Name: In vitro Testy rozszczepienia przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych kaspaz Drosophila do badań przesiewowych substratów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania rekombinowanych kaspaz Drosophila i testów rozszczepienia in vitro do badań przesiewowych substratów. Protokół umożliwia niezawodne badanie aktywności enzymatycznej Dronc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Elif Kamber-Kaya za pomoc w ustaleniu protokołu w laboratorium. Dr Guy Salvesen uprzejmie dostarczył mutanta DriceC211A9. Praca ta została sfinansowana z nagrody MIRA przyznanej przez National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) of the National Institutes of Health (NIH) w ramach grantu o numerze 2R35GM118330. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu.

1. Ekspresja rekombinowanej kaspazy u bakterii
<ol>
	<li>Sklonuj interesujący nas gen (kaspaza lub przypuszczalny substrat) do bakteryjnego wektora ekspresyjnego ze znacznikiem N- i/lub C-końcowym przy użyciu standardowych protokołów23. 
	UWAGA: Znaczniki mogą zwiększać rozpuszczalność rekombinowanych białek i są używane do oczyszczania rekombinowanych białek. Tutaj Dronc, Drice i ich katalityczne mutanty są klonowane do wektora pET28a, który zapewnia N-końcowy znacznik 6xHis (pET28a-6xHis-Droncwt, pET28a-6xHis-DroncC318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-DriceC211A); (informacje na temat podkładu znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 1).</li>
	<li>Przekształć wektory z interesującymi genami w kompetentne komórki BL21 (DE3) pLysS E. coli przy użyciu standardowych procedur23,24. Mieszaninę transformacyjną należy umieścić na płytkach agarowych LB z odpowiednim antybiotykiem (kanamycyną w przypadku pET28a) w celu wyselekcjonowania przekształconych bakterii. (Patrz Tabela Uzupełniająca 2.)</li>
	<li>Wybrać kolonię z płytki i zaszczepić w 5 ml pożywki LB zawierającej odpowiedni antybiotyk, aby rosła przez noc w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min na platformie wstrząsającej.</li>
	<li>Następnego dnia przygotuj 30-50 ml (na próbkę) pożywki LB z antybiotykiem i dodaj 1 ml kultury wyhodowanej przez noc. Gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) przy użyciu biofotometru/spektrofotometru powinna wynosić od 0,1 do 0,2.</li>
	<li>Hodować kulturę w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min na platformie wytrząsającej, aż OD600 osiągnie 0,6. Sprawdzaj OD600 co godzinę, aż osiągnie 0.6. Trwa to około 2 do 3 godzin.</li>
	<li>Aby indukować ekspresję białka (kaspazy), dodać IPTG do końcowego stężenia 0,1-0,2 mM (rozcieńczyć 1:1,000-1:500 z materiału wyjściowego IPTG, patrz Tabela uzupełniająca 2).</li>
	<li>Hodować kultury przez 3 godziny w temperaturze 30 °C przy 220 obr./min. 
	UWAGA: Czas i temperatura zależą od rodzaju białka, które ulega ekspresji i jego rozpuszczalności. Warunki te mogą wymagać dostosowania, jeśli wyrażane są różne kaspazy lub substraty.</li>
	<li>Po 3 godzinach odwirować kultury w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml przez 20 minut w temperaturze 4 °C i przy 2 000 x g. Odrzucić supernatant i przystąpić do osadu. 
	UWAGA: Protokół można zatrzymać w tym momencie i kontynuować później. Granulki bakteryjne można zamrażać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja rekombinowanych kaspaz na małą skalę
<ol>
	<li>Wyjmij zamrożone probówki z granulowanymi kulturami z przechowywania w temperaturze -80 °C i trzymaj je na lodzie przez 10 minut, aby zmiękczyć granulki.</li>
	<li>Po 10 minutach dodać 0,6 ml buforu do lizy komórek bakteryjnych (Tabela uzupełniająca 2) uzupełnionego świeżo dodanymi inhibitorami proteazy, 10 mg/ml lizozymu i 50 U/ml benzonazy do probówek zawierających osady za pomocą kontrolera pipet z pipetą serologiczną o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Za pomocą tej samej końcówki pipety rozpuść osad, pipetując w górę i w dół, aż do uzyskania klarownego bladożółtego roztworu bez żadnych cząstek osadu. Inkubować przez 30 minut na lodzie.</li>
	<li>Przenieść lizat do odpowiednich probówek wirówkowych i odwirować lizaty przy 17 000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatanty do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Jest to surowy ekstrakt zawierający kaspazy.</li>
	<li>Trzymaj probówki na lodzie i przystąp do oczyszczania agarozą Ni-NTA.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie kaspaz na małą skalę oznaczone przez His-tagged
<ol>
	<li>Dodać 0,2 ml 50% zawiesiny agarozy Ni-NTA do każdej probówki ekstraktów kaspazy z kroku 2.5. Obracać rurki na rotatorze typu "koniec do końca" przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po 1 godzinie dodać ekstrakt z agarozą Ni-NTA do 1 ml kolumn polipropylenowych z nienaruszoną końcówką, umieszczonych w stojaku. Odstaw na 5 minut.</li>
	<li>Po 5 minutach zdjąć nasadkę kolumn i pozwolić, aby supernatant wypłynął grawitacyjnie.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 1 ml buforu do przemywania (tabela uzupełniająca 2) do kolumn, nie naruszając wypełnionej żywicy agarozy Ni-NTA i przepłukać ją przez przepływ grawitacyjny.</li>
	<li>Wykonaj krok prania trzy razy.</li>
	<li>W celu wymowania kaspaz umieścić 1,5 ml probówek mikrowirówek pod dyszą zbiorczą kolumn po całkowitym opróżnieniu buforu płuczącego.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml buforu elucyjnego (uzupełnionego 1x inhibitorami proteazy bezpośrednio przed użyciem) do każdej kolumny i zebrać eluat w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Drobno oczyszczony eluat będzie miał przezroczysty kolor.</li>
	<li>Trzymaj eluaty na lodzie i zmierz stężenie białek za pomocą testu Bradforda25. Potwierdź czystość/jednorodność oczyszczonych kaspaz za pomocą SDS-PAGE, a następnie Coomassie Blue staining26. 
	UWAGA: Wydajność hodowli 50 ml LB waha się od 0,5 do 1,5 mg białka kaspazy. Biorąc pod uwagę, że do elucji stosuje się 0,5 ml buforu elucyjnego, stężenie waha się od 1 do 3 mg/ml. Ważne jest, aby używać oczyszczonych eluatów kaspazy do testów rozszczepienia in vitro w tym samym dniu lizy i oczyszczania, ponieważ te preparaty kaspazy tracą aktywność w ciągu nocy.</li>
</ol>
4. Ekspresja przypuszczalnego substratu kaspazy w bezkomórkowych systemach ekspresyjnych
UWAGA: W tym protokole, Drice, naturalny substrat Dronc, jest przygotowywany zarówno przez rekombinowaną ekspresję w E. coli (patrz sekcja 3 powyżej), jak i przez ekspresję w lizacie retikulocytów królika (RRL), systemie ekspresji wolnym od komórek ssaków (ta sekcja, patrz poniżej).
<ol>
