Name: Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową platformę do hodowli i obrazowania 3D organoidów przy użyciu mikrostrukturyzowanych naczyń do badań nad rakiem i odkrywania leków. Ta metoda umożliwia długoterminowe obserwacje.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania są wspierane przez projekt CALIPSO wspierany przez National Research Foundation, Biuro Premiera, Singapur, w ramach programu Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. dziękuje za wsparcie badacza NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI seed funding, oraz ANR ADGastrulo. A.B. i G.G. dziękują za wsparcie ze strony MBI core funding. A.B. dziękuje Andor Technologies za pożyczkę mikroskopu BC43.

UWAGA: Pierwsza część tego protokołu szczegółowo opisuje mikrofabrykację urządzenia do hodowli komórek. Oryginalna forma pierwotna z piramidalnymi wgłębieniami może być produkowana we własnym zakresie - jeśli dostępne są urządzenia do mikroprodukcji - lub zlecana firmom zewnętrznym. Podstawowa forma używana w tej pracy jest produkowana we własnym zakresie, a etapy procesu produkcyjnego są opisane gdzie indziej11,13. Podstawowy protokół mikrowytwarzania formy jest dostępny w pliku uzupełniającym 1. KRYTYCZNE: Operacje w krokach od 1 do 6 muszą być wykonywane w środowisku wolnym od kurzu. Preferowany jest okap z przepływem laminarnym lub pomieszczenie czyste, jeśli jest dostępne. Na wszystkich tych etapach należy używać środków ochrony osobistej (PPE), takich jak rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne.
1. Kostkowość formy PDMS
<ol>
	<li>Przytnij małe porcje formy PDMS do wymiaru wymaganego dla końcowego urządzenia (np. 1 cm x 1 cm [<silna klasa="xfig">Rysunek 1B]). Przytnij je równolegle do kierunków XY tablicy. 
	KRYTYCZNE: Podczas krojenia formy PDMS w kostkę o wymiarach 1 cm x 1 cm, wykonuj cięcia w pojedynczych krokach; za pomocą jednostronnej żyletki dociśnij i przetnij PDMS w jednym kroku. Ma to na celu zapobieżenie tworzeniu się drobnych cząsteczek PDMS, które mogą osadzać się na powierzchni formy i wpływać na jakość stopni repliki (krok 3).</li>
</ol>
2. Przygotowanie płaskich podłoży PDMS
<ol>
	<li>Odważyć ~15-20 g żywicy bazowej PDMS i 1,5-2 g jej środka siatkowego (tj. w stosunku 10:1), dokładnie wymieszać i odgazować w słoiku próżniowym przez ~20 min.</li>
	<li>Powoli wylej odgazowany PDMS na plastikową szalkę Petriego o szerokości 15 cm (średnicy).</li>
	<li>Utwardzić PDMS, trzymając szalkę Petriego w piekarniku nastawionym na 65°C przez 2 godziny. Po odczekaniu na zakończenie utwardzania, płaska folia PDMS o grubości ~1.5 mm (zawarta w szalce Petriego) jest gotowa do użycia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Za pomocą ostrego ostrza wytnij kawałki o wymiarach 2 cm x 2 cm z PDMS (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B-D). 
	UWAGA: Dokładna grubość tego arkusza PDMS nie jest krytyczna; ~1-2 mm to odpowiedni zakres. Wymiar cięcia powinien być większy niż teksturowana forma, ale niewiele większy, co skutkowałoby marnotrawstwem materiału.</li>
</ol>
3. Produkcja teksturowanej warstwy z kleju utwardzanego promieniami UV
<ol>
	<li>Umieść jedną kostkę formy PDMS (przygotowaną w kroku 1) zakrytą na płaskim cięciu PDMS (przygotowanym w kroku 2) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A,B). 
	UWAGA: Upewnij się, że ostrosłupowe występy w formie są zorientowane w kierunku płaskiego podłoża PDMS i że stykają się tylko górna powierzchnia ściętych piramid. Oceń prawidłowe umiejscowienie za pomocą mikroskopu optycznego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C,D).</li>
	<li>Na jedną stronę formy, za pomocą pipety, upuść niewielką ilość (dwie krople, około 0,1-0,2 ml) kleju utwardzanego promieniami UV (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 4A). 
	UWAGA: Gdy ciecz zetknie się z krawędzią formy, kapilarność sprawi, że ciecz wypełni wnękę między samą formą a płaskim cięciem PDMS używanym jako podłoże.
	<ol>
		<li>Śledź postęp cieczy wewnątrz jamy, na przykład za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego z obiektywem o 10-krotnym powiększeniu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B,C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wystaw klej utwardzany promieniami UV na działanie światła UV, aby go utwardzić. Dostosuj czas naświetlania w zależności od gęstości mocy zastosowanego źródła UV (np. skrzynka UV-LED o gęstości mocy 35 mW/cm2; 2 minuty przy 50% mocy w tym protokole, aby całkowicie utwardzić klej).</li>
	<li>Używając nadmiaru kleju na jednej krawędzi, przytrzymaj utwardzony klej na płaskim podłożu PDMS, delikatnie naciskając palcem (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A,B). W międzyczasie użyj pęsety, aby ścisnąć jeden róg formy obok tej samej krawędzi, która jest dotrzymywana i powoli ją odklej, upewniając się, że teksturowana folia również nie jest podniesiona. 
