Name: Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Naucz się izolować nabłonek macicy myszy i hodować trójwymiarowe organoidy endometrialne. Ta metoda wykorzystuje trawienie enzymatyczne i mechaniczne do badania odnawiania endometrium oraz chorób takich jak endometrioza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Stephanie Pangas i dr Martinowi M. Matzukowi (M.M.M.) za krytyczną lekturę i redakcję naszego rękopisu. Badania były wspierane przez granty Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) i R01-HD110038 (M.M.M.) oraz NCI-P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Dr Diana Monsivais otrzymała nagrodę Next Gen Pregnancy Award przyznawaną przez Burroughs Wellcome Fund.

Badania eksperymentalne i obchodzenie się z myszami zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Baylor College of Medicine oraz wytycznymi ustanowionymi przez NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Izolacja nabłonka macicy od myszy za pomocą metod enzymatycznych i mechanicznych
UWAGA: Ta sekcja opisuje kroki wymagane do ustanowienia, przejścia, zamrożenia i rozmrożenia organoidów nabłonkowych endometrium od myszy za pomocą rusztowania z matrycą żelową. Wcześniejsze badania wykazały, że optymalne hodowle organoidów endometrialnych myszy są tworzone na podstawie myszy w fazie rui4, co można określić za pomocą badania cytologicznego wymazu z pochwy15. Do wszystkich eksperymentów wykorzystano dorosłe samice myszy WT (6-8 tygodni, hybryda C57BL/6J i 129S5/SvEvBrd). Myszy zostały humanitarnie poddane eutanazji zgodnie z wytycznymi IACUC przy użyciu sedacji izofluranem, a następnie dezartykulacji szyjki macicy. Po uśmierceniu myszy należy postępować zgodnie z następującymi krokami. Szczegółowe informacje na temat materiałów i rozwiązań stosowanych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Przed użyciem pozostaw matrycę żelową do rozmrożenia na lodzie przez około 1-2 godziny.</li>
	<li>Aby wypreparować mysz, użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej na brzuchu i delikatnie oderwij skórę, aby odsłonić leżącą pod spodem warstwę otrzewnej. Użyj kleszczy, aby przytrzymać warstwę otrzewnej i wykonaj boczne nacięcia nożyczkami, aby odsłonić zawartość brzucha.
	<ol>
		<li>Zlokalizuj rogi macicy, delikatnie odsuwając na bok poduszeczki tłuszczowe brzucha. Wypreparuj je, najpierw trzymając je na skrzyżowaniu szyjki macicy i używając nożyczek do przecięcia wzdłuż tłuszczu krezkowego. Po rozbiorze macicy myszy dokładnie usuń tkankę tłuszczową z rogu macicy małymi nożyczkami. 
		UWAGA: Zachowaj sterylność podczas izolacji komórek, sterylizując wszystkie narzędzia chirurgiczne przed użyciem, spryskaj brzuch myszy 70% etanolem i wykonaj wszystkie czynności po sekcji pod sterylnym kapturem do hodowli tkanek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokrój każdy róg macicy na małe fragmenty, z których każdy mierzy około 4-5 mm.</li>
	<li>Umieść wszystkie fragmenty macicy z jednej macicy w jednym dołku 24-dołkowej płytki zawierającej 0,5 ml 1% trypsyny. Pozwól, aby roztwór enzymatyczny dostał się do światła macicy, powodując enzymatyczne oddzielenie nabłonka endometrium od leżącego poniżej zrębu.</li>
	<li>Inkubować 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez około 1 godzinę.</li>
	<li>Po 1 godzinnej inkubacji przenieść fragmenty macicy na 35-milimetrową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą 1 ml buforowanego fosforanem roztworu (DPBS) firmy Dulbecco.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczyków i pipety o pojemności 1 ml, aby mechanicznie oddzielić nabłonek macicy od jajowodu. Przytrzymując kleszczami jeden koniec fragmentu macicy, delikatnie przesuń końcówkę pipety wzdłuż fragmentu, wyciskając nabłonek z drugiego końca jajowodu. Obserwuj oddzielone arkusze nabłonka od fragmentu macicy pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml zebrać i delikatnie przenieść arkusze nabłonka do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Powtórz ten proces dla pozostałych fragmentów macicy, przenosząc wszystkie arkusze nabłonka do tej samej probówki zbiorczej.</li>
	<li>Zdysocjowane arkusze nabłonka osadzać przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 375 × g.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant, aby uniknąć naruszenia osadu komórkowego.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml roztworu kolagenazy o stężeniu 2,5 mg/ml + 2 mg/ml roztworu DNazy. Pipetować w górę i w dół około 10 razy lub do uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml DMEM/F12 + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + antybiotyki i odwirowywać komórki przez 5 minut w temperaturze 375 × g. 
	UWAGA: Dodatkowe informacje na temat antybiotyku o szerokim spektrum działania stosowanego w hodowli komórkowej znajdują się w Tabeli materiałów.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml DMEM/F12 + 10% FBS + antybiotyki. Odwirowywać komórki przez 5 minut w temperaturze 375 × g.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie przedziału zrębu
UWAGA: Ta sekcja przedstawia protokoły niezbędne do izolacji zrębu endometrium myszy. Biorąc pod uwagę rosnące zainteresowanie eksperymentami z kokulturą nabłonkową/zrębową, ważne jest, aby móc przetwarzać populacje komórek zrębu oprócz komórek nabłonkowych, które będą generować organoidy.
