Name: Metody uprawy krętków z kompleksu Borrelia burgdorferi Sensu Lato i nawracającej gorączki Borrelia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj metody hodowli in vitro krętków Borrelia burgdorferi i Borrelia miyamotoi. Ten protokół umożliwia wykrywanie żywych infekcji w badaniach klinicznych i mikrobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez Kanadyjską Radę Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych oraz Kanadyjską Fundację Choroby z Lyme (AB i VL), Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (SB, M-LF i IN), PROJEKT TAČR GAMA 2 - "Wsparcie weryfikacji potencjału aplikacji 2.0 w Centrum Biologii CAS" (TP01010022) (MG i NR), oraz przez grant z Ministerstwa Zdrowia Republiki Czeskiej NV19-05-00191 (MG i NR). Dziękujemy S. Vranjesowi (2021, Rudenko lab) za zdjęcie na rysunku 4 i J. Thomasowi-Ebbettowi (2021, Lloyd lab) za zdjęcia na rysunku 5. Dziękujemy wszystkim badaczom, którzy przyczynili się do rozwoju tej dziedziny i przepraszamy tych, których prac nie mogliśmy zacytować ze względu na ograniczenia przestrzenne.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Laboratoryjna hodowla bakterii jest trampoliną do badań. O głębokiej przewadze, jaką daje zdolność do hodowli, świadczy trwająca ponad sto lat walka, która dopiero niedawno zakończyła się sukcesem, z hodowlą Treponema pallidum, krętka, który jest czynnikiem etiologicznym kiły44. Krętki Borrelia są również wyzwaniem dla kultury, ale kultura jest możliwa 23,24,34,44,45,46,47,48,49.</s...