	UWAGA: <silna klasa="xfig">Rysunek 5C pokazuje wynik prawidłowej procedury usuwania pleśni; Rysunek 5E-G pokazuje nieprawidłową procedurę.</li>
	<li>Przytnij nadmiar kleju i nadmiar podłoża PDMS za pomocą żyletki, aby pozostawić utwardzoną, teksturowaną warstwę kleju płasko na PDMS z nadmiarem PDMS tylko na jednej krawędzi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5D), która będzie potrzebna w kroku 5.</li>
</ol>
4. Przygotowanie podłoża do szkiełek nakrywkowych
UWAGA: Jako podłoże dla końcowego urządzenia, używane są standardowe zaokrąglone szkiełka nakrywkowe 1,5H o średnicy 25 mm. Przed użyciem należy je oczyścić, aby usunąć kurz i/lub resztki organiczne z ich powierzchni.
<ol>
	<li>Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
	<ol>
		<li>Zanurz szkiełka nakrywkowe w wodzie z mydłem na 5 minut podczas aplikacji ultradźwięków (40 kHz, moc soniczna 110 W).</li>
		<li>Umyj szkiełka nakrywkowe w czystej wodzie dejonizowanej (DI), najpierw przez zanurzenie, a na końcu pod bieżącą wodą z kranu. Osuszyć szkiełka nakrywkowe za pomocą pistoletu do przedmuchiwania z gazem N2.</li>
		<li>Zanurzyć szkiełka nakrywkowe w kąpieli acetonowej na 5 minut, a następnie natychmiast przenieść do kąpieli z 2-propanolem (IPA) na dodatkowe 5 minut.</li>
		<li>Opłucz szkiełka nakrywkowe czystym IPA za pomocą wyciśniętej butelki. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe za pomocą pistoletu do przedmuchiwania gazowego N2. 
		UWAGA: Szkiełka nakrywkowe oczyszczone przy użyciu tej procedury można przechowywać w zamkniętym pojemniku do czasu, gdy będą potrzebne. Przechowuj je w suchej szafce, aby uniknąć osadzania się wilgoci na ich powierzchni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy szkiełko nakrywkowe jest gotowe do użycia, należy je poddać krótkiemu procesowi plazmowemuO2, aby poprawić jego hydrofilowość: O2 20 sccm, ciśnienie 3 mbar, 60 W przy generatorze mocy RF i czas trwania 60 s.</li>
	<li>Natychmiast po aktywacji plazmowej należy przystąpić do wirowania cienkiej warstwy kleju utwardzanego promieniami UV, umieszczając szkiełko nakrywkowe na uchwycie próżniowym standardowej powlekarki spinowej i wlewając niewielką kroplę kleju na środek szkiełka nakrywkowego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 6). Uruchom proces wirowania: rozprowadzanie przez 5 s przy 500 obr./min, powlekanie przy 3 000 obr./min przez 45 s (przy przyspieszaniu i zwalnianiu ustawionym na 100 obr./min).
	<ol>
		<li>Jeśli powlekanie wirowe nie jest dostępne, należy zastosować następujący alternatywny sposób, aby uzyskać cienką warstwę kleju UV na szkiełkach nakrywkowych:
		<ol>
			<li>Na czyste szkiełko nakrywkowe upuść ~0,1 ml kleju utwardzanego promieniami UV za pomocą pipety (<silna klasa = "xfig">Rysunek 7A).</li>
			<li>Weź drugie szkiełko nakrywkowe i umieść je na pierwszym, aby płynny klej równomiernie rozprowadził się między dwoma szkiełkami nakrywkowymi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 7B-D).</li>
			<li>Gdy rozprowadzający się klej dotrze do krawędzi szkiełek nakrywkowych, delikatnie je rozdziel, przesuwając jeden na drugi. Po rozdzieleniu oba szkiełka nakrywkowe są całkowicie pokryte cienką warstwą płynnego kleju (<klasa mocna = "xfig" >Rysunek 7E). 
			UWAGA: Powłoka może nie być jednolita i gładka tylko wtedy, gdy separacja nie odbywa się płynnym i ciągłym ruchem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępne utwardzanie kleju utwardzanego promieniami UV
	<ol>
		<li>Po powlekaniu wirowym klej należy wstępnie utwardzić przez wystawienie na działanie promieni UV. Dostosuj czas naświetlania w zależności od gęstości mocy zastosowanego źródła UV (tutaj przez 1 min przy 50% mocy używano boxa UV-LED o gęstości mocy 35 mW/cm2). 
		KRYTYCZNE: Zastosowany tutaj klej jest klejem optycznym. Zobacz dyskusję, aby zapoznać się z kluczowymi punktami związanymi z dawkami energii do jego utwardzania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przeniesienie teksturowanej folii na końcowe podłoże
<ol>
	<li>Weź jedną z folii teksturowanych (przygotowaną w kroku 3) i umieść ją w kontakcie z pokrytym klejem szkiełkiem nakrywkowym (przygotowanym w kroku 4). Upewnij się, że kontakt między częściowo utwardzonym klejem na szkiełku nakrywkowym a teksturowaną folią jest tak równomierny, jak to możliwe (<silna klasa="xfig">Rysunek 8A-C). 
	KRYTYCZNE: Na tym etapie klej na szkiełku nakrywkowym powinien być wystarczająco solidny, aby uniknąć ponownego rozlewania się, co wypełniłoby piramidalne wgłębienia teksturowanej folii po umieszczeniu w kontakcie, ale także być na tyle plastyczny i przyczepny, aby kontakt można było zoptymalizować poprzez delikatne naciśnięcie teksturowanej folii.</li>
	<li>Wystawiaj szkiełka nakrywkowe na działanie promieni UV, aż warstwa kleju pokryta na szkiełku nakrywkowym zostanie całkowicie utwardzona. Spowoduje to uszczelnienie teksturowanej folii na szkiełku nakrywkowym i zapewni szczelną izolację między wnękami piramidalnymi.</li>
