w celu osadzenia komórek i zanieczyszczeń.Przefiltruj supernatant wirusa za pomocą filtra 0,22 mikrona i natychmiast umieść go na lodzie. W celu aktywacji ludzkich limfocytów T in vitro dodaj 10 mililitrów PBS zawierających 0,1% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA i dwa milimolowe EDTA do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie, aby umyć koraliki, dodaj koraliki do rurki i umieść rurkę w stojaku magnetycznym.Po dwóch minutach wyjmij PBS z probówki. Po przygotowaniu DMEM dodać umyte kulki i interleukinę-2 lub IL-2 do końcowego stężenia 30 jednostek międzynarodowych na mililitr. Policz limfocyty T za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypana.Po zliczeniu dodaj żądaną liczbę limfocytów T do pożywki i delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać. Płytka 2,5 mililitra pożywki zawierającej dwa miliony limfocytów T, kulek i IL-2 w każdym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Hodowla w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym 5% dwutlenku węgla.Badaj limfocyty T pod obiektywem 20X codziennie przez trzy dni, aby określić, kiedy należy transdukować lucyferazy. Następnie, aby przygotować płytkę RetroNectin, dodaj dwa mililitry po 20 mikrogramów na mililitr RetroNectin w PBS do dołka niepoddanej działaniu substancji płytki sześciodołkowej i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Zassać RetroNectin bez drapania dna płytki i dodać trzy mililitry 2% BSA w PBS na dołek w płytce sześciodołkowej.Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, w celu spinokulacji, odessać BSA i raz umyć studzienki trzema mililitrami PBS. Kontynuuj lub zastąp świeżym PBS i pozostaw płytkę pod przykryciem w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc.Następnego dnia dodać dwa mililitry supernatantu wirusa lucyferazy CBRTDR do dołka i odwirować przy 1,240 G przez 90 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza. W celu transdukcji, po zliczeniu limfocytów T, odessać supernatant wirusa i umieścić dwa miliony limfocytów T na studzience w sześciu mililitrach DMEM zawierających 30 jednostek międzynarodowych na mililitr ludzkiej IL-2. Badaj limfocyty T przez dwa dni.Gdy komórki są już prawie zlewające się, delikatnie zmyj je z dna płytki za pomocą pipety i przenieś każdą studzienkę do oddzielnej kolby T75. Dodaj dziewięć mililitrów pożywki, co daje w sumie 15 mililitrów objętości na kolbę. Następnego dnia dodaj 15 mililitrów pożywki i potwierdź pomyślną transdukcję, wykonując cytometrię przepływową.Po znieczuleniu myszy, za pomocą igły o rozmiarze 26, wstrzyknij 20 milionów limfocytów T w 100 mikrolitrach pożywki zaoczodoczodołowo. Podaj podskórnie 1 000 jednostek rekombinowanej IL-2, aby wspomóc przeżycie limfocytów T in vivo. Następnie podać bispecyficzne przeciwciało zaoczodołowo lub dootrzewnowo.W przypadku obrazowania in vivo należy podać 100 mikrolitrów trzech miligramów D-lucyferyny przez wstrzyknięcie zaoczodołowe za pomocą igły o rozmiarze 26 w znieczulonej myszy. Aby uchwycić obrazy, umieść mysz w szczelnej komorze kamery tak, aby bok, w którym znajduje się ksenoprzeszczep, był skierowany do góry w kierunku kamery. Korzystając z panelu sterowania akwizycją, wybierz luminescencyjną, fotograficzną i nakładkę.Ustaw czas ekspozycji na automatyczny, binning na średni, a przysłonę na jeden i rejestruj obrazy. Po pierwszym zdjęciu ustaw czas ekspozycji tak, aby był zgodny z czasem automatycznie obliczonym dla pierwszego obrazu, aby można było bezpośrednio porównywać kolejne obrazy. Wykonaj kolejny zestaw zdjęć z leżącym na wznak myszy, aby ocenić obecność limfocytów T w płucach.Uzbrojone limfocyty T transportowały się do guza szybciej niż nieuzbrojone limfocyty T, opuszczając płuca dwa dni wcześniej. Ilościowość infiltracji limfocytów T do guzów w czasie mierzono za pomocą bioluminescencji i wyrażano jako całkowite stada lub promieniowanie na piksel zintegrowane z konturem guza. Ruch limfocytów T można monitorować przez 28 dni po wstrzyknięciu limfocytów T transdukowanych lucyferazy, co pozwala na śledzenie naprowadzania limfocytów T i utrzymywania się przez cały okres leczenia.Pokazano transport limfocytów T do HER2-dodatnich ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z ludzkim rakiem piersi u myszy DKO. Leczenie bispecyficznym przeciwciałem HER2 z niewyciszonym FC nie miało wpływu na wzrost guza w porównaniu z kontrolowanym przeciwciałem bispecyficznym. Natomiast leczenie bispecyficznym przeciwciałem HER2 zawierającym mutację N297A samodzielnie lub w połączeniu z mutacją K322A było w stanie całkowicie zatrzymać wzrost guza.W przypadku grup z mutacjami wyciszającymi sygnał luminescencji limfocytów T osiągnął wyższy szczyt w trzecim dniu po wstrzyknięciu i utrzymywał się na wyższym poziomie w porównaniu z kontrolowanym przeciwciałem bispecyficznym i niewyciszonym bispecyficznym przeciwciałem HER2. Myszy z ksenoprzeszczepami pochodzącymi od pacjentów z nerwiakiem zarodkowym wykazały wyczerpanie makrofagów Ly6C dodatnich znacznie zwiększyło naprowadzanie limfocytów T do guzów, co skutkowało zmniejszonym wzrostem guza i wydłużonym przeżyciem. Efekt był bardziej wyraźny w ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów z kostniakomięsakiem.Wśród bispecyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi nowotworowemu STEAP1, format IGGL SCFV powodował znacznie większą infiltrację limfocytów T w szóstym dniu po pierwszej dawce limfocytów T, która utrzymywała się przez cały czas leczenia. Takich obserwacji nie przewidywano w testach cytotoksyczności in vitro. Po śledzeniu limfocytów T in vivo, użytkownicy mogą nadal przeprowadzać immunohistochemię, aby dokładniej określić, gdzie limfocyty T znajdują się w guzie lub innych normalnych tkankach.