Borrelia to rodzaj bakterii krętkowych, który obejmuje trzy główne klady: grupę boreliozy z Lyme (LB), grupę z nawracającą gorączką (RF) i mniej dobrze scharakteryzowaną grupę, pozornie ograniczoną do. Taksonomia Borrelia zmienia się wraz z pojawieniem się metodologii molekularnych, które umożliwiają porównywanie genomu i proteomu, podobnie jak w przypadku większości innych grup taksonomicznych1,2,3,4,5,6,7. Grupa LB (zwana również grupą z boreliozą) jest tradycyjnie określana jako Borrelia burgdorferi sensu lato od jej najlepiej scharakteryzowanego członka Borrelia burgdorferi sensu stricto. W artykule użyto obecnie najczęściej używanej terminologii: LB, RF i grupy związanej z oraz opisano protokoły hodowli dla grup LB i RF.
Jak można się spodziewać po członku rodziny Spirochaetaceae, Borrelia może przyjąć charakterystycznie długi i cienki spiralny kształt, zwykle o długości 20-30 μm i szerokości 0,2-0,3 μm. Jednak komórki Borrelia są wysoce pleomorficzne i mogą przybierać wiele innych kształtów zarówno w hodowli, jak i in vivo1,8 w wyniku ich złożonej struktury komórkowej i genetycznej. W postaci krętkowej płaska morfologia fali sinusoidalnej wynika z jej osiowej endoflagelli obracającej się w przestrzeni peryplazmatycznej między błoną wewnętrzną i zewnętrzną. Ta struktura sprawia, że komórki są bardzo ruchliwe, a zewnętrzna błona zawiera białka, które umożliwiają komórce interakcję z tkankami gospodarza9,10. Ekspresja białek błony zewnętrznej jest ściśle regulowana i wpływa nie tylko na inwazję tkanek gospodarza, ale także na interakcję z układem odpornościowym gospodarza11. Ta złożona ekspresja genów umożliwia komórkom Borrelia przemieszczanie się między bardzo różnymi środowiskami gospodarzy kręgowców i wektorów bezkręgowców. Genom Borrelia jest niezwykły wśród prokariontów, składa się z chromosomu liniowego, a nie kołowego. Oprócz chromosomu liniowego gatunki Borrelia zawierają 7-21 plazmidów, niektóre liniowe, a niektóre okrągłe. Plazmidy zawierają większość genów wymaganych do adaptacji gospodarza i zjadliwości, a koliste plazmidy pochodzące z profagów są uważane za odpowiedzialne za większość poziomego przepływu genów między komórkami krętka12,13. Zgodnie z rolą w adaptacji gospodarza, niektórzy, być może wielu lub wszyscy, członkowie grupy boreliozy z Lyme tracą plazmidy w culture14. Najlepiej przebadany "przystosowany laboratoryjnie" szczep B. burgdorferi, B31, ma tylko siedem z dziewięciu plazmidów znalezionych w dzikich izolatach tego gatunku15. Podobnie, B. garinii traci plazmidy w culture16. Niektóre badania wykazały, że gatunki RF i B. miyamotoi zachowują plazmidy podczas hodowli14,17, ale ostatnie prace pokazują zmienione plazmidy i zakaźność przy długotrwałej hodowli in vitro18.
Metody oparte na kulturach pozostają złotym standardem w laboratoryjnym wykrywaniu infekcji bakteryjnych, zarówno w badaniach, jak i w pracy klinicznej14,17. Hodowla patogenów z płynów ustrojowych lub tkanek bezpośrednio wykrywa replikujące się patogeny i dostarcza materiału źródłowego do badań14,17. Protokół ten demonstruje metodologię i receptury wymagane do pomyślnego wyhodowania krętków z grupy LB, a także RF Borrelia i B. miyamotoi. Podstawowym podłożem do hodowli krętków Borrelia jest pożywka Barboura-Stoennera-Kelly'ego (BSK-II lub dostępna na rynku BSK-H), z antybiotykami lub bez nich w celu ograniczenia wzrostu zanieczyszczających prokariontów. To medium zostało zaadaptowane z medium pierwotnie używanego do obsługi RF Borrelia19, następnie zmodyfikowane przez Stoenner20, a następnie przez Barbour21. Od tego czasu opracowano wiele modyfikacji, z których każda ma wpływ na fizjologię bakterii, co może wpływać na wzrost, zakaźność i chorobotwórczości22. To podłoże niezawodnie wspiera wzrost krętków w uznanych kulturach i było używane do izolowania krętków od kleszczy, ssaków i próbek klinicznych23. Niedawno opracowana odmiana, zmodyfikowana pożywka Kelly'ego-Pettenkofera (MKP), może zapewnić lepszy sukces izolacji, morfologię i ruchliwość podczas izolowania nowych izolatów Borrelia od próbek środowiskowych, gdy liczba krętków obecnych w próbce dostępnej do wysiewu kultury jest niska23,24. We wszystkich przypadkach sukces uprawy zależy w decydującym stopniu od świeżo przygotowanego podłoża i użycia odpowiednich składników; Nie wszystkie komercyjne składniki dają wysokiej jakości podłoże. Zaszczepione kultury można wygodnie inkubować bez wstrząsania w konwencjonalnym inkubatorze o temperaturze 32-34 °C w obecności niewielkiej ilości resztkowego tlenu w otoczeniu. Krętki Borrelia są beztlenowcami, ale w naturze są narażone na wahania stężeń tlenu i dwutlenku węgla i reagują zmianami w ekspresji genów26,27,28,29. Tak więc ekspresja genów, wzrost i inne badania metaboliczne powinny kontrolować poziom tlenu i dwutlenku węgla za pomocą inkubatora kontrolowanego tlenem lub komory beztlenowej. W hodowli posiewy są sprawdzane co tydzień lub częściej pod kątem obecności krętków za pomocą mikroskopii ciemnego pola lub mikroskopii z kontrastem fazowym. Rozmazy hodowlane mogą być barwione za pomocą barwników srebra, immunohistochemii lub za pomocą fluorescencyjnie znakowanych szczepów29,30. PCR, a następnie sekwencjonowanie DNA to czuła i specyficzna metoda wykrywania i genetycznej identyfikacji lub potwierdzania gatunku Borrelia30,31,32,33.
Istnieje wiele drobnych odmian BSK-II, a niektóre są dostępne na rynku. Protokół opisany tutaj w sekcji 1 został zaadaptowany z Barbour (1984)21. Płynna pożywka MKP jest pożywką powstałą niedawno i jest opisana w punkcie 2. Jest on przygotowywany zgodnie z wcześniej zgłoszonym protokołem33,34, który, podobnie jak podłoże BSK, składa się z dwóch etapów: przygotowania podłoża podstawowego i przygotowania podłoża kompletnego. Pożywkę do hodowli bakterii Borrelia można przygotować z antybiotykami lub bez antybiotyków, jak opisano w punkcie 3; antybiotyki działają w celu zmniejszenia liczby bakterii skażających wprowadzanych podczas inokulacji próbkami klinicznymi lub środowiskowymi, jak opisano w sekcji 4; w przypadku inokulacji czystą kulturą Borrelia sp. antybiotyki mogą nie być potrzebne. Tworzenie długoterminowych zapasów Borrelia jest często ważne, a protokół w tym zakresie opisano w sekcji 5. W sekcji 6 opisano użycie tych pożywek do izolacji czystych klonów Borrelia sensu lato z próbek klinicznych lub środowiskowych. Możliwych jest kilka podejść36; Poniżej znajduje się jeden, który okazał się skuteczny. Pożywka galwaniczna używana w tym protokole jest modyfikacją podłoża do powlekania BSK-II37 i MKP medium34 (z surowicą króliczą zwiększoną do 10%38).