	<li>Sklonuj gen domniemanego substratu do wektora ekspresyjnego zawierającego promotor T7, T3 lub SP6 przy użyciu standardowych procedur23. 
	UWAGA: W tym protokole DriceC211A jest używany jako substrat modelowy i został sklonowany do wektora pT7CFE1-N-Myc, który przenosi promotor T7 do ekspresji genów i znakuje domniemany substrat białkowy N-końcowym znacznikiem Myc w celu wykrycia przez immunoblotting.</li>
	<li>W RRL substraty kandydujące mogą być syntetyzowane zarówno radioaktywnie, jak i nieradioaktywnie.
	<ol>
		<li>Synteza nieradioaktywna: Do probówki mikrowirówki o pojemności 0,5 ml dodać 25 μl RRL, 2 μl buforu reakcyjnego, 0,5 μl mieszaniny aminokwasów -minus leucyna (1 mM), 0,5 μl mieszaniny aminokwasów minus metionina (1 mM), 1 μl inhibitora rybonukleazy (40 U/μL), 2 μL matrycy DNA (0,5 μg/μL), i 1 μl polimerazy T7-RNA. Dodać wodę wolną od nukleaz, aby dostosować końcową objętość reakcji do 50 μl. Delikatnie wymieszać składniki, pipetując lub mieszając końcówką pipety, a następnie krótko odkręcić. 
		UWAGA: Lizat RRL zawiera 100-200 mg/ml białek endogennych. W przypadku reakcji translacji in vitro dodać RRL w stężeniu 50% (tutaj 25 μL/50 μL reakcji).</li>
		<li>Synteza radioaktywna: W probówce mikrowirówki o pojemności 0,5 ml dodaj 25 μl lizatu RRL, 2 μl buforu reakcyjnego, 0,5 μl mieszaniny aminokwasów minus metioniny (1 mM), 1 μl inhibitora rybonukleazy (40 U/μL), 2 μl matrycy DNA (0,5 μg/μL), 2 μL SMetionina znakowana 35 (1000 Ci/mmol przy 10 mCi/ml) i 1 μl polimerazy T7-RNA. Dodać wodę wolną od nukleaz, aby dostosować końcową objętość reakcji do 50 μl. Delikatnie wymieszać składniki, pipetując lub mieszając końcówką pipety, a następnie krótko odwirować. Wyrzuć końcówki i rurki do pojemnika na odpady radioaktywne. 
		UWAGA: Nie dodawaj mieszaniny aminokwasów bez leucyny. Wektor pT7CFE1 wykorzystuje promotor T7 do ekspresji białek. Inne wektory używają promotorów T3 lub SP6. W takim przypadku zamiast polimerazy RNA T7 należy użyć polimeraz RNA T3 lub SP6. Upewnij się, że matryca DNA jest wysokiej czystości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 90 minut.</li>
	<li>Wiruj krótko przez 10 s i umieść probówki na lodzie. Sprawdź poziom ekspresji przypuszczalnego substratu w RRL za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu/autoradiografii. 
	UWAGA: Ilość ekstraktu RRL dodanego do reakcji rozszczepienia powinna być oparta na ilości białka, które można wykryć za pomocą metody wykrywania (immunoblotting lub S35 autoradiografia). Przystąpić do testu rozszczepienia in vitro (następna sekcja) lub przechowywać go w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Test rozszczepienia in vitro z substratami wygenerowanymi za pomocą RRL
<ol>
	<li>Należy wziąć przypuszczalnie wygenerowany substrat lub substraty, jak opisano w sekcji 4. W tym protokole N-Myc-DriceC211A jest używany jako podłoże modelowe.</li>
	<li>W zależności od poziomu ekspresji przypuszczalnego substratu (do określenia oddzielnie za pomocą analizy immunoblot lub autoradiografii, patrz krok 4.4), należy użyć 1-10 μl RRL zaprogramowanego białkiem będącym przedmiotem zainteresowania w teście rozszczepienia.</li>
	<li>Dodać 10 μg oczyszczonego białka kaspazy wytworzonego w sekcjach 1, 2 i 3.</li>
	<li>Doprowadzić całkowitą objętość reakcji do 50 μl za pomocą buforu do oznaczania kaspazy.</li>
	<li>Reakcje inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 30 °C przez 3 godziny. Upewnij się, że w teście rozszczepienia uwzględniono odpowiednie kontrole. W tym przypadku katalityczny mutant DroncC318A jest używany jako kontrola.</li>
	<li>Po 3 godzinach przerwij reakcje, przenosząc probówki na lód.</li>
	<li>Dodaj jeden wolumin bufora próbki LDS zawierającego 50 mM DTT. Reakcja zostaje całkowicie zatrzymana przez dodanie buforu do próbek LDS.</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze 75 °C w bloku grzewczym przez 10 minut.</li>
	<li>Szybko odwirować, wymieszać przez trześnięcie, załadować 24 μl na próbkę i uruchomić SDS-PAGE (patrz rozdział 7) lub przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
6. Test rozszczepienia in vitro z rekombinowanym białkiem substratowym o ekspresji bakteryjnej
<ol>
	<li>Dodać 10 μg oczyszczonego substratu kandydującego (tutaj 6xHis-DriceC211A, wygenerowanego w sekcjach 1, 2 i 3) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.</li>
	<li>Dodać 10 μg oczyszczonych białek kaspazy wytworzonych w sekcjach 1 i 2. Doprowadzić całkowitą objętość do 50 μl za pomocą buforu do oznaczania kaspazy.</li>
	<li>Wykonaj kroki od 5.5 do 5.9.</li>
</ol>
7. SDS-PAGE i immunoblotting
<ol>
	<li>Załaduj reakcje rozszczepienia (24 μL) na 4%-12% żele gradientowe Tris-Glycine lub Bis-Tris (Tabela materiałów) i wykonaj elektroforezę białek i immunoblotting (lub autoradiografię, jeśli używasz substratów znakowanych S35), aby zobrazować wyniki przy użyciu standardowych procedur27,28. 
UWAGA: Tutaj, w tym protokole, zastosowano żele gradientowe Bis-Tris z buforem uruchomionym Mops i buforem ładującym LDS. Ogólnie rzecz biorąc, powszechnie używane protokoły PAGE żeli Tris-Glycine działają przy użyciu bufora uruchomionego Tris-Glycine-SDS i bufora ładującego SDS.</li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+function+in+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspase function in programmed cell death.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).</li>
<li>Hawkins, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+DRONC+cleaves+following+glutamate+or+aspartate+and+is+regulated+by+DIAP1%2C+HID%2C+and+GRIM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+and+dATP-dependent+formation+of+Apaf-1%2Fcaspase-9+complex+initiates+an+apoptotic+protease+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade.</a> Cell. 91 (4), 479-489 (1997).</li>
<li>Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+DRONC+is+regulated+by+DIAP1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1.</a> EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).</li>
<li>Timmer, J. C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspase substrates.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).</li>
<li>Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+APAF-1.cytochrome+c+multimeric+complex+is+a+functional+apoptosome+that+activates+procaspase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).</li>
<li>Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apaf-1%2C+a+human+protein+homologous+to+C.+elegans+CED-4%2C+participates+in+cytochrome+c-dependent+activation+of+caspase-3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3.</a> Cell. 90 (3), 405-413 (1997).</li>
