Name: Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj metodę transdukcji fagowej φBB-1 w Borrelia burgdorferi jako alternatywę dla elektroporacji. Technika ta umożliwia wprowadzanie DNA obcego do krętka boreliozy, wspierając badania nad molekularnymi mechanizmami wywoływania choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor pragnie podziękować Shawnie Reed, D. Scottowi Samuelsowi i Patrickowi Secorowi za ich użyteczną dyskusję oraz Vareeon (Pam) Chonweerawong za ich pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez Wydział Nauk Biomedycznych i granty badawcze dla Christiana H. Eggersa ze Szkoły Nauk o Zdrowiu na Uniwersytecie Quinnipiac.

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Zastosowanie transdukcji może stanowić jedną z metod pokonywania przynajmniej niektórych barier biologicznych i technicznych związanych z elektrotransformacją B. burgdorferi 1,4,13,37. W wielu systemach bakteriofag może przenosić DNA gospodarza (nie-profagowego) między komórkami bakteryjnymi poprzez uogólnioną lub wyspecjalizowaną transdukcję 22,23,24,49,50.<sup...

Rozwój narzędzi do genetycznej manipulacji bakterii krętka Borrelia burgdorferi wniósł niezmierzoną wartość do zrozumienia natury boreliozy1,2,3,4. B. burgdorferi ma niezwykle złożony genom składający się z małego liniowego chromosomu oraz plazmidów liniowych i kolistych5,6. Spontaniczna utrata plazmidu, rearanżacja wewnątrzgenowa (przemieszczanie się genów z jednego plazmidu do drugiego w tym samym organizmie) i horyzontalny transfer genów (HGT, ruch DNA między dwoma organizmami) spowodowały zawrotną ilość heterogeniczności genetycznej wśród B. burgdorferi (na przykład patrz Schutzer et al.7). Powstałe w ten sposób genotypy (lub "szczepy") są członkami tego samego gatunku, ale mają różnice genetyczne, które wpływają na ich zdolność do przenoszenia i infekowania różnych ssaków gospodarzy8,9,10,11. W niniejszym sprawozdaniu termin "szczep" będzie używany w odniesieniu do B. burgdorferi o szczególnym pochodzeniu genetycznym pochodzenia naturalnego; Termin "klon" będzie używany w odniesieniu do szczepu, który został genetycznie zmodyfikowany w określonym celu lub w wyniku manipulacji eksperymentalnej.
Molekularny zestaw narzędzi dostępny do użycia u B. burgdorferi zawiera markery do wyboru, reportery genów, wektory wahadłowe, mutagenezę transpozonów, indukowalne promotory i markery do kontrselekcji (dla przeglądu, zobacz Drektrah and Samuels12). Skuteczne zastosowanie tych metodologii wymaga sztucznego wprowadzenia heterologicznego (obcego) DNA do badanego szczepu B. burgdorferi. U B. burgdorferi wprowadzenie heterologicznego DNA odbywa się prawie wyłącznie za pomocą elektroporacji, metody, która wykorzystuje impuls elektryczny, aby błona bakteryjna stała się przejściowo przepuszczalna dla małych fragmentów DNA wprowadzonych do pożywki1. Większość komórek (szacowana na ≥99,5%) jest zabijana przez impuls, ale pozostałe komórki mają wysoką częstotliwość zachowywania heterologicznego DNA13. Chociaż uważana za jedną z najbardziej efektywnych metod wprowadzania DNA do bakterii, częstotliwość elektroporacji u B. burgdorferi jest bardzo niska (od 1 transformantu na 5 ×10 4 do 5 × 106 komórek)13. Bariery na drodze do osiągnięcia wyższych częstotliwości transformacji wydają się być zarówno techniczne, jak i biologiczne. Bariery techniczne dla udanej elektroporacji B. burgdorferi obejmują zarówno ilość niezbędnego DNA (>10 μg), jak i wymóg, aby krętki znajdowały się w dokładnie prawidłowej fazie wzrostu (mid-log, między 2 × 107 komórek·mL−1 i 7 × 107 komórek·mL−1) podczas przygotowywania komórek elektrokompetentnych12, 13. Te bariery techniczne mogą być jednak łatwiejsze do pokonania niż bariery biologiczne.