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,7 ml</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>0,2&nbsp; &mikro; m Sterylny filtr strzykawkowy&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Pozycja standardowa - każdy dostawca wykona</td></tr><tr><td>10 &mikro; Barierowa końcówka do pipet L</td><td>Neptun</td><td>BT10XLS3</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca wykona</td></tr><tr><td>pipety serologiczne 10 ml&nbsp;</td><td>Celltreat</td><td>229011B</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>1000 &mikro; Końcówka do pipety barierowej L</td><td>Neptune</td><td>BT1000.96</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca wykona</td></tr><tr><td>probówkę 15 ml</td><td>Celltreat</td><td>188261</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>20 i mikro; Końcówka do pipety barierowej L</td><td>Neptune</td><td>BT20</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>20 ml sterylnej strzykawki&nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>200 &mikro; Końcówka do pipet barierowych L</td><td>Neptune</td><td>BT200</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>25 ml probówek hodowlanych z zakrętką</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-933C</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>pipety serologiczne 25 ml</td><td>Celltreat</td><td>229025B</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>3 ml sterylnej strzykawki</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>35% BSA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-7409</td><td>Źródło jest ważne - patrz uwaga</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml&nbsp;</td><td>Celltreat</td><td>229006B</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca wykona</td></tr><tr><td>tubkę 50 ml</td><td>Celltreat</td><td>229421</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca wykona</td></tr><tr><td>szklane probówki MKP o pojemności 6,5 ml&nbsp;</td><td>Schott</td><td>Schott Nr. 26 135 115</td><td>Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Amikacine</td><td>Sigma</td><td>PHR1654</td><td>Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma</td><td>A9528-100MG</td><td>Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Bactrim / rimethoprim / sulfametoksazol</td><td>Sigma</td><td>PHR1126-1G</td><td>Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>bulion BBL Brucella&nbsp;</td><td>BD</td><td>211088</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Szafka bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Labconco</td><td>302419100</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi (żółta góra - ACD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD&nbsp; Szklane probówki do pobierania krwi Vacutainer z kwaśnym roztworem cytrynianu i dekstrozy (ACD)</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>BSK-H Medium [w 6% surowicy króliczej]&nbsp;</td><td>Darlynn biologs</td><td>BB83-500</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>wirówkę&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>model 5430</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy TrisodiumDihydrate</td><td>Sigma</td><td>C-8532 100 g</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>CMRL</td><td>Gibco BRL</td><td>21540 500 mL</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Gibco</td><td>21-510-018</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Rurki kriogeniczne (Nalgene)</td><td>Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td>Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Deep Petri z pierścieniem do układania w stos 100 mm i razy; 25 mm</td><td>Sigma</td><td>P7741</td><td>Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Cyfrowy inkubator</td><td>VWR</td><td>model 1545</td><td>Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Filtry do sterylizacji filtra</td><td>Milipory 0,22 mu; m Membrana GPExpressPLUS</td><td>SCGPU05RE</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Difco BD</td><td>214340 500 g</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Szklane probówki hodowlane</td><td>Fisher Scientific</td><td>99449-20</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G-7021 1 kg</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca wykona</td></tr><tr><td>Hemafuge (Hematocrit & Wirówka immunohematologiczna )</td><td>Labwissen</td><td>Model 3220</td><td>Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H-3784 100 g</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>N-acetyloglucoseamine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A-3286 25 g</td><td>Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Neopeptone</td><td>Difco&nbsp; BD</td><td>211681 500 g</td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Neubauer Hematocytometer</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Z359629</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca wykona</td></tr><tr><td>mikroskop z kontrastem fazowym&nbsp;</td><td>Standardowy przedmiot Leitz</td><td></td><td>- każdy dostawca wykona</td></tr><tr><td>Phosphomycin</td><td>Sigma</td><td>P5396-1G</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca wykona</td></tr><tr><td>Phosphomycine</td><td>Sigma</td><td>P5396</td><td>Standard pozycja - każdy dostawca wykona</td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra</td><td></td><td>Standardowa pozycja - każdy dostawca wykona</td></tr><tr><td>Precyzyjna waga standardowa</td><td>OHAUS</td><td>model TS200S</td><td>Standardowy przedmiot - dowolny dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy (Na sól)</td><td>Sigma</td><td>P-8574 25 g</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Surowicę królika&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16-120-032</td><td>Źródło jest ważne&nbsp;</td></tr><tr><td>Serum dla królika&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R-4505&nbsp; 100 mL</td><td>Źródło jest ważne&nbsp;</td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Sigma</td><td>R3501-1G</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S-5761&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 500 g</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Sufametaxazol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>PHR1126</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>TC Yeastolate</td><td>Difco&nbsp; BD</td><td>255752 100 g</td><td>Pozycja standardowa - zrobi to każdy dostawca</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>VWR</td><td>470225-044</td><td>Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma</td><td>PHR1056</td><td>Standardowy przedmiot - każdy dostawca to zrobi</td></tr></tbody></table>

