Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Ten protokół pozwoli badaczom nie tylko usprawnić proces analizy, ale także pozwoli im wydobyć więcej informacji ze strumienia organoidów, co zwiększy znaczenie translacyjne. Główną zaletą tego protokołu jest połączenie uprościonego przepływu pracy z zautomatyzowanym i klinicznie istotnym pipeline'em analitycznym, co pozwala badaczom uzyskać przekonującą ilość informacji z jednego przesiewu organoidów. Technika ta może być stosowana do przewidywania odpowiedzi klinicznej na terapię pacjentów onkologicznych na podstawie tych ex vivo badań przesiewowych organoidów, z bardzo obiecującymi wczesnymi wynikami.

Celem jest uczynienie rozwiązania programistycznego niezależnym od platformy, tak aby naukowcy mogli korzystać z instrumentu obrazowania z żywymi komórkami, który jest dla nich dostępny. Rozpocznij od enzymatycznej dysocjacji organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta, czyli PDTO, w kopułach macierzy zewnątrzkomórkowej, czyli ECM, w mikropłytce sześciodołkowej. Do tego najpierw aspiruj medium i raz przemyj kopuły ECM PBS.

Następnie do dołku dodaj dwa mililitry enzymu dysocjacyjnego. Pipetuj zawartość w górę i w dół 10 razy za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, aby mechanicznie rozdzielić organoidy w kopułach, a następnie inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po wykubowaniu pipetuj zawartość w górę i w dół oraz sprawdź prawidłową dysocjację organoidów do pojedynczych komórek za pomocą mikroskopu.

Zbierz zawiesinę ogniwową w rurce o pojemności 15 mililitrów i zwiększ objętość do 10 mililitrów, dodając ADF + Wiruj rurkę o stężeniu 450 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i zasysaj supernatant za pomocą pipety Pasteura i pompy ssącej. Ponownie zawiesić pellet w 100 do 200 mikrolitrach pełnego pożywki z pożywienia organoidalnego gruczolakoraka przewodu trzustki, czyli PDAC, w zależności od wielkości pelletu, przed liczeniem liczby komórek według wybranej metody. Aby pokryć pojedyncze komórki w kopułach ECM, rozcieńcz odpowiednią ilość zawiesiny ogniwowej, dodając wymaganą ilość rozmrożonego ECM.

Następnie pipetować do 10 kropel po 20 mikrolitrów na odwiert w sześciodołowej płycie podgrzewanej do 37 stopni Celsjusza. Odwróć płytę i wysiabuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie nałóż na doły pełne podłoże uzupełnione 10-mikrotrzonowym Y-27632 i inkubuj przez dwa do trzech dni w inkubatorze.

Aby pozbierać organoidy mające od dwóch do trzech dni, najpierw zasysaj podłoże, a następnie przepłucz organoidy PBS. Następnie należy dodać od jednego do dwóch mililitrów roztworu zbierającego organoidy, wstępnie schłodzonego do czterech stopni Celsjusza, do studni płyty sześciodołowej, w zależności od liczby kopuł ECM. Inkubuj talerz trzymany na lodzie na trzęsącej się platformie przez 10 minut.

Teraz rozłącz kopuły ECM, pipetując zawartość w dołkach w górę i w dół pipetą o średnicy jednego mililitra. Ponownie inkubuj organoidy przez 10 minut na lodzie, zanim wizualnie potwierdzisz dysocjację kopuł ECM pod mikroskopem. Zbierz organoidy w rurce o pojemności 15 mililitrów, wcześniej pokrytej 0,1% BSA w PBS, a objętość uzupełnij do 10 mililitrów, dodając ADF+Wiruj rurkę na 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie aspiruj supernatant i ponownie zawiesij pellet w zależności od jego rozmiaru w maksymalnie jednym mililitrze pełnego pożywka organoidowego PDAC do pożądanego końcowego stężenia organoidu. Otwórz aplikację sterowania robotem pipetującym, wybierz Protokoły i kliknij Import, zanim przeciągniesz i upuścisz dostarczony Plik Uzupełniający 6 do wyznaczonego pola. Wybierz importowany protokół.