Badacze choroby boreliozy uznają, że klony B. burgdorferi można podzielić na dwie szerokie kategorie pod względem ich zdolności do genetycznej manipulacji13,14. Izolaty o wysokiej pasażowości, przystosowane do badań laboratoryjnych są często łatwo przekształcane, ale zwykle tracą plazmidy niezbędne do zakaźności, zachowują się w fizjologicznie nieprawidłowy sposób i nie są w stanie zainfekować żywiciela ssaków ani przetrwać w wektorze kleszcza12,13. Chociaż klony te były przydatne do analizowania biologii molekularnej krętka w laboratorium, mają niewielką wartość dla badania krętka w biologicznym kontekście cyklu enzootycznego. Z drugiej strony, izolaty zakaźne o niskim pasażu zachowują się w sposób fizjologiczny odzwierciedlający stan zakaźny i mogą zakończyć cykl zakaźny, ale zwykle są oporne na wprowadzenie heterologicznego DNA i dlatego trudno nimi manipulować na potrzeby badania12,13. Trudność w przekształcaniu izolatów niskoprzepustowych jest związana z co najmniej dwoma różnymi czynnikami: (i) izolaty niskoprzepustowe często ściśle się ze sobą zlepiają, szczególnie w warunkach dużej gęstości wymaganych do elektroporacji, blokując w ten sposób wiele komórek przed pełnym zastosowaniem ładunku elektrycznego lub dostępem do DNA w pożywce13,15; oraz (ii) B. burgdorferi koduje co najmniej dwa różne systemy modyfikacji restrykcyjno-restrykcyjnej (R-M) przenoszone przez plazmid, które mogą zostać utracone w izolatach wysokoprzepustowych14,16. Systemy R-M ewoluowały, aby umożliwić bakteriom rozpoznawanie i eliminowanie obcego DNA17. Rzeczywiście, kilka badań nad B. burgdorferi wykazało, że wydajność transformacji wzrasta, gdy źródłem DNA jest B. burgdorferi, a nie Escherichia coli13,16. Niestety, uzyskanie od B. burgdorferi wymaganego wysokiego stężenia DNA do elektroporacji jest kosztowną i czasochłonną perspektywą. Innym potencjalnym problemem podczas elektroporacji i wyboru izolatów niskoprzelotowych jest to, że proces ten wydaje się faworyzować transformanty, które utraciły krytyczny plazmid związany ze zjadliwością, lp2514,18,19; tak więc sam akt genetycznej manipulacji izolatami B. burgdorferi o niskim pasażu za pomocą elektroporacji może selekcjonować klony, które nie nadają się do biologicznie istotnej analizy w cyklu enzootycznym20. Biorąc pod uwagę te problemy, system, w którym heterologiczne DNA może być elektrotransformowane w wysokopasażowe klony B. burgdorferi, a następnie przenoszone do niskopasażowych izolatów zakaźnych metodą inną niż elektroporacja, może być mile widzianym dodatkiem do rosnącej kolekcji narzędzi molekularnych dostępnych do stosowania w krętkach boreliozy.
Oprócz transformacji (pobierania nagiego DNA), istnieją dwa inne mechanizmy, dzięki którym bakterie regularnie pobierają heterologiczne DNA: koniugacja, która jest wymianą DNA między bakteriami w bezpośrednim kontakcie fizycznym ze sobą, oraz transdukcja, która jest wymianą DNA za pośrednictwem bakteriofaga21. Rzeczywiście, zdolność bakteriofaga do pośredniczenia w HGT została wykorzystana jako eksperymentalne narzędzie do analizy procesów molekularnych w wielu systemach bakteryjnych22,23,24. B. burgdorferi nie jest naturalnie zdolny do wychwytu nagiego DNA i niewiele jest dowodów na to, że B. burgdorferi koduje aparat niezbędny do pomyślnego sprzężenia. Poprzednie doniesienia opisywały jednak identyfikację i wstępną charakterystykę φBB-1, umiarkowanego bakteriofaga B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 zawiera rodzinę plazmidów o wielkości 30 kb znalezionych w B. burgdorferi25; Członkowie tej rodziny zostali oznaczeni jako CP32S. Zgodnie z rolą φBB-1 w udziale w HGT wśród szczepów B. burgdorferi, Stevenson i in. zgłosili identyczny cp32 znaleziony w dwóch szczepach z innymi różnymi cp32, co sugeruje niedawne dzielenie tego cp32 między tymi dwoma szczepami, prawdopodobnie poprzez transdukcję29. Istnieją również dowody na znaczącą rekombinację poprzez HGT wśród cp32 w skądinąd stosunkowo stabilnym genomie30,31,32,33. Wreszcie, zdolność φBB-1 do transdukcji zarówno cp32, jak i heterologicznego DNA wektora wahadłowego między komórkami tego samego szczepu i między komórkami dwóch różnych szczepów została zademonstrowana wcześniej27,28. Biorąc pod uwagę te odkrycia, φBB-1 został zaproponowany jako kolejne narzędzie, które zostanie opracowane do analizy biologii molekularnej B. burgdorferi.
Celem tego raportu jest szczegółowe opisanie metody indukcji i oczyszczania faga φBB-1 z B. burgdorferi, a także dostarczenie protokołu do przeprowadzenia testu transdukcji między klonami B. burgdorferi oraz selekcji i badania przesiewowego potencjalnych transduktorów.