	<li>Na koniec odklej płaskie podłoże PDMS (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 8D-F). Za pomocą pęsety ściśnij PDMS w jednym rogu na krawędzi, w którym pozostał nadmiar materiału po przycięciu (krok 3.5). W ten sposób teksturowana warstwa folii pozostaje przyklejona do szkiełka nakrywkowego z otwartym dostępem u góry w celu wysiewu komórek. KRYTYCZNE: Podczas odklejania płaskiego PDMS teksturowana folia powinna pozostać dobrze przymocowana do szkiełka nakrywkowego. Błędy w przyczepności można łatwo potwierdzić, jeśli teksturowaną folię można bez wysiłku oderwać od szkiełka nakrywkowego po końcowej ekspozycji na promieniowanie UV.</li>
</ol>
6. Długotrwała pasywacja szkiełka nakrywkowego hodowli komórkowej do hodowli komórkowej
UWAGA: Pasywację osiąga się poprzez generowanie konforemnej i ciągłej powłoki kopolimeru biomimetycznego o strukturze podobnej do polarnej grupy fosfolipidów w błonie komórkowej. Ta konforemna powłoka zapobiega przyleganiu komórek do urządzenia do hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zawierający 0,5% (w/v) kopolimeru biomimetycznego rozpuszczonego w czystym etanolu. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe z hodowli komórkowej na szalce Petriego o średnicy 35 mm i całkowicie pokryć roztworem kopolimeru biomimetycznego</li>.
	<li>Po 5 minutach wyjąć szkiełko nakrywkowe z hodowli komórkowej z pojemnika z roztworem kopolimeru biomimetycznego i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej wewnątrz końcowego naczynia w kapturze bezpieczeństwa biologicznego (>1 h). 
	UWAGA: Grubszą powłokę można uzyskać poprzez zwiększenie stężenia kopolimeru biomimetycznego w roztworze powlekającym; wyniki grubszej powłoki są widoczne pod mikroskopem jasnego pola (<silna klasa="xfig">Rysunek 9A).</li>
</ol>
7. Rozsiewanie komórek
<ol>
	<li>Odgazowanie i sterylizacja
	<ol>
		<li>Tuż przed wysiewem komórek należy dozować sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do szalek do hodowli komórkowych (zwykle 1 ml dla szalki Petriego o średnicy 35 mm). Odgazuj naczynie sterylnym PBS za pomocą urządzenia ultradźwiękowego przez ~10 minut, a następnie wykonaj kilka rund pipetowania w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków. 
		KRYTYCZNE: Jeśli powietrze zostanie uwięzione w jamach piramidalnych, zapobiegnie to przedostawaniu się do nich komórek. Aby upewnić się, że w piramidzie nie ma uwięzionego powietrza przed wysiewem komórek, zaleca się wizualne upewnienie się (pod mikroskopem jasnego pola przy 10-krotnym lub 20-krotnym powiększeniu) braku powietrza w tych jamach (<klasa silna = "xfig">Ryc. 10).</li>
		<li>Zastąp PBS sterylną pożywką hodowlaną i sterylizuj płytkę światłem UV przez 30 minut pod kapturem do hodowli komórkowych. 
		UWAGA: Od tego kroku danie powinno być uważane za sterylne i manipulowane przy użyciu sterylnych technik. Alternatywnym sposobem usunięcia uwięzionego powietrza z urządzenia do hodowli komórkowej jest użycie słoika próżniowego z pompą próżniową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zawiesiny komórkowej 
	UWAGA: Komórki mogą być rozsiewane jako agregaty pojedynczych lub małych komórek i wchodzić do studzienek próbki przez górny otwór. Z biegiem czasu wstawione komórki agregują się i rosną w studzienkach na próbkę w sferoidy o rozmiarze większym niż rozmiar otworu. Jako zwalidowane modele linii komórkowych należy użyć komórek nowotworowych HCT116 (CCL-247 ATCC) lub MCF7 (HTB-22 ATCC) utrzymywanych w zalecanej pożywce hodowlanej (wytyczne ATCC).
	<ol>
		<li>Przygotuj zawiesinę komórek (np. przy użyciu procesu trypsynizacji zgodnie z wytycznymi ATCC). Postępuj zgodnie z zaleceniami dotyczącymi trypsynizacji/przygotowania zawiesiny komórkowej dla komórek będących przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>Policz i dostosuj stężenie komórek do 0,5 × 106 komórek/ml w zalecanej pożywce hodowlanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dozowanie komórek
	<ol>
		<li>Usunąć bufor PBS z 35-milimetrowej płytki do hodowli komórek, a następnie dozować 1 ml dostosowanej zawiesiny komórek. Zobacz Rysunek 11A dla obrazu mikroskopu optycznego procedury wysiewu komórek o odpowiedniej gęstości i jednorodności.</li>
		<li>Umieść naczynie do hodowli komórkowych z powrotem w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 i 100% wilgotności) na 10 minut. Około 80-100 komórek dostanie się do każdej jamy piramidalnej. 
		UWAGA: Możliwe jest zwiększenie liczby komórek na szalce do hodowli komórkowej poprzez zwiększenie stężenia komórek lub czasu spędzonego przed usunięciem zawiesiny komórek. Zazwyczaj tworzenie sferoid trwa kilka godzin (w zależności od typu komórki) po wysiewie komórek i można je śledzić za pomocą mikroskopu jasnego pola (obiektywy od 4x do 40x; <silna klasa="xfig">Rysunek 11). Stąd pożywka hodowlana, matryce zewnątrzkomórkowe i różnicujące czynniki wzrostu mogą być zmieniane lub dodawane do szalki do hodowli komórkowej zawierającej sferoidy zgodnie z typowymi protokołami różnicowania, które mogą trwać kilka dni, tygodni lub miesięcy.</li>