<li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li>
<li>Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+and+substrate+specificity+of+the+Drosophila+initiator+caspase+DRONC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).</li>
<li>Fraser, A. G., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Drosophila+melanogaster+ICE%2FCED-3-related+protease%2C+drICE%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE.</a> EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).</li>
<li>Denton, D., Mills, K., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+protocols+for+studying+cell+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods and protocols for studying cell death in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).</li>
<li>Dorstyn, L., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+analysis+of+the+activation+of+the+Drosophila+caspase+DRONC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).</li>
<li>Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDPs%3A+caspase-dependent+non-lethal+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).</li>
<li>Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lethal+message+from+the+Holy+Land%3A+The+first+international+conference+on+nonapoptotic+roles+of+apoptotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins.</a> FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).</li>
<li>Baena-Lopez, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+about+the+caspase-dependent+functions+without+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">All about the caspase-dependent functions without cell death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).</li>
<li>Florentin, A., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+levels+and+execution+efficiencies+determine+the+apoptotic+potential+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell.</a> Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).</li>
<li>Amcheslavsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+localization+of+apoptotic+caspases+for+non-apoptotic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions.</a> Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).</li>
<li>Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+membranes+non-apoptotic+compartments+for+apoptotic+caspases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases.</a> Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cascleave%3A+towards+more+accurate+prediction+of+caspase+substrate+cleavage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites.</a> Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cascleave+2.0%2C+a+new+approach+for+predicting+caspase+and+granzyme+cleavage+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets.</a> Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).</li>
<li>Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+mono-ubiquitylation+of+the+Drosophila+initiator+caspase+Dronc+functions+in+both+apoptotic+and+non-apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways.</a> PLoS Genetics. 13 (2), 1006438(2017).</li>
<li>Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+preparation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Caspases: preparation and characterization.</a> Methods. 17 (4), 313-319 (1999).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%284th+edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition)</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Hirano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Western blot analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).</li>
<li>Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Western blot techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).</li>
<li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CASBAH%3A+a+searchable+database+of+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).</li>
<li>Fogarty, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+reactive+oxygen+species+drive+apoptosis-induced+proliferation+via+Drosophila+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages.</a> Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+interactions+between+Drosophila+caspases+and+the+proapoptotic+genes+rpr%2C+hid%2C+and+grim%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).</li>
<li>Edfors, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+validation+of+antibodies+for+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced validation of antibodies for research applications.</a> Nature Communications. 9 (1), 4130(2018).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
<li>Brizzard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Epitope tagging.</a> Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).</li>
<li>Kanuka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+cell+death+pathway+by+Dapaf-1%2C+a+Drosophila+Apaf-1%2FCED-4-related+caspase+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator.</a> Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).</li>
<li>Rodriguez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark+is+a+Drosophila+homologue+of+Apaf-1%2FCED-4+and+functions+in+an+evolutionarily+conserved+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway.</a> Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).</li>
<li>Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAC-1%2C+a+Drosophila+homolog+of+APAF-1+and+CED-4+functions+in+developmental+and+radiation-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis.</a> Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).</li>
<li>Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Apoptotic+caspase+activity+preferentially+targets+a+novel+consensus+sequence+associated+with+cytoskeletal+proteins+in+the+developing+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844(2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Większość naszej wiedzy na temat kaspaz i funkcji kaspazy pochodzi z intensywnych prac nad apoptozą w ciągu ostatnich trzech dekad. Bardzo dobrze wiadomo, że kaspazy inicjujące proteolitycznie przetwarzają kaspazy efektorowe, a setki białek zidentyfikowano jako substraty kaspazy efektorowej podczas apoptozy 5,29. W przeciwieństwie do tego, znacznie mniej wiadomo o funkcji kaspaz w procesach nieapoptotycznych i o tym, jakie substraty nieapoptotyczne przetwarzają. Można sobie wyobrazić, że kluczowymi decydentami są tutaj kaspazy inicjatorów. Podczas apoptozy aktywują kaspazy efektorowe powodujące śmierć komórki. Jednak, aby wywołać procesy nieapoptotyczne, mogą aktywować różne białka (inne niż kaspazy efektorowe), które kontrolują proces nieapoptozyjny. W protokole tym testuje się białka kandydujące jako substraty kaspazy inicjującej Dronc u Drosophila 17,30.