<table><tbody><tr><td>Jednostki filtracyjne 1 L (PES, 0,22 &micro; m rozmiar porów)</td><td>Rurka Millipore Sigma</td><td>S2GPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm (nasadka dwupozycyjna) (polipropylen)</td><td>USA Scientific</td><td>1450-0810</td><td>mieści 4 ml z małą objętością pustek (do indukcji)</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml (polipropylen)</td><td>USA Scientific</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>1-metylo-3-nitrozo-nitroguanidyna (MNNG)</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>UWAGA: potencjalny czynnik rakotwórczy; nie są już łatwo dostępne, nie testowały oferowanych zastępczych</td></tr><tr><td>pipet Pasteura 5,75 cala (zatyczone bawełniane/szkło borokrzemianowe/niesterylne)</td><td>Autoklaw Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td>przed użyciem</td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe (polipropylen)</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza LE</td><td>Dot Scientific inc.</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>Gibco</td><td>DF0119-17-9</td><td></td></tr><tr><td>Bacto TC Yeastolate</td><td>Gibco</td><td>255772</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (stopień wymiany surowicy)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>700-104P</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (do biologii molekularnej)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>UWAGA: lotne organiczne; Stosować tylko w wyciągu chemicznym</td></tr><tr><td>CMRL-1066 bez L-glutaminy (proszek)</td> <td>US Biological</td><td>C5900-01</td><td>klasa hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Erytromycyna</td><td>Research Products International Corp</td><td>E57000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór odczynnika gentamycyny</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza (dekstroza bezwodna)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS (0,22 &mikro; Rozmiar porów M)</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGSM33SS</td><td>do filtrowania, sterylizacji antybiotyków i innych roztworów o małej objętości</td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25312</td><td>UWAGA: potencjalny czynnik rakotwórczy; stosować tylko w dygestorii chemicznej</td></tr><tr><td>N-acetylo-D-glukozamina</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>100068</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy (startery do PCR)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OmniPrep (zestaw do ekstrakcji całego genomu)</td><td>G Biosciences</td><td>786-136</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (100 mm i razy 15 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca Petroff-Hausser</td><td>Hausser scientific</td><td>HS-3900</td><td></td></tr><tr><td>Szkło pokrywowe komory liczenia Petroff-Hausser</td><td>Hausser scientific</td><td>HS-5051</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 8000 (PEG)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Surowica królicza niesterylna śladowa hemoliza młodych (NRS)</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31119-3</td><td>inaktywacja termiczna zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>Półmikro przezroczyste kuwety UV</td><td>USA Scientific</td><td>9750-9150</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>soduThermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8674-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór siarczanu streptomycyny</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6501-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy dwuwodny</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1804-500G</td><td>cytrynian sodu do BSK</td></tr></tbody></table>

manipulacja genetyczna krętka boreliozy borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Wprowadzenie obcego DNA do krętka Borrelia burgdorferi zostało prawie wyłącznie osiągnięte przez transformację za pomocą elektroporacji. Proces ten ma znacznie niższą skuteczność krętków boreliozy w porównaniu z innymi, lepiej scharakteryzowanymi bakteriami Gram-ujemnymi. Szybkość powodzenia transformacji jest w dużym stopniu zależna od posiadania skoncentrowanych ilości wysokiej jakości DNA z określonych środowisk i podlega znacznej zmienności między szczepami. Alternatywne sposoby wprowadzania obcego DNA (tj. wektorów wahadłowych, reporterów fluorescencyjnych i markerów oporności na antybiotyki) do B. burgdorferi mogą być ważnym dodatkiem do arsenału użytecznych narzędzi do manipulacji genetycznej krętka boreliozy. Bakteriofagi zostały uznane za naturalne mechanizmy przemieszczania się DNA wśród bakterii w procesie zwanym transdukcją. W tym badaniu opracowano metodę wykorzystania wszechobecnego faga rakowego φBB-1 do transdukcji DNA między komórkami B. burgdorferi zarówno o tym samym, jak i różnym pochodzeniu genetycznym. Transdukowane DNA obejmuje zarówno DNA borrelialne, jak i DNA heterologiczne w postaci małych wektorów wahadłowych. Demonstracja ta sugeruje potencjalne zastosowanie transdukcji za pośrednictwem fagów jako uzupełnienia elektroporacji do manipulacji genetycznej krętka boreliozy. W niniejszym raporcie opisano metody indukcji i oczyszczania faga φBB-1 z B. burgdorferi, zastosowanie tego faga w testach transdukcji oraz selekcję i badania przesiewowe potencjalnych transduktorów.

