Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Protokół ten demonstruje naczynie do hodowli komórkowych z mikroteksturą, zaprojektowane do wzrostu setek organoidów ze znajomością materiału i w pełni kompatybilne z mikroskopią. Nasza technika skutecznie pozwala na wygenerowanie tysięcy organoidów, w pełni kompatybilnych z długoterminowym obrazowaniem i długotrwałą hodowlą komórkową. Protokół ten cieszy się dużym zainteresowaniem w zastosowaniach biomedycznych, takich jak badania przesiewowe leków i badania nad rakiem.

Technika przedstawiona w tym protokole jest łatwa do opanowania po kilku próbach przez każdego, kto ma doświadczenie z procedurami laboratoryjnymi i mikroskopią optyczną. Na początek przytnij małe porcje formy PDMS do wymiaru wymaganego dla urządzenia końcowego. Przytnij je równolegle do kierunków XY tablicy.

Umieść jedną z przygotowanych kości formy PDMS zakrytą do dołu na płaskiej sekcji PDMS. Następnie za pomocą pipety dodaj około 0,1 do 0,2 mililitra kleju utwardzanego promieniami UV po jednej stronie formy. Śledź postęp cieczy wewnątrz wnęki za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego przy 10-krotnym powiększeniu.

Wystaw klej na działanie światła UV, aby go utwardzić. Dostosuj czas naświetlania w zależności od gęstości mocy źródła UV zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Używając nadmiaru kleju na jednej krawędzi, przytrzymaj utwardzony klej na płaskim podłożu PDMS, delikatnie dociskając go palcem.

W międzyczasie za pomocą pęsety ściśnij jeden róg formy obok tej samej krawędzi, która jest dociskana i powoli odklej formę, upewniając się, że teksturowana folia nie została podniesiona. Przytnij nadmiar kleju i podłoża PDMS za pomocą żyletki, aby pozostawić utwardzoną, teksturowaną i klejącą warstwę płasko na PDMS, a nadmiar podłoża tylko na jednej krawędzi. Czyste szkiełko nakrywkowe należy poddać krótkiemu procesowi plazmy tlenowej, aby poprawić jego hydrofilowość.

Po aktywacji plazmowej należy odwirować cienką warstwę kleju utwardzanego promieniami UV, umieszczając szkiełko nakrywkowe na uchwycie próżniowym standardowej powlekarki wirowej i wlewając niewielką kroplę kleju na środek szkiełka nakrywkowego. Uruchom proces powlekania wirowego zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Jeśli powłoka wirowa jest niedostępna, upuść około 0,1 mililitra kleju utwardzanego promieniami UV na czyste szkiełko nakrywkowe za pomocą pipety.

Weź drugie szkiełko nakrywkowe i umieść je na pierwszym, aby płynny klej równomiernie rozprowadził się między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Gdy klej dotrze do krawędzi szkiełek nakrywkowych, delikatnie je rozdziel, przesuwając jeden po drugim. Po rozdzieleniu oba szkiełka nakrywkowe zostaną w całości pokryte cienką warstwą płynnego kleju.

Po powlekaniu wirowym klej należy wstępnie utwardzić przez wystawienie na działanie promieni UV. Dostosuj czas ekspozycji w zależności od gęstości mocy używanego źródła UV. Weź jedną z teksturowanych folii i umieść ją w kontakcie z pokrytym klejem szkiełkiem nakrywkowym. Upewnij się, że kontakt między częściowo utwardzonym klejem a teksturowaną folią jest tak równomierny, jak to tylko możliwe.

Na tym etapie klej na szkiełku nakrywkowym powinien być wystarczająco solidny, aby uniknąć ponownego rozpływania się, a kontakt można zoptymalizować, delikatnie naciskając na szkiełko nakrywkowe. Wystawiaj szkiełka nakrywkowe na działanie promieni UV, aż do całkowitego utwardzenia powlekanej warstwy kleju. Spowoduje to uszczelnienie teksturowanej folii na szkiełku nakrywkowym i zapewni szczelną izolację między wnękami obwodowymi.

Następnie za pomocą pęsety ściśnij PDMS na krawędzi, na której pozostał nadmiar materiału po przycięciu i oderwij płaskie podłoże PDMS. Ten krok umożliwia przyleganie teksturowanej warstwy folii do szkiełka nakrywkowego z otwartym dostępem u góry w celu wysiewu komórek. Przed wysiewem komórek, na urządzeniu pasywowanym kopolimerem biometrycznym, jak opisano w manuskrypcie, należy dozować jeden mililitr sterylnego PBS do 35-milimetrowych szalek Petriego do hodowli komórkowych.

Odgazuj naczynie sterylnym PBS za pomocą komory próżniowej przez 10 minut, a następnie wykonaj kilka rund pipetowania w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków. Zastąp PBS sterylną pożywką hodowlaną i sterylizuj płytkę światłem UV przez 30 minut pod kapturem do hodowli komórkowych. Przygotować zawiesinę komórkową, postępując zgodnie z zaleceniami dotyczącymi trypsynizacji lub przygotowania zawiesiny komórkowej dla komórek będących przedmiotem zainteresowania, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu.

Policz i dostosuj stężenie komórek do 500 000 komórek na mililitr w zalecanej pożywce do hodowli komórkowych. Usuń bufor PBS z 35-milimetrowej naczynia do hodowli komórek, a następnie dozuj jeden mililitr dostosowanej zawiesiny komórek. Umieść naczynie do hodowli komórkowych z powrotem w inkubatorze komórkowym na 10 minut.

Około 80 do 100 komórek wejdzie do każdej wnęki obwodowej. Po około 10 minutach inkubacji wyjmij naczynie z hodowli komórkowej z inkubatora i delikatnie zassaj zawiesinę komórkową w celu usunięcia nieuwięzionych komórek. Dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej do naczynia hodowlanego i umieść go z powrotem w inkubatorze komórkowym.

Opcjonalnie, aby odzyskać organoidy po ich wyrośnięciu w studzienkach, ściśnij teksturowaną warstwę kleju na krawędzi cięcia za pomocą pęsety i delikatnie oderwij ją od szklanego szkiełka nakrywkowego, ale trzymaj ją zanurzoną w podłożu. Zwiększenie stężenia kopolimeru biometrycznego zwiększyło grubość powłoki. Całkowite odgazowanie naczyń do hodowli komórkowych było niezbędne do usunięcia pęcherzyków powietrza uwięzionych w jamach obwodowych.

Organoidy powstały po dwóch i 15 dniach hodowli. Mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem wykazała reprezentatywne obrazy organoidów i rekonstrukcję 3D. Podczas przygotowywania naczynia hodowlanego należy zwrócić uwagę na montaż stosu formy lub podłoża oraz zapewnić dobry kontakt między teksturowaną folią a szkiełkiem nakrywkowym.

Szczelność zapewniana przez nasze mikrownęki i brak strat materialnych przyciągnęły uwagę naukowców zajmujących się biologią kosmiczną zainteresowanych badaniem wpływu mikrograwitacji na homeostazę organoidów.