		<li>Po 10-minutowej inkubacji odzyskać naczynie do hodowli komórkowych z inkubatora i delikatnie zassać zawiesinę komórkową, aby usunąć nieuwięzione komórki. Dodać 1 ml pożywki hodowlanej do naczynia o średnicy 35 mm i umieścić z powrotem w inkubatorze komórkowym. 
		KRYTYCZNE: Na tym etapie, ponieważ sferoidy jeszcze się nie uformowały, bardzo ważne jest, aby unikać silnego zasysania lub dozowania, które spowoduje utratę komórek. Na tym etapie zdecydowanie zaleca się kontrolę wizualną za pomocą stacjonarnego mikroskopu jasnego pola.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Barwienie immunologiczne i obrazowanie
<ol>
	<li>Utrwalanie i barwienie 
	UWAGA: Różne klasyczne procedury utrwalania i barwienia immunologicznego są całkowicie kompatybilne z naczyniem do hodowli komórkowych. Jeden z typowych protokołów jest opisany tutaj.
	<ol>
		<li>Utrwalić organoidy/sferoidy w naczyniu do hodowli komórkowych na 20 minut w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Organoidy przepuszczać przez 24 godziny w 1% roztworze środka powierzchniowo czynnego w sterylnym PBS w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej i inkubować przez 24 godziny w buforze blokującym (2% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] i 1% środka powierzchniowo czynnego w sterylnym PBS) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej.</li>
		<li>Próbki inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania w rozcieńczeniu między 1/50 a 1/200 (lub zgodnie z zaleceniami producenta) w buforze do rozcieńczania przeciwciał (2% BSA i 0,2% środka powierzchniowo czynnego w sterylnym PBS) w temperaturze 4 °C przez 48 godzin.</li>
		<li>Przepłukać próbki 3x buforem płuczącym na wytrząsarce orbitalnej (3% NaCl i 0,2% środka powierzchniowo czynnego w sterylnym PBS) i inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w buforze do rozcieńczania przeciwciał (rozcieńczenie między 1/100 a 1/300 lub zgodnie z zaleceniami producenta), 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i 0,2 μg/ml Alexa Fluor 647 lub 488 falloidyny w temperaturze 4 °C przez 24 godziny na wytrząsarce orbitalnej, następnie następuje pięć etapów płukania za pomocą PBS. Opcjonalnie należy umieścić próbki przy użyciu rozpuszczalnego w wodzie środka czyszczącego podgrzanego do temperatury 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie 
	UWAGA: Na tym etapie organoidy w płytce mikrodołkowej można uznać za normalne naczynie hodowlane zawierające utrwalone i barwione próbki do obrazowania: można zastosować dowolną standardową procedurę obrazowania bez konieczności adaptacji lub modyfikacji. Rysunek 12 ilustruje reprezentatywny wynik obrazów i rekonstrukcji 3D uzyskanych przy użyciu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem, z obiektywem pneumatycznym o powiększeniu 40x (apertura numeryczna 0,75).
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania konstruktora do automatycznego procesu akwizycji obrazu z następującymi ustawieniami: czas naświetlania = 50 ms, z zmotoryzowanym stolikiem, aby uzyskać z-stos (1 μm Z-step, dla całkowitej wysokości 70 μm).</li>
		<li>Wykonuj rekonstrukcję 3D za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Uwolnienie i zebranie organoidów
UWAGA: Teksturowana warstwa adhezyjna naczynia do hodowli komórkowej może zostać oderwana od szkiełka nakrywkowego, aby uwolnić żywe sferoidy/organoidy (przed utrwaleniem) zawarte w jamach piramidowych do analizy komórek za pomocą innych procedur, takich jak sekwencjonowanie RNA, podejścia -omiczne, eksperymenty in vitro i przeszczepy in vivo.
<ol>
	<li>Gdy próbka nadal znajduje się na szalce Petriego i w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, użyj ostrza, takiego jak skalpel, aby odciąć róg teksturowanej warstwy kleju.</li>
	<li>Za pomocą pęsety ściśnij teksturowaną warstwę kleju na krawędzi cięcia i delikatnie oderwij ją od szklanego szkiełka nakrywkowego, ale trzymaj ją zanurzoną w podłożu (niektóre organoidy mogą pozostać w warstwie kleju, <silna klasa="xfig">Ryc. 13).</li>
	<li>Przepłukać 3x pożywką hodowlaną i zebrać organoidy pipetując.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+materials+for+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+past+learning+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li>
<li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72(2020).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274(2020).</li>
<li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li>
<li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+organoids%3A+a+bright+future+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li>
</ol>