Substraty, które mają być badane w teście rozszczepienia, mogą być wytwarzane albo w systemie ekspresji in vitro bez komórek ssaków, takim jak RRL, albo przez rekombinowaną ekspresję w E. coli. Istnieje kilka zalet ekspresji in vitro przy użyciu RRL w porównaniu z ekspresją bakteryjną. Protokół ekspresji RRL jest prosty i szybki, co pozwala na równoległe przygotowanie wielu różnych substratów. W wielu przypadkach ekstrakt RRL zawierający białko będące przedmiotem zainteresowania może być przechowywany w temperaturze -80 °C przed użyciem w teście rozszczepienia (chociaż należy to określić oddzielnie dla każdego substratu). Przypuszczalny substrat można oznaczyć za pomocą S35-Met, co umożliwia łatwą analizę za pomocą autoradiografii po SDS-PAGE. Jest to szczególnie przydatne, jeśli nie jest dostępne przeciwciało specyficzne dla substratu. Alternatywnie, jeśli znakowanie S35-Met nie jest pożądane, przypuszczalny substrat można oznaczyć typowymi znacznikami, takimi jak znaczniki Flag, HA lub Myc, co umożliwia wykrycie rozszczepienia kaspazy za pomocą immunoblottingu.
Należy z całą mocą podkreślić, że powodzenie tego protokołu zależy od starannego i konsekwentnego oczyszczania rekombinowanych białek Dronc i Drice. Niestety, białka te nie mogą być przechowywane – nawet przez krótki czas – ani w lodówce, ani zamrożone. Tracą aktywność enzymatyczną z dnia na dzień w dowolnej przechowywanej formie. Dlatego należy je przygotować na świeżo w dniu testu rozszczepienia. Niezależnie od badanego białka (białek) kandydującego(-ych), DriceC211A powinien być zawsze stosowany jako kontrola pozytywna w celu walidacji aktywności enzymatycznej preparatu Droncwt (patrz rysunek 2B, C). Alternatywnie, aktywność preparatów Dronc i Drice można również badać przez rozszczepianie in vitro fluorogenicznych syntetycznych substratów tetrapeptydowych 2,9,31.
Jeśli przeciwciała są używane do wykrywania potencjalnych substratów, muszą one zostać zwalidowane przez użytkownika32,33. Dotyczy to również dostępnych na rynku przeciwciał, które wykrywają znaczniki epitopów, takie jak Flag, HA, Myc lub inne. Niska jakość przeciwciał może przysłonić ważne wyniki. Zaleca się również podwójne znakowanie epitopów substratów kandydujących zarówno na końcu N, jak i C z różnymi znacznikami34. Jeśli dojdzie do rozszczepienia, podwójne znakowanie pomaga prześledzić oba produkty rozszczepienia i może pomóc w wyjaśnieniu, czy rozszczepienie występuje w jednym lub więcej miejscach.
Chociaż protokół ten z łatwością weryfikuje znany substrat biologiczny Dronc, Drice, istnieją również ograniczenia. Jednym z ograniczeń jest to, że jest to protokół in vitro z rekombinowanymi białkami. W tych testach kaspazy są obecne w niefizjologicznie wysokim stężeniu, co wynika z obserwacji, że mogą spontanicznie automatycznie przetwarzać się w E. coli. Spontaniczne autoprzetwarzanie zwykle nie zachodzi w warunkach fizjologicznych. To wysokie stężenie kaspazy może powodować fałszywą aktywność skutkującą fałszywie dodatnimi wynikami. Wyniki fałszywie dodatnie można wyeliminować poprzez obniżenie stężenia kaspazy w reakcji rozszczepienia in vitro . Ponadto, jak opisano bardziej szczegółowo poniżej, konieczne są dodatkowe testy, aby potwierdzić autentyczne substraty i wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie.
Rekombinowane kaspazy mogą nie mieć takiej samej specyficzności, jak w swoim normalnym środowisku komórkowym in vivo. Na przykład aktywność kaspaz może być modyfikowana przez modyfikacje potranslacyjne. Nie są one obecne w rekombinowanych białkach. Ponadto in vivo kaspazy inicjujące, w tym Dronc, są włączane do dużych kompleksów białkowych, takich jak apoptosom. W warunkach tego protokołu nie dochodzi do powstania apoptosomu. Wymagałoby to rekombinowanej ekspresji Drosophila Apaf-1 (aka Dark lub Hac-1)35-37, która ma swoje własne wyzwania. Dlatego in vitro Dronc może nie mieć takiej samej specyficzności, jaką ma in vivo.
Możliwe jest również, że Dronc jest włączony do innego kompleksu białkowego dla procesów nieapoptotycznych. Może to nadawać Dronc inną specyficzność rozszczepienia, co może również wyjaśniać, dlaczego Dronc nie indukuje apoptozy w warunkach nieapoptotycznych. W związku z tym CasCleave wykorzystuje znane miejsca konsensusu rozszczepienia do przewidywania nowych substratów kaspazy. Nie wiadomo jednak, czy te same miejsca konsensusu rozszczepienia są również wykorzystywane w procesach nieapoptotycznych. W rzeczywistości niedawno wykazano, że kaspaza-3 zmienia swoje preferowane miejsce konsensusu podczas procesu nieapoptotycznego w rozwijającym się słuchowym pniu mózgu w zarodku pisklęcia38. Podobnie, jeśli kaspazy inicjujące są włączone do różnych kompleksów białkowych, mogą mieć różną specyficzność, a zatem mogą rozszczepiać się w różnych sekwencjach konsensusu.
Ograniczenia te pokazują, że nie wystarczy polegać wyłącznie na testach rozszczepienia in vitro opisanych w niniejszym protokole. W celu dalszej walidacji wyników uzyskanych przy użyciu tego protokołu należy zastosować alternatywne podejścia. Idealnie byłoby, gdyby testy in vivo były stosowane w celu odpowiedzi na następujące pytania: Czy białko kandydujące jest przetwarzane proteolitycznie podczas procesu nieapoptotycznego in vivo? Jeśli tak, to czy to samo miejsce rozszczepienia stosuje się in vivo i in vitro? Jakie są konsekwencje, jeśli rozszczepienie zostanie zablokowane przez mutagenezę miejsca rozszczepienia? Czy przetwarzanie substratu kandydującego jest zależne od kaspaz, a jeśli tak, to jakich? Jaka jest rola fragmentów rozszczepienia w procesie nieapoptozy? Na te pytania można łatwo odpowiedzieć w modelowych organizmach genetycznych, takich jak C. elegans i Drosophila, przy użyciu standardowych metod genetycznych i transgenicznych.
Podsumowując, protokół ten opisuje niezawodną i spójną metodę produkcji enzymatycznie aktywnych kaspaz, w szczególności kaspaz Drosophila Dronc i Drice. Ostatecznym celem tego protokołu jest zbadanie, czy Dronc może rozszczepiać potencjalne substraty in vitro, które zostały zidentyfikowane za pomocą podejść genetycznych, biochemicznych lub bioinformatycznych. Jak wyjaśniono w poprzednim akapicie, wymagane są dodatkowe testy, aby potwierdzić te białka jako substraty kaspazy in vivo. Biorąc pod uwagę stopień zachowania genów kaspazy w metazoa, powinno być możliwe dostosowanie tego protokołu również do kaspaz z innych organizmów.