Wykorzystanie bakteriofagów do przenoszenia DNA między łatwiej transformowalnymi szczepami B. burgdorferi a klonami opornymi na elektrotransformację stanowi kolejne narzędzie do dalszych badań molekularnych nad determinantami choroby z Lyme. Opisany w niniejszej pracy test transdukcji może być modyfikowany w zależności od potrzeb, aby ułatwić przenoszenie DNA między dowolnymi interesującymi klonami, z wykorzystaniem jednego lub dwóch antybiotyków do selekcji potencjalnych transduktantów. Wcześniej wykazano tran...

Zdolność bakteriofaga do przenoszenia DNA między komórkami bakteryjnymi czyni je skutecznymi narzędziami do genetycznej manipulacji ich bakteryjnych gospodarzy. Przedstawiono tutaj metodologię indukcji, odzyskiwania i wykorzystania φBB-1, bakteriofaga Borrelia burgdorferi, do transdukcji heterologicznego DNA między różnymi szczepami krętka boreliozy.

Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ opisuje inne ważne narzędzie do analizy biologii molekularnej czynnika boreliozy Borrelia burgdorferi. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu transdukcji fagowej zapewnia alternatywną metodę wprowadzania DNA do Borrelia burgdorferi bez konieczności stosowania impulsu elektrycznego, jak w przypadku elektroporacji. Metoda ta może zostać wykorzystana do uzyskania dalszych informacji na temat mechanizmów molekularnych wykorzystywanych przez Borrelia burgdorferi do utrzymywania się w cyklu enzootycznym i ostatecznie wywoływania boreliozy u ludzi.Na początek zaszczepij 150 mikrolitrów odpowiedniego klonu Borrelia burgdorferi w 15 mililitrach BSK w szczelnie zamkniętych, sterylnych stożkowych probówkach wirówkowych w celu przeprowadzenia protokołu transdukcji. Następnie należy uzupełnić pożywkę antybiotykami o odpowiednim stężeniu lub kombinacją antybiotyków w celu selekcji i utrzymania heterologicznego DNA w klonie Borrelia burgdorferi i inkubować próbkę w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Po wyrośnięciu kultury odwirować odpowiednią objętość kultury o stężeniu 6 000 G przez 10 minut.Po dekantacji supernatantu ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach w świeżym BSK i przenieść próbkę do najmniejszej dostępnej sterylnej probówki, aby pomieścić próbkę przy minimalnej przestrzeni nad głową. Następnie dodaj odpowiednią ilość środka indukującego do zalecanego stężenia w oparciu o objętość kultury wynoszącą cztery mililitry, aby wywołać produkcję fagów, szczelnie zakryj probówkę i dokładnie wymieszaj. Inkubować próbkę w temperaturze 33 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin.Następnie przenieś próbkę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować próbkę o sile 6 000 G przez 10 minut. Po dekantacji supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 15 mililitrach BSK.Przygotować kulturę należy uzupełnić odpowiednim stężeniem antybiotyku opisanym w manuskrypcie, inkubując próbkę w temperaturze 33 stopni Celsjusza przez 72 do 96 godzin. Aby przygotować roztwory do wytrącania PEG, przygotuj 500 mililitrów pięciomolowego chlorku sodu, 500 mililitrów 40% PEG i 100 mililitrów pożywki zawiesinowej zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby wysterylizować, przelej roztwór w autoklawie, ostudź przed użyciem i przechowuj w temperaturze pokojowej lub czterech stopniach Celsjusza.W przypadku wytrącania PEG faga z dawcy klonu Borrelia burgdorferi, po 72 do 96 godzinach inkubacji, odwirować próbki w temperaturze 8 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować supernatant do czystej, stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i wyrzucić osad komórkowy. Dodać pięciomolowy chlorek sodu do końcowego stężenia jednego mola.Po dokładnym wymieszaniu delikatnie kołysz w temperaturze pokojowej przez godzinę. Odwirować próbki w temperaturze 8 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po dekantacji supernatantu do czystej 50-mililitrowej stożkowej probówki, jak pokazano wcześniej, dodaj 40% roztwór PEG-8000 do supernatantu do końcowego stężenia 10%Dobrze wymieszaj i umieść na