Opublikowano międzynarodowe zgłoszenie patentowe o numerze publikacji WO 2021/167535 A1.

W artykule opisano procedurę wytwarzania szalki do hodowli mikrostudzienek, która umożliwia hodowlę organoidów o dużej gęstości i różnicowanie. Ze względu na geometrię i rozmieszczenie mikrownęk, tysiące sferoid można hodować i barwić na jednej płytce przez długi czas (kilka tygodni lub dłużej) bez prawie żadnych strat materiału. Dla porównania, powierzchnia 4 mm x 2 mm na płytce hodowli komórkowej może zawierać tyle samo sferoid, co pojedyncza płytka 384-dołkowa o powierzchni 12 cm x 8 cm. 
R...

W organotypowych hodowlach komórkowych 3D, zwanych dalej organoidami, komórki macierzyste różnicują się i samoorganizują w struktury przestrzenne, które wykazują silne podobieństwa morfologiczne i funkcjonalne do prawdziwych organów. Organoidy oferują cenne modele do badania biologii i rozwoju człowieka poza ciałem1,2,3. Opracowywana jest coraz większa liczba modeli, które naśladują wątrobę, mózg, nerki, płuca i wiele innych narządów2,4,5. Różnicowanie organoidów jest kierowane przez dodanie rozpuszczalnych czynników wzrostu i macierzy zewnątrzkomórkowej w precyzyjnej sekwencji czasowej. Jednak w przeciwieństwie do narządów, rozwój organoidów jest dość niejednorodny.
Poza licznymi wyzwaniami biologicznymi6,7, hodowle organoidów stanowią również wyzwanie technologiczne w zakresie metod hodowli komórkowych, charakterystyki transkryptomiki i obrazowania. Rozwój narządów in vivo zachodzi w środowisku biologicznym, które skutkuje wysoce stereotypową samoorganizacją układów komórkowych. Każda zmiana fenotypowa może być wykorzystana jako wskaźnik zastępczy do zdiagnozowania stanu chorobowego. W przeciwieństwie do tego, organoidy rozwijają się in vitro w minimalnie kontrolowanych mikrośrodowiskach zgodnych z warunkami hodowli komórkowej, co skutkuje dużą zmiennością ścieżki rozwoju i kształtowania się każdego pojedynczego organoidu.
Niedawne badanie8 wykazało, że ilościowe obrazowanie kształtu organoidów (deskryptory fenotypu) w połączeniu z oceną kilku markerów genetycznych pozwala na określenie krajobrazów rozwoju fenotypowego. Prawdopodobnie możliwość powiązania różnorodności ekspresji genomowej organoidów z ich zachowaniem fenotypowym jest ważnym krokiem w kierunku uwolnienia pełnego potencjału kultur organotypowych. W związku z tym aż prosi się o opracowanie dedykowanych podejść do obrazowania o wysokiej zawartości, umożliwiających charakterystykę cech organoidów w skalach subkomórkowych, wielokomórkowych i całych organoidów w 3D9,10.
Opracowaliśmy wszechstronną platformę do badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS), która umożliwia usprawnioną hodowlę organoidów (od izolowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych [hESC], ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych [hIPSC], czyli komórek pierwotnych do 3D, wielokomórkowych, zróżnicowanych organoidów) oraz szybkie, nieinwazyjne obrazowanie 3D. Integruje on zminiaturyzowane, 3D urządzenie do hodowli komórek nowej generacji, zwane chipem JeWells (dalej chip), które zawiera tysiące dobrze rozmieszczonych mikrostudzienek otoczonych lustrami 45°, które umożliwiają szybkie obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą jednoobiektywowej mikroskopii arkuszowej11. Kompatybilny z każdym standardowym, komercyjnym mikroskopem odwróconym, system ten umożliwia obrazowanie 300 organoidów w 3D z rozdzielczością subkomórkową w ciągu <1 godziny.
Mikroprodukcja urządzenia do hodowli komórek zaczyna się od istniejącej formy mikrostrukturalnej, która zawiera setki mikropiramid (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) z kwadratową podstawą i ściankami bocznymi pod kątem 45° w stosunku do podstawy. Rysunek 1C pokazuje obrazy takich struktur wykonane za pomocą mikroskopu elektronowego (EM). Sama forma jest wykonana z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) i może być wykonana jako replika odlewu formy pierwotnej (nie pokazanej tutaj) z odpowiednimi cechami (jako wgłębienia) przy użyciu standardowych procedur miękkiej litografii. Pierwotna forma może być wytwarzana różnymi procedurami. Ten użyty w tym protokole został wykonany przy użyciu wytrawiania na mokro krzemu, jak opisano w Galland i wsp.11; Procedura wytwarzania formy pierwotnej nie jest krytyczna dla tego protokołu. Piramidy są ułożone w kwadratowym układzie o tym samym skoku dla kierunków X i Y (w tym przypadku skok wynosi 350 μm).