A zgodnie z układem pokazanym w polu Deck Setup, umieść całe laboratorium, w tym elementy chłodzące i plastikowe, na tarasach. Użyj lewego szczelina na zbiornik 25-mililitrowy i element chłodzący. Następnie kliknij Uruchom protokół i przejdź do Konfiguracji.

Otwórz zakładkę Setup Labware, kliknij Uruchom Lab Position Check i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby skalibrować robot pipetujący do nowego sprzętu. Napełnij zbiornik 25-mililitrowy, umieszczony na elemencie chłodzącym, schłodzonym roztworem do siewania organoidów i kliknij Start Run, aby uruchomić robot pipetujący. Następnie wiruj mikropłytę z prędkością 100 g przez minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aby stworzyć protokół wydawania leków za pomocą cyfrowego oprogramowania sterującego dystrybutorem, najedź kursorem na tablicę 1 nad układem płyty. Wybierz Edytuj atrybuty płyty i wpisz typ tablicy jako 384, dodatkową objętość jako 50 mikrolitrów, a limit DMSO jako 1%. Dodaj płyny, klikając przycisk dodawania obok Płyny i dwukrotnie kliknij nowo utworzoną płyn, aby ją nazwać. Następnie wybierz klasę jako opartą na DMSO lub wodną plus Tween 20 i wpisz koncentrację.

Aby utworzyć układ płytek do miareczkowania leków, wybierz Wells i kliknij Titracja. Dla płynu wybierz interesujący się lek, wraz z pożądanym najwyższym i najniższym stężeniem. Dla replikacji wybierz minimum dwa i wybierz pożądany wzór miareczkowania.

Aby stworzyć układ płytek dla kontroli dodatniej, wybierz trzy dołki, kliknij na Wartość Ustaw i włącz dwumikromolową staurosporynę z zapasu 10-milimolowego w DMSO, aby wywołać maksymalną śmierć komórek. Dla Cytotox Green wybierz wszystkie używane studnie, kliknij Wartość Ustaw i wprowadź wartość 60 nanomolarów na odwierć. Dla kontroli ujemnej i normalizacji DMSO wybierz wszystkie studnie z dodatkowymi czterema studniami dla kontroli pojazdu.

Teraz kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Normalizację, zanim przypiszesz znormalizowaną klasę płynu jako opartą na DMSO. Następnie normalizujemy do najwyższej objętości klasowej, aby uzyskać równe stężenie DMSO w każdej studni. Następnie kliknij strzałkę pod Uruchom w lewym górnym rogu i wybierz Zawsze Symuluj, a następnie kliknij Symuluj, aby zidentyfikować ewentualne błędy i uzyskać objętości każdego leku do przygotowania.

Teraz odznacz Zawsze symuluj pod przyciskiem Uciekaj, klikając na Uciekaj, aby rozpocząć protokół wydawania leków i postępuj zgodnie z instrukcjami. Załóż membranę uszczelniającą na mikropłytkę, aby zapobiec parowaniu. Otwórz oprogramowanie sterujące obrazowaniem żywych komórek i wybierz Edytor Metody Nowy przed przejściem do Pliku, aby zaimportować przykładowy plik XML metody.

Alternatywnie, postępuj zgodnie z instrukcjami w rękopisie, aby utworzyć nowy plik. Następnie kliknij Start T0.To rozpoczęcie skanowania i skompresuj dane, utworz nowy folder nadrzędny do przeniesienia wszystkich indywidualnych folderów eksperymentów generowanych dla każdego skanu w każdym momencie przez oprogramowanie sterujące żywymi komórkami i nadawaj nazwy odpowiednim folderom, postępując zgodnie z instrukcjami podanymi w rękopisie. Przygotuj mapę płyt XLSX w cyfrowym oprogramowaniu do kontroli leków, klikając prawym przyciskiem myszy na układ mapy płyt z protokołu wydawania leków i kopiując wszystkie dołki, aby wkleić dane do pliku XLSX.