tracking-bispecific-antibody-induced-t-cell-trafficking-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Ten film demonstruje metodę śledzenia transportu limfocytów T wywołanych bispecyficznymi przeciwciałami do nowotworów w modelu mysim. Limfocyty T efektorowe transdukowane lucyferazy wstrzykuje się myszy z podskórnym ksenoprzeszczepem komórek nowotworowych. Następnie wprowadzane są przeciwciała bispecyficzne, wiążące się z limfocytami T i komórkami nowotworowymi. Lokalizacja limfocytów T jest śledzona za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, przy czym wielkość sygnału wskazuje na zakres...

Technika in vivo do śledzenia transportu limfocytów T indukowanych przez bispecyficzne przeciwciała do nowotworów

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Opisujemy protokół monitorowania ruchliwości radialnej nieprzylegających komórek odpornościowych in vitro za pomocą kolektora sedymentacyjnego/suwaka komórkowego. Migracja komórek jest śledzona na monowarstwach komórek nowotworowych lub na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej. Badanie za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej pozwala na obserwację ruchliwości komórek i funkcjonalności cytotoksycznej.

Ruchliwość promieniowa i funkcja cytotoksyczna retrowirusowych limfocytów T transdukowanych wektorem replikującym, nieadherentnych alloreagujących limfocytów T

Po przygotowaniu zmodyfikowanego 64Cu przeciwciała monoklonalnego wiążącego się z transgenicznym receptorem mysich limfocytów T, limfocyty T są znakowane radioaktywnie in vivo, analizowane pod kątem żywotności, funkcjonalności, stabilności znakowania i apoptozy, a następnie adoptycyjnie przenoszone do myszy z reakcją nadwrażliwości typu opóźnionego w drogach oddechowych do nieinwazyjnego obrazowania za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET/CT).

Znakowanie mysich limfocytów za pomocą receptora przeciwciał Cu 64w celu transportu komórek in vivo za pomocą PET / CT

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i testów przedklinicznych mysich limfocytów T CD19 CAR metodą transdukcji retrowirusowej i wykorzystania jako terapii przeciwko ustalonemu syngenicznemu chłoniakowi B-komórkowemu A20 u myszy BALB/c z lub bez kondycjonowania wstępnego limfodepletingu.

Syngeniczny model chłoniaka z komórek B myszy do przedklinicznej oceny limfocytów T CD19 CAR

Ten protokół opisuje metodologię nieinwazyjnego śledzenia limfocytów T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo za pomocą klinicznie dostępnej platformy.

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Przedstawiamy ulepszone protokoły transdukcji retrowirusowej receptorów transportowych i konkurencyjnego naprowadzania w celu zbadania lokalizacji limfocytów specyficznych dla narządów i mikrośrodowisk za pośrednictwem receptorów. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów transportu komórek odpornościowych i ma potencjalne zastosowania w przyszłych badaniach podstawowych i terapeutycznych.

Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych

Poznaj metodę transdukcji ludzkich limfocytów T lucyferazą w celu śledzenia ich migracji do guzów in vivo. Technika umożliwia ocenę skuteczności przeciwciał dwuspecyficznych bez konieczności poświęcania zwierząt.

Śledzenie transportu limfocytów T indukowanych przez bispecyficzne przeciwciała przy użyciu ludzkich limfocytów T transdukowanych lucyferazą (Wideo) | JoVE Journal

Śledzenie transportu limfocytów T indukowanych przez bispecyficzne przeciwciała przy użyciu ludzkich limfocytów T transdukowanych lucyferazą

Przeglądaj więcej filmów