lodzie na ponad godzinę, do nocy.Odwirować do próbek o stężeniu 8 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jak wykazano powyżej. Wyrzucić supernatant i usunąć jak najwięcej nadmiaru płynu, nie tracąc przy tym osadu, który zawiera cząstki faga. Zawiesić osad w minimalnej objętości zawiesiny, używając pożywki zawiesinowej do przepłukania boku butelki i zebrania wszelkich potencjalnych cząstek fagów.Odzyskaną próbkę faga należy poddać działaniu równej objętości chloroformu w zależności od objętości ponownego zawieszenia. Dobrze wymieszać próbkę i odwirować przy 8 000 G przez 10 minut. Następnie usuń warstwę wodną do czystej probówki, unikając grubych warstw interfejsu.Po określeniu odzyskanej objętości, po pierwszym podaniu działaniu chloroformu, ponownie poddać próbkę działaniu chloroformu w ilości równej 10% tej objętości. Przenieś warstwę wodną do czystej probówki, uważając, aby uniknąć jakichkolwiek warstw interfejsu lub warstw organicznych. Użyj faga natychmiast lub przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po przygotowaniu kultur Borrelia burgdorferi do wykorzystania jako biorca w testach transdukcji, jak wykazano powyżej, odwirować objętość kultury przy stężeniu 6 000 G przez 10 minut. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 14,5 mililitrze świeżego BSK. Dodać mniej niż 500 mikrolitrów próbki faga wytrąconej PEG do kultury klonu biorcy.Po dokładnym wymieszaniu inkubować w temperaturze 33 stopni Celsjusza przez 72 do 96 godzin. Przeprowadzić selekcję transduktorów przez posiew w fazie stałej po zmieszaniu z fagiem wytrąconym przez PEG, jak opisano w manuskrypcie. W zależności od tła klonu biorcy, sprawdź, czy kolonie pojawiają się w agarozie na płytkach selekcyjnych po 10 do 21 dniach inkubacji.Wybierz co najmniej 5 do 10 kolonii, które rosną na płytce w obecności obu antybiotyków, za pomocą wysterylizowanej pipety borokrzemianowej o średnicy 5,75 cala z bawełnianą zatyczką i zaszczep je w 1,5 mililitra BSK odpowiednim antybiotykiem. Amplifikację PCR genów przeprowadzono na 10 klonach kodujących oporność na kanamycynę i gentamycynę. Gen oporności na kanamycynę może być amplifikowany z dawcy c1673 i potencjalnych transduktorów, ale nie biorcy c1706.Podobnie, gen oporności na gentamycynę może być amplifikowany od biorcy c1706 i potencjalnych transduktorów, ale nie od dawcy, co reprezentuje zdarzenia transdukcji. Aby wykazać, że kaseta oporności na kanamycynę została przetransdukowana przez 5BB1 od dawcy do biorcy. Tło transduktantów określono za pomocą markerów specyficznych dla szczepu.Klon c1673 i tło CA-112A kodują specyficzne amplikony cztery, pięć i sześć, podczas gdy c1706, który ma tło B31 o wysokim pasażu, tego nie robi. Podobnie, transduktantom pierwszym i drugim brakowało amplikonów cztery, piątego i szóstego, co pokazuje, że klony mają tło c1706 i nabyły gen oporności na kanamycynę od c1673. W przypadku wytrącania faga za pomocą PEG należy dokładnie wykonać wszystkie kroki, aby zmaksymalizować wydajność faga i dokładnie potraktować zawieszony chloroformem, aby usunąć jak najwięcej zanieczyszczeń PEG i pożywki hodowlanej przed użyciem i przechowywaniem faga.Po pomyślnym przeprowadzeniu testu transdukcji i zweryfikowaniu transduktanta, klony te są dostępne, aby odpowiedzieć na pytania, które wymagają genetycznie zmodyfikowanej Borrelia burgdorferi. Miejmy nadzieję, że rozwój tej techniki pozwoli naukowcom na genetyczne manipulowanie szczepami Borrelia burgdorferi, w przypadku których wprowadzenie DNA za pomocą elektroporacji jest obecnie trudne.

phage-mediated-genetic-manipulation-lyme-disease-spirochete-borrelia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badania nad boreliozą często wymagają uzyskania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co jest procesem trwającym zazwyczaj kilka tygodni. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę zakażania kleszczy metodą mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Przedstawiamy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi wewnątrz kleszczy.

Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z Lyme w jelicie kleszcza

Źródło: Eggers, C. H. Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje przygotowanie genetycznie zmodyfikowanej kultury Borrelia burgdorferi zmodyfikowanej z uśpionym DNA bakteriofaga przenoszącym gen oporności na antybiotyki. Po selekcji i inkubacji antybiotyków induktor chemiczny wyzwala uszkodzenie DNA, prowadząc do wycięcia, replikacji i złożenia nowych wirionów zawierających gen oporności. Po drugim odwirowaniu i...

Przygotowanie i indukcja kultur Borrelia burgdorferi do produkcji cząstek wirusa

Source: Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the isolation of borrelial phage particles from a Borrelia burgdorferi suspension using polyethylene glycol-mediated phase separation. The sample is centrifuged, treated with a salt solution, and a molecular crowding agent to precipitate phages. Chloroform extraction is done to remove debris and concentrate phage particles. The purified phage...

Phage Purification from Borrelia burgdorferi

Borelioza jest najczęściej zgłaszaną chorobą przenoszoną przez wektory w Ameryce Północnej.  Czynnik sprawczy, Borrelia burgdorferi, jest bakterią krętkową przenoszoną przez kleszcze Ixodid.  Przenoszenie i wykrywanie infekcji w modelach zwierzęcych jest optymalizowane przez zastosowanie żywienia kleszczy, które opisujemy tutaj.

Karmienie kleszczy zwierząt w celu przeniesienia i ksenodiagnozy w badaniach nad boreliozą

Zagnieżdżony PCR to czuła, specyficzna i prosta technika, którą można zastosować do ekstraktów DNA kleszczy w celu zbadania Borrelia burgdorferi, czynnika wywołującego boreliozę. Początkowy eksperyment PCR wykorzystuje startery specyficzne dla genu do generowania długich amplikonów, które następnie stają się matrycami do późniejszej reakcji przy użyciu wewnętrznych starterów.

Wykrywanie krętka boreliozy, Borrelia burgdorferi, u kleszczy za pomocą zagnieżdżonego PCR

Testy transkrypcji in vitro mogą rozszyfrować mechanizmy regulacji transkrypcji u Borreliella burgdorferi. Protokół ten opisuje etapy oczyszczania polimerazy RNA B. burgdorferi i przeprowadzania reakcji transkrypcji in vitro. Podejścia eksperymentalne wykorzystujące testy transkrypcji in vitro wymagają niezawodnego oczyszczania i przechowywania aktywnej polimerazy RNA.

Podstawowe składniki testów transkrypcji in vitro Borreliella (Borrelia) burgdorferi

Hodowla in vitro to bezpośrednia metoda wykrywania obecności żywych bakterii. Protokół ten opisuje metody hodowli różnych krętków Borrelia, w tym tych z kompleksu Borrelia burgdorferi sensu lato, gatunków Borrelia z nawracającą gorączką i Borrelia miyamotoi. Gatunki te są wybredne i wolno rosnące, ale można je hodować.

Metody uprawy krętków z kompleksu Borrelia burgdorferi Sensu Lato i nawracającej gorączki Borrelia

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Tutaj przedstawiamy metodę wykorzystania szczepów Δku80 typu I i II Toxoplasma gondii do efektywnego generowania docelowych delecji genów i zamienników genów do funkcjonalnej analizy genomowej.

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

Opisujemy metodologię przeprowadzania analizy genetycznej u Chlamydii w oparciu o mutagenezę chemiczną i sekwencjonowanie całego genomu. Ponadto opisano system wymiany DNA w zakażonych komórkach, który można wykorzystać do mapowania genetycznego. Metoda ta może mieć szerokie zastosowanie w systemach mikrobiologicznych pozbawionych systemów transformacji i narzędzi genetyki molekularnej.

Zaawansowane podejścia genetyczne w Chlamydia trachomatis

Poznaj metodę transdukcji fagowej φBB-1 w Borrelia burgdorferi jako alternatywę dla elektroporacji. Technika ta umożliwia wprowadzanie DNA obcego do krętka boreliozy, wspierając badania nad molekularnymi mechanizmami wywoływania choroby.

Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów

Przeglądaj więcej filmów