Usuń dane Cytotox Green i staurosporyny, dodaj macierz linii komórkowej i wprowadź kontrolę ujemną i dodatnią. Otwórz narzędzie do kompresji danych. Kliknij Szukaj, wybierz folder nadrzędny i kliknij Kompresja, aby rozpocząć kompresję danych obrazu.

Wszystkie pliki obrazów TIFF są kompresowane do jednego HDF5 dla każdego wlewu w nowym folderze zbiorów danych w folderze rodzicielskim. Aby przeanalizować obrazy, przejdź do platformy aplikacji do analizy obrazów, zaloguj się i kliknij Dodaj nowy projekt w zakładce Dom. Wpisz nazwę projektu, naciśnij Continue i wybierz Dodaj nowy eksperyment przed przesłaniem folderu datasetów zawierających pliki HDF5.

Po przesłaniu przejdź do folderu projekt i eksperyment, aby kliknąć na Upload Plate Map, aby uzyskać dodatkowe funkcje. Następnie kolejno kliknij Wykonaj analizę, wybierz Analizę wieloorganoidalną, Domyślne parametry, a na końcu Analizę, aby rozpocząć analizę obrazu. Kliknij na Pobierz wyniki, aby pobrać surowe tabele danych, które zawierają pomiary dla każdego odwiertu oraz segmentowane obrazy lub filmy przed potwierdzeniem dokładności analizy do dalszego przetwarzania danych.

Aby uwzględnić różnice gęstości i wielkości zasiewów organoidów, zastosowano metryki oparte na tempie wzrostu, aby zmniejszyć różnice między replikacjami, co potwierdzają zmniejszone paski błędu. Obrazy dla kontroli ujemnej, pozytywnej oraz połączonego PDTO leczonego gemcytabiną i paklitakselem wykazały, że terapia w przeważającej mierze wywołała zatrzymanie wzrostu przy ograniczonej ilości śmierci komórek, odpowiadającej wartości odpowiedzi na lek (NDR) tuż poniżej zera. Po użyciu dwóch dodatkowych linii, PDAC_052 i PDAC_087, zaobserwowano wyraźną różnicę w tempie wzrostu między tymi trzema liniami, co wspierało zastosowanie metryk GR.

Krzywe dawka-odpowiedź NDR skutkowały zwiększonym zakresem dynamicznym i rozdzieleniem między trzema różnymi pacjentami w porównaniu do krzywych GR. Ustalenie NDR w czasie wykazało, że PDAC_052 i PDAC_060 miały bardzo podobną odpowiedź cytostatyczną na leki przy niskiej dawce gemcytabiny-paklitakselu, podczas gdy wyraźna różnica cytostatyczna i cytotoksyczna była obserwowana dla odpowiednich dawek średnich i wysokich. Te odpowiedzi lekowe były zgodne z klinicznymi reakcjami obserwowanymi u pacjentów.

Dynamika klonalna wykazała, że PDAC_087 miał najbardziej oporne subklony po leczeniu, co jest zgodne z agresywnym charakterem choroby obserwowanej u pacjenta, który, co ciekawe, był również najmniej wrażliwy na dodatnią kontrolę staurosporyną. Najważniejszym aspektem protokołu jest chłodzenie wszystkich roztworów zawierających ECM podczas zasiewania, ponieważ nieprawidłowe utrwalanie ECM może zakłócać analizę obrazu w dalszej fazie. Automatyzacja pracy w laboratorium mokrym, analizy obrazów oraz dalszego przetwarzania danych może pomóc przyspieszyć badania i łatwiej identyfikować nowe terapie kombinowane.