Programowana śmierć komórki lub apoptoza jest wykonywana przez klasę wysoce wyspecjalizowanych proteaz śmierci komórkowej zwanych kaspazami (przejrzane w Reference1). Kaspazy to proteazy Cys, które zawierają resztę Cys w miejscu katalitycznym. Zdefiniowali oni zgodne miejsca rozszczepienia i rozszczepiają substraty proteolitycznie po resztach Asp (chociaż donoszono również, że kaspaza Drosophila Dronc rozszczepia się po resztach Glu2). Dzielą się one na kaspazy inicjujące (znane również jako wierzchołkowe lub upstreamowe) i efektorowe (egzekucyjne lub końcowe). Kaspazy inicjujące aktywują kaspazy efektorowe. Na przykład u ssaków kaspaza inicjująca kaspaza-9 rozszczepia i aktywuje kaspazę efektorową kaspazę-33. Podobnie u Drosophila melanogaster ortolog kaspazy-9 Dronc rozszczepia i aktywuje ortolog kaspazy-3 Drice2,4. Podczas apoptozy kaspazy efektorowe rozszczepiają setki substratów, co prowadzi do śmierci komórki5.
Kaspazy są syntetyzowane w komórce jako nieaktywne proenzymy (zymogeny). W tej formie zawierają N-końcową prodomenę, dużą podjednostkę z katalitycznym Cys w centralnej części proenzymu i małą podjednostkę na C-końcu classus1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Mechanizm aktywacji jest różny między kaspazami inicjatora i efektora. Kaspazy inicjujące (Kaspaza-9, Dronc) wymagają dimeryzacji do aktywacji, która zachodzi przez włączenie do dużego kompleksu białkowego, określanego jako klasa apoptosome6. W celu włączenia do apoptosomu, kaspaza-9 i Dronc przenoszą domenę aktywacji i rekrutacji kaspazy (CARD) w N-końcowej prodomenie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Komponent apoptosomu Apaf-1 zawiera również CARD i rekrutuje Kaspazę-9 lub Dronc poprzez interakcję CARD/CARD do apoptosomu3,6,7. Podczas gdy kaspaza-9 i Dronc mogą być proteolitycznie przetwarzane w apoptosomie, przetwarzanie to nie jest w pełni wymagane dla aktywności enzymatycznej8,9.
Natomiast kaspazy efektorowe (Kaspaza-3, Drice) nie posiadają CARD w swoich prodomenach i nie są włączane do dużych kompleksów białkowych w celu aktywacji1. Są one zależne od rozszczepienia proteolitycznego odpowiednio przez aktywną kaspazę-9 lub Dronc1. Aktywna kaspaza efektorowa tworzy tetramer złożony z dwóch dużych i dwóch małych podjednostek, a zatem zawiera dwa miejsca katalityczne (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Co ważne dla tego protokołu, rekombinowana ekspresja kaspaz w E. coli powoduje automatyczne przetwarzanie i aktywację kaspaz, w tym Drice10 i Dronc2,8,9,11,12, nawet w przypadku braku Apaf-1. To automatyczne przetwarzanie pozwala na przeprowadzanie testów rozszczepienia in vitro potencjalnych substratów z rekombinowanym białkiem kaspazy.
Kaspazy nie tylko biorą udział w apoptozie, ale mogą również pełnić wiele funkcji nieapoptotycznych, w tym proliferację, różnicowanie, migrację komórek, przycinanie neuronów, odporność wrodzoną i inne13,14,15. Obecnie nie wiadomo, w jaki sposób komórki mogą przetrwać pomimo zawierania aktywnych kaspaz podczas procesów nieapoptotycznych. Możliwe, że komórki te aktywują kaspazy tylko na poziomach subletalnych16 lub sekwestrują aktywne kaspazy w nieapoptotycznych przedziałach komórki, takich jak błona plazmatyczna17,18. Dlatego identyfikacja i weryfikacja substratów nieapoptotycznych nie tylko ujawni, w jaki sposób kaspazy pośredniczą w procesach nieapoptotycznych, ale może również pomóc zrozumieć, w jaki sposób komórki mogą przetrwać w obecności aktywnych kaspaz.
Białka kandydujące jako substraty kaspazy mogą być identyfikowane za pomocą metod genetycznych i biochemicznych. Zidentyfikowane białka można sprawdzić pod kątem obecności uzgodnionych miejsc rozszczepienia Dronc. Można to zrobić, dokonując wizualnej kontroli sekwencji białka lub korzystając z bardziej zaawansowanych narzędzi bioinformatycznych online, takich jak CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20. Narzędzia te wykorzystują znane konsensusowe miejsca cięcia kaspaz i względy strukturalne do przewidywania nowych celów kaspaz. Chociaż CasCleave zawiera informacje o zweryfikowanych substratach z ludzkich kaspaz-1, -3, -6, -7 i -8, może być jednak również przydatny do opisanych tutaj celów, ponieważ te kaspazy i ich konsensusowe miejsca cięcia są dobrze zachowane. Ponieważ jednak miejsce cięcia Dronc nie jest dobrze zdefiniowane (dwa badania zidentyfikowały dwa różne optymalne miejsca rozszczepienia, TATD/E2 i LALD9), potencjalne substraty są również badane pod kątem obecności innych miejsc rozszczepienia kaspazy, w tym Drice.
Aby zweryfikować przewidywane substraty kaspaz, konieczne są dodatkowe testy. Jednym z tych testów jest wykazanie, że dana kaspaza może faktycznie rozszczepić białko kandydujące in vitro. W tym miejscu zapewniamy wygodny protokół do testów rozszczepienia kaspazy in vitro. Korzystając z tego protokołu, potencjalne substraty są testowane z Dronc jako kaspazą. Mogą być również testowane jako substraty Drice. Chociaż protokół ten został napisany dla kaspaz Drosophila Dronc i Drice, można go również dostosować do kaspaz z innych organizmów.
Ekstrakcja i oczyszczanie Dronc i Drice wraz z testem rozszczepienia in vitro muszą być przeprowadzone tego samego dnia ze względu na utratę aktywności katalitycznej przez te kaspazy. Ten protokół został zmodyfikowany i zoptymalizowany w stosunku do poprzednich publikacji8,9,11,12,21,22. W tym protokole cztery różne białka kaspazy ulegają rekombinacyjnej ekspresji w szczepzie E. coli BL21 (DE3) pLysS. Białka te to: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt i 6xHis-DriceC211A. Każde z tych białek jest znakowane 6 resztami histydyny (6xHis) na N-końcu w celu oczyszczenia. Droncwt i Dricewt są białkami typu dzikiego i mogą automatycznie przekształcać się w aktywną kaspazę po rekombinowanej ekspresji. DroncC318A i DriceC211A kodują zmutowane formy Dronc i Drice, które zmieniają katalityczną resztę Cys w resztę Ala. Konstrukcje te są katalitycznie nieaktywne i nie mogą być automatycznie przetwarzane (patrz Rysunek 2A). Są one używane jako kontrole w teście rozszczepienia. Ponieważ DriceC211A nie może być przetwarzany automatycznie, jest on również używany jako substrat modelowy dla Droncwt w opisanym tutaj teście rozszczepienia in vitro.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-He</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie IgG, przeciwciało sprzężone z HRP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Myc</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze IgG, sygnalizacja komórkowa przeciwciała sprzężonego z HRP</td><td></td><td>7074P2</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014-5KU</td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer</td><td>Eppendorf</td><td>#6131</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) pLysS Competent Cells</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik wirówki</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA-25.50</td><td></td></tr><tr><td>ROZDĘCIA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc z oprogramowaniem do obrazowania</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood II</td><td>Do obrazowania chemiluminescencji</td></tr><tr><td>Podłoże chemiluminescencyjne</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>34095</td><td>Do obrazowania chemiluminescencji</td></tr><tr><td>Rozszczepiony Drosophila ICE (drICE) (Asp230)</td><td>Technologia sygnalizacji komórek</td> przeciwciał <td>9478S</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety jednorazowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955128</td><td>Służy do pomiaru wzrostu bakterii i stężenia białek</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610610</td><td></td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera, 1000 ml</td><td>Millipore sigma</td><td>CLS49801L</td><td>Do przygotowania pożywki agarowej LB i autoklawowania</td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera, 250 ml</td><td>Millipore sigma</td><td>CLS4980250</td><td>Do wzrostu i indukcji kultur bakteryjnych.</td></tr><tr><td>Kwas etyleno-diamino-tetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik żelowy System SDS-PAGE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>STM1001</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy Halt (100x)</td><td>Thermofisher scientific</td><td>87786</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>His-Drice-pET28a&nbsp;</td><td>To badanie</td><td>N/A</td><td>Dostępne u autorów</td></tr><tr><td>His-DriceC211A-pET28a&nbsp;</td><td>To badanie</td><td>N/A</td><td>Dostępne u autorów</td></tr><tr><td>His-Dronc-pET28a&nbsp;</td><td>To badanie</td><td>N/A</td><td>Dostępne u autorów</td></tr><tr><td>His-DroncC318A-pET28a&nbsp;</td><td>To badanie</td><td>N/A</td><td>Dostępne u autorów</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td></td></tr><tr><td>Izopropylo-&szlig;-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>FERR0392</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (proszek)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiologiczny inkubator płytkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Do wzrostu kolonii po transformacji</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Midiprep</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>Mini rotator rurowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>do mieszania lizatów bakteryjnych i agarozy Ni-NTA</td></tr><tr><td>Zestaw miniprzygotowawczy</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany kontroler pipet</td><td>Gilson</td><td>F110120</td><td>Do korzystania z pipet serologicznych</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP330-1</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroza</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 do 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Żel białkowy Midi, 20-dołkowy</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>WG1402BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Bufor do próbek (4x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor transferowy NuPAGE (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem orbitalnym z regulacją temperatury</td><td>Wytrząsarka</td><td></td><td>inkubatora New Brunswick Scientific</td> C25</tr><tr><td>Petridish 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki galwaniczne</td><td>Zymo research</td><td>S1001</td><td>Do rozsiewania kultur na płytkach AmpR/KanR</td></tr><tr><td>Kolumny polipropylenowe (1 ml)</td><td>Qiagen</td><td>34924</td><td>Do oczyszczania białek znakowanych Hisem</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrat odczynnika do oznaczania białek</td><td>Bio-Rad</td><td>#5000006</td><td></td></tr><tr><td>pT7CFE1-NMyc Thermofisher</td><td>Scientific</td><td>88863</td><td>Do klonowania substratów do ekspresji RRL</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Invitrogen</td><td>LC2007</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polipropylen Rurki z okrągłym dnem</td><td>Fisher Scientific</td><td>352029</td><td>Do hodowli kultur plazmidowych</td></tr><tr><td>QiaRack</td><td>Qiagen</td><td>19095</td><td>Do utrzymywania kolumn polipropylenowych podczas oczyszczania</td></tr><tr><td>Wirówka szybkoobrotowa z chłodzeniem</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-25</td><td></td></tr><tr><td>rRNasin Inhibitor rybonukleazy</td><td>Promega</td><td>N251A</td><td>Do ekspresji RRL</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki Falcon, 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki Falcon, 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A Sacharoza</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70903-250G</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipety serologiczne, sterylne</td><td>leczenie komórkowe</td><td>229001B</td><td>Do lizy komórek bakteryjnych w probówkach 50 ml</td></tr><tr><td>Lizat retikulocytów sprzężony z TnT -T7</td><td>Promega</td><td>L4611</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>2340</td><td></td></tr><tr><td>Zachodnia kaseta do przenoszenia na mokro</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>STM2001</tr></tbody></table>