Jako ilustrację, eksperymenty proof-of-concept12 zostały opublikowane, aby wykazać, że chip umożliwia długoterminową hodowlę (miesiące) i protokoły różnicowania, jednocześnie precyzyjnie określając liczbę początkowych komórek w studzienkach. Indywidualny rozwój dużej liczby organoidów może być automatycznie monitorowany na żywo za pomocą standardowych mikroskopów fluorescencyjnych jasnego pola i arkuszy świetlnych 3D. Ponadto organoidy mogą być pobierane w celu przeprowadzenia dalszych badań biologicznych (np. analizy transkryptomicznej). W artykule przedstawiono szczegółowe protokoły wytwarzania szkiełek nakrywkowych z kultur komórkowych, procedury wysiewu i barwienia w mikroskopii fluorescencyjnej, a także pobierania organoidów.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>AA19397K7</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>AA19392K7</td><td></td></tr><tr><td>BC43 Stacjonarny mikroskop konfokalny</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>z wirującym dyskiem</td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>Buforowany roztwór do trawienia tlenkowego</td><td>Merck</td><td>901621-1L</td><td></td></tr><tr><td>CEE Spin Coater</td><td>Brewer Science</td><td>200X</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Developer AZ400K</td><td>Merck</td><td>18441223164</td><td></td></tr><tr><td>DI Milliq woda Millipore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Marienfled</td><td>117650</td><td>1,5H, okrągłe o średnicy 25 mm</td></tr> Oprogramowanie <tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>BitPlane</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny z odwróconą transmisją</td><td>Nikon</td><td>TSF100-F</td><td></td></tr><tr><td>Labsonic M</td><td>Sartorius Stedium Biotech</td><td></td><td>Homogenizator ultradźwiękowy</td></tr><tr><td>Lipidure</td><td>NOF America</td><td>CM5206</td><td>kopolimer biomimetyczny</td></tr><tr><td>NOA73</td><td>Norland Products</td><td>17-345</td><td>Klej utwardzany promieniami UV</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Thermofisher naukowy&nbsp;</td><td>A12379</td> Roztwór buforowy <td>fosforanu fluoru Alexa</td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Photo Resist AZ5214E</td><td>Merck</td><td>14744719710</td><td></td></tr><tr><td>Pico Narzędzie plazmowe</td><td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td><td>Pico Plasma</td><td>do obróbki plazmowej O2</td></tr><tr><td>RapiClear 1.52</td><td>Sunjin lab</td><td>RC 152001</td><td>rozpuszczalny w wodzie środek czyszczący</td></tr><tr><td>RCT Gorąca płyta/mieszadło</td><td>IKA (MY)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Reaktywne narzędzie do trawienia jonowego</td><td>Samco Inc. (JPN)</td><td>RIE-10NR</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td>pożywka hodowlana do komórek HCT116</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polidimetylosiloksan lub w skrócie PDMS</td></tr><tr><td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>środek powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Thermofisher naukowa</td><td>myjka</td> ultradźwiękowa 15400054 <td></td></tr><tr><td></td><td>Bransonic</td><td>CPX2800</td><td></td></tr><tr><td>UV-KUB 2</td><td>KLOE</td><td></td><td>UV-LED, długość fali 365 nm, 35 mW/cm2 maska UV o gęstości mocy</td></tr><tr><td> wyrównywacz</td><td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td><td>MJB4</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3d organoidów