metody uprawy krętków z kompleksu borrelia burgdorferi sensu lato i nawracającej gorączki borrelia

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

Borrelia składa się z trzech grup gatunków, tych z grupy boreliozy z Lyme (LB), znanej również jako B. burgdorferi sensu lato (s.l.) i niedawno przeklasyfikowanej na Borreliella, grupy nawrotowej gorączki (RF) Borrelia i trzeciej grupy krętków związanych z. Metody oparte na kulturach pozostają złotym standardem w laboratoryjnym wykrywaniu zakażeń bakteryjnych zarówno w badaniach, jak i pracach klinicznych, ponieważ hodowla patogenów z płynów ustrojowych lub tkanek bezpośrednio wykrywa replikujące się patogeny i dostarcza materiału źródłowego do badań. Krętki Borrelia i Borreliella są wybredne i wolno rosnące, a zatem nie są powszechnie hodowane do celów klinicznych; Jednak kultura jest niezbędna do badań. Protokół ten przedstawia metodologię i receptury wymagane do pomyślnej hodowli krętków LB i RF, w tym wszystkich uznanych gatunków z kompleksu B. burgdorferi s.l., w tym B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis ikrętki RF, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis i B. miyamotoi. Podstawowym podłożem do hodowli krętków LB i RF jest pożywka Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II lub BSK-H), która niezawodnie wspomaga wzrost krętków w ustalonych kulturach. Aby móc hodować nowo wyizolowane izolaty Borrelia z próbek pochodzących od kleszczy lub gospodarza, w których początkowa liczba krętków jest niska w inokulum, preferowane jest zmodyfikowane podłoże Kelly-Pettenkofer (MKP). Pożywka ta wspomaga również wzrost B. miyamotoi. Sukces uprawy krętków RF zależy również w dużym stopniu od jakości składników.