in vitro testy rozszczepienia przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych kaspaz drosophila do badań przesiewowych substratów

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

Kaspazy to bardzo specyficzne proteazy śmierci komórkowej, które biorą udział w procesach apoptotycznych i nieapoptotycznych. Podczas gdy rola kaspaz podczas apoptozy została bardzo dobrze zdefiniowana i zidentyfikowano i scharakteryzowano wiele apoptotycznych substratów proteolitycznych kaspaz, rola kaspaz w procesach nieapoptotycznych nie jest dobrze poznana. W szczególności do tej pory zidentyfikowano niewiele nieapoptotycznych substratów kaspaz. Tutaj, w celu ułatwienia identyfikacji i charakterystyki potencjalnych substratów kaspazy, opisano protokół, który umożliwia testowanie potencjalnych substratów w testach rozszczepienia kaspazy in vitro. Protokół ten obejmuje produkcję i oczyszczanie rekombinowanych białek kaspazy, wytwarzanie substratów kandydujących w sposób rekombinowany lub w bezkomórkowym systemie ekspresji oraz rzeczywistą reakcję rozszczepienia in vitro, po której następuje SDS-PAGE i immunoblotting. Protokół ten jest dostosowany do kaspaz Drosophila Dronc i Drice, ale można go łatwo dostosować do kaspaz innych organizmów, w tym ssaków.