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Charakterystyka dużej liczby trójwymiarowych (3D) kultur organotypowych (organoidów) w różnych skalach rozdzielczości jest obecnie ograniczona przez standardowe metody obrazowania. Protokół ten opisuje sposób przygotowania mikrofabrykowanych chipów do hodowli organoidów, które umożliwiają wieloskalowe, 3D obrazowanie na żywo na przyjaznym dla użytkownika instrumencie wymagającym minimalnych manipulacji i zdolnym do obrazowania do 300 organoidów/h. Te chipy hodowlane są kompatybilne zarówno z obiektywami powietrznymi, jak i zanurzeniowymi (powietrze, woda, olej i silikon), jak i z szeroką gamą popularnych mikroskopów (np. wirujący dysk, skaner punktowy konfokalny, szerokie pole i jasne pole). Co więcej, mogą być używane z modalnościami arkuszy świetlnych, takimi jak technologia jednoobiektywowej, jednopłaszczyznowej mikroskopii świetlnej (SPIM) (soSPIM). 
Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje etapy przygotowania mikrofabrykowanych chipów hodowlanych oraz hodowli i barwienia organoidów. Wystarczy krótki czas, aby się z nimi zapoznać, a materiały eksploatacyjne i sprzęt można łatwo znaleźć w normalnych laboratoriach biologicznych. W tym przypadku możliwości obrazowania 3D zostaną zademonstrowane tylko przy użyciu standardowych mikroskopów komercyjnych (np. wirującego dysku do rekonstrukcji 3D i mikroskopii szerokokątnej do rutynowego monitorowania).