Borrelia pożywki BSK i MKP oraz ich warianty to bogate pożywki hodowlane, których składniki muszą być przygotowywane i sterylizowane sekwencyjnie. Prawidłowo przygotowana pożywka BSK powinna mieć kolor czerwono-pomarańczowy i być klarowna (Rysunek 1). Mętność i wytrącanie osadu, które utrzymują się po ogrzaniu, wskazują na problematyczne składniki, błędy w przygotowaniu pożywki lub kontaminację; taką pożywkę najlepiej zutylizować. Jeśli do BSK oraz MKP dodano żelatynę, pożywka w tem...

Hodowla in vitro to bezpośrednia metoda wykrywania obecności żywych bakterii. Protokół ten opisuje metody hodowli różnych krętków Borrelia, w tym tych z kompleksu Borrelia burgdorferi sensu lato, gatunków Borrelia z nawracającą gorączką i Borrelia miyamotoi. Gatunki te są wybredne i wolno rosnące, ale można je hodować.

Metody uprawy krętków z kompleksu Borrelia burgdorferi Sensu Lato i nawracającej gorączki Borrelia

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently ...

Borrelia to rodzaj bakterii krętkowych, który obejmuje trzy główne rodzaje. Grupa boreliozy z Lyme, grupa nawrotowej gorączki i mniej scharakteryzowana grupa występująca u. Wiele gatunków Borrelia jest chorobotwórczych.Hodowla bakterii jest złotym standardem w wykrywaniu infekcji. Dotyczy to zarówno prac badawczych, jak i klinicznych. Hodowla bakterii z płynów ustrojowych i tkanek potwierdza, że bakterie są zarówno żywotne, jak i replikują się.Protokół ten demonstruje metodologię i receptury wymagane do pomyślnej hodowli i zachowania grupy krętków boreliozy z Lyme, Borrelia nawrotowej gorączki i Borrelia miyamotoi. Podano metody hodowli wcześniej wyizolowanych gatunków i szczepów, a także nowych izolatów i izolatów monoklonalnych ze źródeł środowiskowych lub ssaków. Procedurę zademonstrują Marie-Line Faucillion, doktor habilitowany, Ingela Nilsson, technik z Bergstrom Lab, Anne Berthold, pracownik naukowy z Lloyd Lab oraz Maryna Golovchenko, pracownik naukowy z Rudenko Lab.Na początek zaopatrz się w odczynniki potrzebne do przygotowania jednego litra pożywki Barbara-Stoner-Kelly lub BSK-II. Zacznij od rozpuszczenia BSA w zlewce, mieszając wodę. Następnie dodaj wszystkie suche chemi

cultivation-methods-spirochetes-from-borrelia-burgdorferi-sensu-lato

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badania nad boreliozą często wymagają uzyskania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co jest procesem trwającym zazwyczaj kilka tygodni. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę zakażania kleszczy metodą mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Przedstawiamy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi wewnątrz kleszczy.

Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z Lyme w jelicie kleszcza

Źródło: Eggers, C. H. Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje przygotowanie genetycznie zmodyfikowanej kultury Borrelia burgdorferi zmodyfikowanej z uśpionym DNA bakteriofaga przenoszącym gen oporności na antybiotyki. Po selekcji i inkubacji antybiotyków induktor chemiczny wyzwala uszkodzenie DNA, prowadząc do wycięcia, replikacji i złożenia nowych wirionów zawierających gen oporności. Po drugim odwirowaniu i...