Niniejszy protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące indukcji białka kaspazy w E. coli, oczyszczania rekombinowanych kaspaz Drosophila Dronc i Drice, syntezy potencjalnych substratów oraz reakcji cięcia in vitro z potencjalnymi substratami (w tym przypadku DriceC211A) i kaspazą Dronc. Mutant katalityczny DriceC211A został użyty jako substrat modelowy w tym teście, ponieważ nie wykazuje on aktywności autoprzetwarzania (Rysunek 2A) i zachowuje pełną długość aż do momentu cięcia przez Droncwt. DriceC211A należy zawsze stosować jako kontrolę pozytywną w celu potwierdzenia aktywności enzymatycznej preparatu Droncwt.
Rysunek 2A stanowi reprezentatywny przykład ekspresji i oczyszczania rekombinowanych kaspaz. Indukowano i oczyszczono cztery różne rekombinowane kaspazy: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricemasa cząsteczkowaoraz 6xHis-DriceC211AOczyszczone kaspazy poddano elektroforezie w żelu SDS-PAGE i analizie immunoblottingowej, a następnie przymiotowano błonę za pomocą przeciwciała anty-His (rozcieńczenie 1:5 000), a następnie przeciwciała anty-mysie IgG sprzężonego z HRP (1:10 000). Nieprzetworzone 6xHis-Dronc (proDronc) migruje przy względnej masie cząsteczkowej (MWr) o masie cząsteczkowej 55 kDa (ścieżka 2), natomiast nieprzetworzone 6xHis-Drice (proDrice) ma masę cząsteczkowąProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. o masie 35 kDa (ścieżka 4). Autoprocesowanie kaspaz jest widoczne poprzez pojawienie się prążków o mniejszej masie cząsteczkowejr które dzięki obecności znaczka His w końcu N-terminalnym reprezentują duże podjednostki kaspaz (Rysunek 1). W przypadku 6x-Dronc podjednostka duża ma masę cząsteczkową (MW)r o masie 40 kDa (ścieżka 1). Duża podjednostka 6x-Drice wędruje na wysokości 23 kDa (ścieżka 3). Mutanty katalityczne 6xHis-DroncC318A oraz 6xHis-DriceC211A nie ulegają autoproteolizie i są wykrywalne wyłącznie jako białka o pełnej długości (ścieżki 2 i 4).
Rycina 2B Aby wykazać, że bakteryjnie wyprodukowana i oczyszczona białka 6xHis-Droncwt w celu sprawdzenia, czy preparat wykazuje aktywność enzymatyczną, przeprowadzono test cięcia in vitro zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Jako kontrolę negatywną zastosowano mutant katalityczny 6xHis-DroncC318A. Substratem było białko N-Myc-Drice otrzymane w układzie RRL.C211A, który jest oznakowany znacznikiem Myc na N-końcu. Po in vitro w reakcji rozszczepienia białka rozdzielono za pomocą SDS-PAGE, wykonano immunoblotting, a następnie membrany inkubowano z przeciwciałem anty-Myc (rozcieńczenie 1:1 000), a następnie z przeciwciałem anty-mouse IgG sprzężonym z HRP (1:10 000), aby wykryć N-Myc-DriceC211APomyślne rozszczepienie, a tym samym aktywność enzymatyczna kaspazy, może zostać wykazana poprzez pojawienie się co najmniej jednego prążka o mniejszej masie cząsteczkowej (MW).r w porównaniu do pełnowymiarowej, nieprzetworzonej formy substratu. Nieprzetworzony, pełnowymiarowy N-Myc-DriceC211A ma masę cząsteczkową (MW)Prześlij tekst źródłowy, który chcesz przetłumaczyć. o masie 40 kDa (ścieżki 2 i 4), podczas gdy duża podjednostka przetworzonego białka N-Myc-DriceC211A przesuwa się na poziomie 30 kDa (ścieżka 3). Ścieżka 1 przedstawia nieprogramowany lizat RRL (bez dodanego plazmidu/transkryptu). Ścieżka 2 demonstruje in vitro produkcja DriceC211A poprzez ekspresję w układzie RRL. Ścieżka 3 zawiera in vitro reakcja cięcia z 6xHis-DroncwtŚcieżka 4 zawiera in vitro reakcja cięcia z 6xHis-DroncC318A.
Rycina 2C Reakcję cięcia in vitro z wykorzystaniem rekombinowanej i oczyszczonej kaspazy (6xHis-Droncwt oraz 6x-His-DroncC318A) i substratu (6xHis-DriceC211A) zgodnie z niniejszym protokołem, przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu. Do analizy reakcji cięcia w tym immunoblotcie zastosowano przeciwciało przeciwko rozszczepionej Drice (rozcieńczenie 1:5 000; następnie przeciwciało anty-królicze IgG sprzężone z HRP (1:10 000)). Przeciwciało przeciwko rozszczepionej Drice wykrywa neoepitop w dużej podjednostce (23 kDa) 6xHis-DriceC211A wyłącznie po przetworzeniu przez 6xHis-Droncwt (ścieżka 1). Mutacja katalityczna 6xHis-DroncC318A nie jest w stanie przetworzyć 6xHis-DriceC211A w tym badaniu, a pełnowymiarowa 6xHis-DriceC211A pojawia się jako słaba, nieprzetworzona prążek o masie 35 kDa (ścieżka 2).
<img alt="Schemat aktywacji kaspaz; przetwarzanie proKaspazy-3/9 przez Kaspazę-9; badanie mechanizmu apoptozy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64392/64392fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Struktura domen kaspaz inicjujących: Kaspazy-9 i Dronc oraz kaspaz efektorowych: Kaspazy-3 i Drice. CARD – domena aktywacji i rekrutacji kaspaz; Cys – względne położenie katalitycznego reszty cysteiny; L – podjednostka duża; S – podjednostka mała. Oznaczono położenie N-końcowych prodomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/64392fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej SDS-PAGE; test cięcia białek; analiza proDronc i proDrice." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64392/64392fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne wyniki. (A) Analiza immunoblottingowa oczyszczonych preparatów rekombinowanych białek 6xHis-Dronc i 6xHis-Drice, z użyciem przeciwciała anty-His. Nieprzetworzone (proDronc i proDrice) oraz cięte formy 6xHis-Dronc i 6xHis-Drice zaznaczono strzałkami. Markery MW wskazano po lewej stronie. (B) Analiza immunoblottingowa reakcji cięcia in vitro N-Myc-Drice wytworzonego w układzie RRL z kaspazami 6xHis-Droncwt (ścieżka 3) lub 6x-His-DroncC318A (ścieżka 4), z użyciem przeciwciała anty-Myc. Reakcje RRL nieprogramowane i programowane (N-Myc-DriceC211A) naniesiono i rozdzielono w ścieżkach 1 i 2. Nieprzetworzony (proDrice) oraz cięty N-Myc-Drice zaznaczono strzałkami. Markery MW wskazano po lewej stronie. (C) Analiza immunoblottingowa reakcji cięcia in vitro bakteryjnie ekspresowanego i oczyszczonego rekombinowanego białka 6xHis-DriceC211A z kaspazami 6xHis-Droncwt (ścieżka 1) lub 6x-His-DroncC318A (ścieżka 2), z użyciem przeciwciała przeciwko ciętemu białku Drice. Pełnowymiarowy (proDrice) oraz cięty 6xHis-DriceC211A zaznaczono strzałkami. Markery MW wskazano po lewej stronie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/64392fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Tabela ta zawiera primery użyte do klonowania w wektorze pET28a. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/Supplementary%20Table1.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Tabela ta zawiera skład buforów i pożywek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/Supplementary%20Table2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania i oczyszczania rekombinowanych kaspaz Drosophila Dronc i Drice oraz ich zastosowanie w testach rozszczepienia in vitro.

In vitro Testy rozszczepienia przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych kaspaz Drosophila do badań przesiewowych substratów

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis ...

