Wielofotonowa ablacja laserowa cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy
11 listopada 2022
Przedstawiono zoptymalizowany protokół, który umożliwia wyczerpanie cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy podczas metafazy I za pomocą lasera femtosekundowego bliskiej podczerwieni.
Protokół ten oferuje doskonałą strategię selektywnej ablacji cytoplazmatycznych MTOC, które są krytycznymi regulatorami pozycjonowania wrzeciona w oocytach myszy. W ten sposób przyczyniamy się do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych, które regulują mejozę oocytów. Technika ta pozwala na wykonywanie celowanych ablacji w żywych oocytach z dużą dokładnością przestrzenną i przy minimalnym wpływie fototoksycznym na komórkę. Protokół ten może być wykorzystany do wywołania selektywnych zaburzeń mechanicznych u różnych instruktorów bez zmiany żywotności komórek. Protokół ten wymaga umiejętności technicznych, aby usunąć wszystkie cytoplazmatyczne MTOC w jak najkrótszym czasie, aby uniknąć zagrożenia żywotności oocytów. Dlatego niezbędne jest kilkukrotne przećwiczenie tej techniki przed przeprowadzeniem właściwego eksperymentu. Na początek uzupełnij podłoże CZB glutaminą i milrinonem i umieść je w inkubatorze. Przygotuj potrawy z kolekcji i kultury. Przygotować cztery mikrokrople pożywki zbiorczej i dwie mikrokrople pożywki hodowlanej na szalkach Petriego o średnicy 60 i 35 mm. I przykryj je olejem mineralnym. Trzymaj naczynie zbiorcze na szkiełku cieplejszym i inkubuj w temperaturze 37
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia strategię selektywnej ablacji cytoplazmatycznych centrów organizujących mikrotubule (MTOC) w oocytach myszy podczas metafazy I z wykorzystaniem bliskopodczerwonego lasera femtosekundowego. Technika ta pogłębia zrozumienie molekularnych mechanizmów regulujących mejozę oocytów, minimalizując jednocześnie efekty fototoksyczne dla komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozrodu
Wstęp
- Cytoplazmatyczne MTOC są kluczowe dla pozycjonowania wrzeciona w oocytach.
- Zrozumienie ich roli może dostarczyć wiedzy na temat mejozy oocytów.
- Techniki celowanej ablacji mogą pomóc w badaniu mechanizmów komórkowych.
- Kluczowym elementem takich eksperymentów jest zminimalizowanie naruszenia żywotności komórek.
Cel badania
- Opracowanie protokołu selektywnej ablacji cytoplazmatycznych MTOC.
- Zbadanie wpływu usunięcia MTOC na mejozę oocytów.
- Udoskonalenie technik zapewniających wysoką precyzję przestrzenną w eksperymentach na żywych komórkach.
Zastosowane metody
- Femtosekundowy laser w bliskiej podczerwieni do celowanej ablacji.
- Przygotowanie pożywki CZB uzupełnionej o glutaminę i milrinon.
- Zastosowanie naczyń do zbierania i hodowli w celu manipulacji oocytami.
- Warunki inkubacji utrzymane w temperaturze 37°C.
Główne wyniki
- Skuteczna ablacja cytoplazmatycznych MTOC z minimalną fototoksycznością.
- Zachowanie żywotności oocytów po ablacji.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów pozycjonowania wrzeciona.
- Protokół wykazał wysoką dokładność przestrzenną w żywych oocytach.
Wnioski
- Protokół ten skutecznie usuwa cytoplazmatyczne MTOC w oocytach myszy.
- Stanowi on cenne narzędzie do badania mejozy oocytów.
- Dalsze zastosowania mogą obejmować badanie różnych mechanizmów komórkowych.
Najczęściej zadawane pytania
Przemysłowe znaczenie praktyczne
Precyzyjna manipulacja cytoplazmatycznymi centrami organizującymi mikrotubule (MTOC) w oocytach myszy umożliwia ukierunkowaną analizę mechanizmów pozycjonowania wrzeciona, które są krytycznymi determinantami wierności mejozy i kompetencji rozwojowej. Zdolność ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego na najwcześniejszych etapach biologii rozrodu, dostarczając informacji niezbędnych do walidacji celów i zwiększając pewność prognostyczną w badaniach translacyjnych. Integracja selektywnej ablacji laserowej wielofotonowej rozszerza zakres możliwości badawczych, umożliwiając funkcjonalne analizy struktur podkomórkowych bez naruszania żywotności komórek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie badanie roli cytoplazmatycznych MTOC w pozycjonowaniu wrzeciona oraz mejozie oocytów.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolowanie wkładu konkretnych struktur podkomórkowych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla szlaków regulujących segregację chromosomów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system do zaburzania i ilościowego określania dynamiki migracji wrzeciona w żywych oocytach.
- Umożliwia powtarzalną, wysokoprecyzyjną ablację przy minimalnej fototoksyczności, co wspiera standaryzację testów.
- Przygotowuje oocyty do późniejszej analizy ilościowej położenia wrzeciona oraz wyników migracji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami aneuploidii i błędów meiotycznych w oocytach ssaków, istotnymi w kontekście patologii.
- Wspiera przejście od odkryć mechanistycznych do walidacji przedklinicznej regulatorów montażu wrzeciona.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka postęp w badaniach nad celami terapeutycznymi zaangażowanymi w zdrowie reprodukcyjne i biologię rozwoju.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda selektywnej ablacji znajduje zastosowanie na styku wczesnych odkryć i rozwoju modeli przedklinicznych, umożliwiając badanie mechanizmów pozycjonowania wrzeciona w żywych oocytach w oparciu o sformułowane hipotezy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej dotyczącej funkcjonalnej roli cytoplazmatycznych MTOC w migracji wrzeciona.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki dla fenotypów pozycjonowania i migracji wrzeciona.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie dynamiki wrzeciona między oocytami poddanymi ablacji a oocytami kontrolnymi.
- Badania translacyjne: Dostarcza wglądu w mechanizmy istotne dla przedklinicznych modeli błędów segregacji chromosomów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do wielokrotnego wykorzystania w ukierunkowanych zaburzeniach subkomórkowych w systemach żywych komórek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w szlakach montażu wrzecion.
- Wartość operacyjna: standaryzuje ablację żywych komórek z wysoką dokładnością przestrzenną i minimalną utratą żywotności komórek.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dla celów wpływających na wierność mejozy i kompetencję rozwojową.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację celów z zakresu biologii rozrodu z uwzględnieniem ryzyka w celu ich dalszego rozwoju.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy technicznej w zakresie wielofotonowej ablacji laserowej oraz obrazowania żywych komórek.
- Wymaga specjalistycznej aparatury do precyzyjnego celowania i minimalizacji fototoksyczności.
- Wymaga standaryzacji protokołów ablacji i oceny żywotności pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych modeli oocytów lub subkomórkowych celów.
- Praktyka i biegłość są niezbędne, aby nie naruszyć żywotności oocytów podczas ablacji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:12
Mouse Oocyte Collection
2:53
Oocyte Microinjection
4:16
Oocyte Maturation
5:02
Microscope Preparation for Ablation
6:05
Ablation of Metaphase Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers (mcMTOCs)
6:59
Results: Depletion of Metaphase Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes
7:35
Conclusion