Przygotowanie i indukcja kultur Borrelia burgdorferi do produkcji cząstek wirusa

Source: Berthold, A., et al. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp.(2022)This video demonstrates the cultivation of pathogenic spirochetes from infected skin tissue to model dermal infection. It highlights their localization in the dermis, interaction with the extracellular matrix, and survival during selective culture conditions.

Cultivation of Pathogenic Spirochetes to Investigate Skin Infection

Borelioza jest najczęściej zgłaszaną chorobą przenoszoną przez wektory w Ameryce Północnej.  Czynnik sprawczy, Borrelia burgdorferi, jest bakterią krętkową przenoszoną przez kleszcze Ixodid.  Przenoszenie i wykrywanie infekcji w modelach zwierzęcych jest optymalizowane przez zastosowanie żywienia kleszczy, które opisujemy tutaj.

Karmienie kleszczy zwierząt w celu przeniesienia i ksenodiagnozy w badaniach nad boreliozą

Zagnieżdżony PCR to czuła, specyficzna i prosta technika, którą można zastosować do ekstraktów DNA kleszczy w celu zbadania Borrelia burgdorferi, czynnika wywołującego boreliozę. Początkowy eksperyment PCR wykorzystuje startery specyficzne dla genu do generowania długich amplikonów, które następnie stają się matrycami do późniejszej reakcji przy użyciu wewnętrznych starterów.

Wykrywanie krętka boreliozy, Borrelia burgdorferi, u kleszczy za pomocą zagnieżdżonego PCR

Testy transkrypcji in vitro mogą rozszyfrować mechanizmy regulacji transkrypcji u Borreliella burgdorferi. Protokół ten opisuje etapy oczyszczania polimerazy RNA B. burgdorferi i przeprowadzania reakcji transkrypcji in vitro. Podejścia eksperymentalne wykorzystujące testy transkrypcji in vitro wymagają niezawodnego oczyszczania i przechowywania aktywnej polimerazy RNA.

Podstawowe składniki testów transkrypcji in vitro Borreliella (Borrelia) burgdorferi

Zdolność bakteriofaga do przenoszenia DNA między komórkami bakteryjnymi czyni je skutecznymi narzędziami do genetycznej manipulacji ich bakteryjnych gospodarzy. Przedstawiono tutaj metodologię indukcji, odzyskiwania i wykorzystania φBB-1, bakteriofaga Borrelia burgdorferi, do transdukcji heterologicznego DNA między różnymi szczepami krętka boreliozy.

Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów

Trzykanałowy system analizy przepływu fluorescencji z podwójnym reporterem został wykorzystany do opracowania multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie ocenia próbki surowicy pod kątem IgG i IgM wywołanych przez wiele antygenów różnych gatunków Borrelia, które powodują boreliozę z Lyme w Europie i Ameryce Północnej.

Jednoczesne wykrywanie różnych klas przeciwciał w multipleksowanym teście serologicznym

Ten artykuł przedstawia metodologię wystawiania ludzi na działanie larw Ixodes scapularis do badań klinicznych. Technika jest stosunkowo prosta, tolerowana przez ochotników biorących udział w badaniu i może być modyfikowana w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Takie badania z udziałem ludzi muszą być prowadzone zgodnie z protokołami badań klinicznych zatwierdzonymi przez właściwe organy regulacyjne.

Model eksperymentalnego narażenia ludzi na larwy kleszczy Ixodes scapularis

Opracowaliśmy ludzki system ex vivo transwell zdolny do oceny ostrych zmian zapalnych, zakaźnych i strukturalnych w błonie maziowej.

Model przedkliniczny synowitisu z wykorzystaniem ex vivo ludzkiego tkanki maziowej o zachowanej funkcji i architekturze

Poznaj metody hodowli in vitro krętków Borrelia burgdorferi i Borrelia miyamotoi. Ten protokół umożliwia wykrywanie żywych infekcji w badaniach klinicznych i mikrobiologicznych.

Metody uprawy krętków z kompleksu Borrelia burgdorferi Sensu Lato i nawracającej gorączki Borrelia

Przeglądaj więcej filmów