Kaspazy to proteazy cysteinowe, które rozszczepiają substraty podczas apoptozy i procesów nieapoptotycznych. Protokół ten opisuje test rozszczepienia in vitro w celu identyfikacji przypuszczalnych substratów inicjującej kaspazy Dronc z Drosophila. Przy dokładnym przestrzeganiu, protokół ten zapewnia niezawodną procedurę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przypuszczalnych substratów kaspazy Dronc lub jakiejkolwiek innej kaspazy.Chociaż protokół ten został opracowany do testów rozszczepienia in vitro przy użyciu kaspazy Drosophila Dronc, można go łatwo dostosować do kaspaz innych organizmów, w tym ssaków. Ważne jest, aby oczyszczanie rekombinowanych kaspaz i testy rozszczepienia in vitro były przeprowadzane tego samego dnia, ponieważ te preparaty kaspazy szybko tracą aktywność enzymatyczną. Procedurę zademonstruje dr Prathibha Yarikipati, adiunkt z mojego laboratorium.Na początek wyjmij zamrożone probówki z granulowanymi kulturami z przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i trzymaj je na lodzie przez 10 minut, aby zmiękczyć osad. Po 10 minutach dodać 0,6 mililitra buforu do lizy komórek bakteryjnych uzupełnionego świeżo dodanymi inhibitorami proteazy, 10 miligramów na mililitr lizozymu i 50 jednostek na mililitr benzonazy do probówek zawierających pelety za pomocą kontrolera pipet z pipetą serologiczną o długości jednego mililitra. Za pomocą tej samej końcówki pipety rozpuścić osad, pipetując w górę i w dół, aż do uzyskania klarownego, bladożółtego roztworu bez żadnych cząstek osadu i inkubować przez 30 minut na lodzie.Przenieść lizaty do odpowiednich probówek wirówkowych i odwirować je w temperaturze 17 000 G przez 40 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przenieś supernatanty do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki, która jest surowym ekstraktem zawierającym kaspazy, i trzymaj probówki na lodzie. Dodaj 0,2 mililitra 50% zawiesiny agarozy kwasu ni-nitrylooctowego do każdej probówki ekstraktów kaspazy i obracaj probówki na rotatorze typu end-on-end przez godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Po godzinie dodaj ekstrakt z agarozą kwasu ni-nitrylooctowego do jednomililitrowych kolumn polipropylenowych z nienaruszoną końcówką, umieść na stojaku i odstaw na pięć minut, aby agaroza kwasu ni-nitrylooctowego opadła. Po pięciu minutach zdjąć nasadkę kolumn i pozwolić supernatantowi wypłynąć grawitacyjnie. Następnie ostrożnie dodaj jeden mililitr buforu do płukania do kolumn, nie naruszając upakowanej żywicy agarozy kwasu ni-nitrylooctowego i przemyj ją przez przepływ grawitacyjny.W celu wymowania kaspaz umieścić 1,5 mililitra probówek mikrowirówek pod dyszą zbiorczą kolumn, po całkowitym opróżnieniu buforu płuczącego. Następnie dodaj 0,5 mililitra buforu elucyjnego do każdej kolumny i zbierz eluant w 1,5 mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Trzymaj eluanty na lodzie i zmierz stężenie białek za pomocą testu Bradforda.W zależności od poziomu ekspresji przypuszczalnego substratu, należy użyć od 1 do 10 mikrolitrów lizatu retikulocytów królika zaprogramowanego białkiem będącym przedmiotem zainteresowania w teście rozszczepienia i utrzymywać go na lodzie. Dodać 10 mikrogramów oczyszczonego wcześniej białka kaspazy i doprowadzić całkowitą objętość reakcji do 50 mikrolitrów za pomocą buforu do oznaczania kaspazy. Inkubować reakcje w łaźni wodnej w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy godziny, upewniając się, że w teście rozszczepienia uwzględniono odpowiednie kontrole.Po trzech godzinach zatrzymaj reakcje, przenosząc probówki na lód i dodaj jedną objętość buforu do próbek LDS zawierającego 50 milimolowych DTT. Próbki należy inkubować w temperaturze 75 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez 10 minut. Szybko wiruj, mieszaj, przesuwając, załaduj 24 mikrolitry na próbkę i uruchom stronę SDS lub przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Cztery różne rekombinowane kaspazy indukowano, oczyszczano i analizowano za pomocą SDS-PAGE, poddano immunoblottingowi, a blot sondowano przeciwciałem przeciwhistydynowym. Nieprzetworzony 6x-Histidine Dronc ma względną masę cząsteczkową 55 kilodaltonów, a nieprzetworzony 6x-His DRICE ma masę cząsteczkową 35 kilodaltonu. Automatyczne przetwarzanie kaspaz jest widoczne po pojawieniu się pasm o mniejszej masie cząsteczkowej.W przypadku rozszczepionego Dronca jest to pasmo 40 kilodaltonów. W przypadku rozszczepionego Drice jest to pasmo 23 kilodaltonów. Po reakcji rozszczepienia in vitro, białka oddzielono za pomocą SDS-PAGE, poddano immunobloblocie, a bloty inkubowano z przeciwciałem anty-Myc w celu wykrycia aminoterminalnie znakowanego Myc Drice C211A.Wyniki wykazały, że wytworzony bakteryjnie i oczyszczony preparat 6x-histydyny Dronc typu dzikiego ma aktywność enzymatyczną. Jest to widoczne poprzez obecność mniejszego pasma rozszczepionego drice'a w porównaniu z rozszczepionym proDrice. Reakcja rozszczepienia in vitro, w której wykorzystuje się zarówno rekombinowaną kaspazę, jak i substrat, analizowano za pomocą SDS-PAGE i immunoblot.Do analizy reakcji rozszczepienia w tym immunoblocie zastosowano przeciwciało przeciw rozszczepieniu Drice'a. Wyniki wykazały, że wytworzony i oczyszczony bakteryjnie preparat 6x-His Dronc ma aktywność enzymatyczną. Jest to widoczne po obecności mniejszego pasma rozszczepionego drice'a w porównaniu z nierozszczepionym proDrice.Należy pamiętać, że rekombinowane kaspazy szybko tracą aktywność enzymatyczną. Nie można ich przechowywać, nawet w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Testy rozszczepienia in vitro muszą być wykonane tego samego dnia.Dodatnie trafienia w teście rozszczepienia in vitro powinny być walidowane in vivo. Można to zrobić w komórkach lub w organizmach modelowych genetycznych, takich jak Drosophila lub C.elegans.

in-vitro-cleavage-assays-using-purified-recombinant-drosophila

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy usprawniony protokół przygotowywania preparatów typu „fillet” (filetowanie) zarodków Drosophila o określonych genotypach. Protokół ten umożliwia efektywne przeprowadzanie różnorodnych przesiewów genetycznych. Pozwala on również na doskonałą wizualizację struktur w późnym stadium rozwoju zarodka.

Żywa dyssekcja zarodków Drosophila: Usprawnione metody przesiewania kolekcji mutantów za pomocą barwienia przeciwciałami

Ten film opisuje metodę przesiewową w celu identyfikacji transgenicznych muszek Drosophila, których genom został zmodyfikowany za pomocą CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 to potężne narzędzie do edycji genomu, które zrewolucjonizowało sposób, w jaki naukowcy mogą manipulować genomem organizmu. W przykładowym protokole zobaczymy, jak zidentyfikować mutanty generowane przez CRISPR, w których insercja sekwencji transaktywacyjnej zastępuje pierwszy ekson genu bezgałęziowego (bnl), tworząc w ten sposób linię...

Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu: metoda identyfikacji mutantów generowanych przez CRISPR u Drosophila

Wprowadzenie małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka Drosophila daje ogromne możliwości do charakteryzowania aktywności biologicznej nowych związków, leków i toksyn, a także do badania podstawowych ścieżek rozwojowych. Opisane tu metody nakreślają kroki, które pokonują naturalne bariery dla tego podejścia, rozszerzając użyteczność modelu zarodka Drosophila.

Metoda przenikania zarodków Drosophila do oznaczania aktywności drobnocząsteczkowej

Aby wykryć zdrowe komórki u całych zwierząt, które zawierają niski poziom aktywności kaspazy, dla Drosophila wygenerowano wysoce czuły biosensor o nazwie CaspaseTracker. Aktywność biosensora zależna od kaspazy jest wykrywana w długowiecznych zdrowych komórkach w narządach wewnętrznych dorosłych zwierząt hodowanych w zoptymalizowanych warunkach przy braku bodźców śmierci.

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Anastasis jest technicznie trudne do wykrycia in vivo, ponieważ komórki, które odwróciły proces śmierci komórki, mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek. Poniżej opisujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt, przy użyciu naszego nowo opracowanego systemu biosensorów CaspaseTracker in vivo.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Opisujemy tutaj test fagocytozy z wykorzystaniem rozproszonych komórek embrionalnych Drosophila. Umożliwia nam łatwe i precyzyjne ilościowe określenie poziomów fagocytozy in vivo oraz identyfikację nowych cząsteczek wymaganych do fagocytozy komórek apoptotycznych.

Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

Prezentujemy protokół wykorzystujący zaawansowane podejście genetyczne do badań przesiewowych w kierunku mutantów wykazujących neurodegenerację u Drosophila melanogaster. Obejmuje on test wspinaczkowy, analizę histologiczną, mapowanie genów i sekwencjonowanie DNA, aby ostatecznie zidentyfikować nowe geny związane z procesem neuroprotekcji.

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

Drosophila to szeroko stosowany model eksperymentalny, odpowiedni do badania przesiewowego leków o potencjalnym zastosowaniu w terapii raka. W tym miejscu opisujemy zastosowanie barwnych fenotypów oczu Drosophila jako metody badań przesiewowych związków małocząsteczkowych, które sprzyjają tworzeniu heterochromatyny.

Metoda przesiewowa do identyfikacji leków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Poznaj metodę oczyszczania rekombinowanych kaspaz Drosophila i testów rozszczepienia in vitro do badań przesiewowych substratów. Protokół umożliwia niezawodne badanie aktywności enzymatycznej Dronc.

In vitro Testy rozszczepienia przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych kaspaz Drosophila do badań przesiewowych substratów

Przeglądaj więcej filmów