Rysunek 8F przedstawia typowy wygląd szkiełka nakrywkowego z hodowlą komórkową po udanym procesie wytwarzania. Warstwa kleju utwardzanego promieniami UV wydaje się płaska i dobrze przylega do szkiełka nakrywkowego. Transfer warstwy kleju na szkiełko nakrywkowe może nie udać się, jeśli warstwa na szkiełku zostanie nadmiernie utwardzona lub jeśli usuwanie płaskiego podłoża z PDMS zostanie wykonane nieprawidłowo (jak pokazano na Rysunku 8G,H). W ob...

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nowego typu substratu hodowlanego z setkami mikropojemników namm2, w których organoidy mogą być hodowane i obserwowane za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Szczegółowo opisano również protokoły wysiewu komórek i barwienia immunologicznego.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Protokół ten demonstruje naczynie do hodowli komórkowych z mikroteksturą, zaprojektowane do wzrostu setek organoidów ze znajomością materiału i w pełni kompatybilne z mikroskopią. Nasza technika skutecznie pozwala na wygenerowanie tysięcy organoidów, w pełni kompatybilnych z długoterminowym obrazowaniem i długotrwałą hodowlą komórkową. Protokół ten cieszy się dużym zainteresowaniem w zastosowaniach biomedycznych, takich jak badania przesiewowe leków i badania nad rakiem.Technika przedstawiona w tym protokole jest łatwa do opanowania po kilku próbach przez każdego, kto ma doświadczenie z procedurami laboratoryjnymi i mikroskopią optyczną. Na początek przytnij małe porcje formy PDMS do wymiaru wymaganego dla urządzenia końcowego. Przytnij je równolegle do kierunków XY tablicy.Umieść jedną z przygotowanych kości formy PDMS zakrytą do dołu na płaskiej sekcji PDMS. Następnie za pomocą pipety dodaj około 0,1 do 0,2 mililitra kleju utwardzanego promieniami UV po jednej stronie formy. Śledź postęp cieczy wewnątrz wnęki za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego przy 10-krotnym powiększeniu.Wystaw klej na działanie światła UV, aby go utwardzić. Dostosuj czas naświetlania w zależności od gę

a-high-throughput-platform-for-culture-and-3d-imaging-of-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Cała struktura 3D i zawartość komórkowa organoidów, jak również ich fenotypowe podobieństwo do oryginalnej tkanki, mogą być uchwycone za pomocą opisanego tutaj protokołu obrazowania 3D o rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem.

Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Ten protokół demonstruje metody umożliwiające rozszerzoną hodowlę in vitro ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Jeden etap zwiększa ogólną żywotność wielokomórkowych kultur klastrowych w hydrożelach 3D, poprzez proste usuwanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek. Drugi krok demonstruje najlepsze praktyki dotyczące hodowli PDX w perfuzjowanej platformie mikroprzepływowej.

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.

Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

Szczegółowy protokół jest tutaj przedstawiony w celu opisania modelu organoidowego in vitro z ludzkich komórek nabłonka nosa. Protokół posiada opcje pomiarów wymagających standardowego sprzętu laboratoryjnego, z dodatkowymi możliwościami dla specjalistycznego sprzętu i oprogramowania.

Hodowla i obrazowanie ludzkich organoidów nabłonkowych nosa

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Niniejsze badanie opisuje metodologie hodowli, zamrażania, rozmrażania, przetwarzania, barwienia, etykietowania i badania całych sferoid i organoidów pod różnymi mikroskopami, podczas gdy pozostają one nienaruszone w hydrożelu w wielofunkcyjnym urządzeniu.

Hodowla, zamrażanie, przetwarzanie i obrazowanie całych organoidów i sferoidów jeszcze w hydrożelu

Protokół ten dokumentuje wytwarzanie i montaż SPOT, wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach, w formatach 96- i 384-dołkowych. Szczegółowo opisuje również proces wysiewu dla SPOT, zarówno ręczny, jak i przy użyciu dostępnego na rynku urządzenia do obsługi cieczy.

Powtarzalna produkcja SPOT jako wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach

Przedstawiamy krok po kroku protokół do wysokorozdzielczego, bezznacznikowego i trójwymiarowego obrazowania organoidów przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję obrazowania i obliczeniową analizę obrazu, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki strukturalnej i reakcji leków w żywych organoidach.

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Opisujemy mikroskopię konfokalną i metody śledzenia zastosowane do dwóch strategii reporterowych: mozaikowych organoidali do rozdzielania zachowania i losu poszczególnych komórek oraz organoidali reporterowych typu komórkowego do monitorowania przemian typów komórek w ludzkich i mysich organoidach jelitowych.

Obrazowanie żywych komórek i śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania dynamiki klonalnej i przejść losu w ludzkich i mysich organoidach jelitowych

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Poznaj wysokoprzepustową platformę do hodowli i obrazowania 3D organoidów przy użyciu mikrostrukturyzowanych naczyń do badań nad rakiem i odkrywania leków. Ta metoda umożliwia długoterminowe obserwacje.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Przeglądaj więcej filmów