<ol>
	<li>Gdy cały nabłonek zostanie enzymatycznie i mechanicznie oddzielony od fragmentów macicy, pozostałe struktury przypominające rurki są przedziałami "zrębu/mięśniówki". Zebrać tę tkankę w 2,5 mg/ml kolagenazy + 2 mg/ml DNazy w roztworze HBSS.</li>
	<li>Inkubować próbkę zrębu/mięśniówki macicy w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 500 μl DMEM/F12 + 10% FBS + antybiotyki na mysz i przefiltrować niezdysocjowane fragmenty przez filtr komórkowy 40 μm.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 375 × g.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml DMEM/F12 + 10% FBS + antybiotyki. Dodawać mieszaninę kroplami do 10 ml DMEM/F12 + 10% FBS + antybiotyków na 10 cm płytce do hodowli komórkowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Aby wygenerować kohodowle komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy, postępuj zgodnie z metodami opisanymi dla ludzkich organoidów endometrium przy użyciu systemów macierzy kolagenowych bez rusztowań lub kolagenowych6,8. 
	UWAGA: Chociaż techniki te nie zostały jeszcze opublikowane dla myszy, można je dostosować w oparciu o opublikowane protokoły z ludzkim endometrium.</li>
</ol>
3. Enkapsulacja nabłonka macicy w matrycy żelowej w celu utworzenia organoidów
UWAGA: Trzymaj matrycę żelową na lodzie, dopóki nie będzie gotowa do użycia.
<ol>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w objętości matrycy żelowej 20 razy większej niż objętość osadu komórkowego (tj. jeśli osad komórkowy ma 20 μl, ponownie zawiesić komórki za pomocą 400 μl matrycy żelowej). Ostrożnie zawieś granulkę, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków.</li>
	<li>Pozostawić zawiesinę żelu/komórek do osiądnięcia w temperaturze pokojowej przez ~10 min.</li>
	<li>Gdy zawiesina matrycy/komórek żelu stanie się żelem półstałym, użyj mikropipety P200 z końcówką o szerokim otworze 200 μl, aby delikatnie zassać 25 μl zawiesiny matrycy/komórek żelu. Dozować trzy oddzielne kopuły o pojemności 25 μl na dołek 12-dołkowej płytki i pozostawić matrycę żelową do utwardzenia przez 15 minut w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po utwardzeniu matrycy żelowej dodać 750 μl pożywki organoidowej do każdej studzienki zawierającej kopułki z matrycy żelowej. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych. 
	UWAGA: Skład podłoża organoidowego jest wymieniony w Tabeli materiałów. Organoidy zwykle tworzą się w ciągu 4 dni od początkowej hodowli.</li>
</ol>
4. Analiza ekspresji genów w organoidach endometrium po leczeniu estradiolem
UWAGA: Ta sekcja opisuje metody używane do profilowania ekspresji genów organoidów nabłonka endometrium za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym po leczeniu estradiolem (E2; patrz Tabela 1). Ponieważ endometrium znajduje się pod cykliczną kontrolą hormonu jajnikowego E2, badanie reakcji organoidów na E2 jest ważną miarą funkcji fizjologicznych. Uzyskaliśmy wysokiej jakości RNA i wygenerowaliśmy wystarczającą ilość mRNA do profilowania ekspresji genów za pomocą qPCR i/lub sekwencjonowania RNA z naszych organoidów nabłonka endometrium. W tej sekcji opisano, jak zbierać organoidy i przetwarzać je w celu dalszej analizy ekspresji genów. Wybrana pożywka zabiegowa odzwierciedla pożywkę stosowaną w leczeniu hodowanych komórek endometrium. Należy jednak zauważyć, że to podłoże zabiegowe można odpowiednio zoptymalizować, tak jak w przypadku leczenia ludzkich kultur endometrium 3D za pomocą hormonów8,16,17.
<ol>
	<li>Hoduj organoidy endometrialne, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Usuń pożywkę organoidową i zastąp ją 750 μl pożywki głodowej cztery dni po wysianiu. Inkubować przez noc.</li>
	<li>Następnego ranka usuń pożywkę głodową. Dodać 750 μl pożywki zawierającej podłoże lub 10 nM E2. Inkubować przez 48 godzin.</li>
	<li>Kontynuuj izolację RNA zgodnie z protokołem producenta zestawu.</li>
</ol>
5. Analiza histologiczna organoidów endometrialnych
UWAGA: Obrazowanie cech morfologicznych organoidów endometrium jest kluczowe dla oceny efektu komórkowego czynników wzrostu, manipulacji genetycznych lub inhibitorów małych cząsteczek. W tej sekcji opisano techniki stosowane do utrwalania, przetwarzania i obrazowania organoidów nabłonka endometrium za pomocą barwienia histologicznego i barwienia immunofluorescencyjnego przeciwciał.
<ol>
	<li>Przygotować 1,5 ml probówek wirówkowych zawierających 1 ml 4% paraformaldehydu w 1x PBS. Umieść je na lodzie.</li>
	<li>Odessać pożywkę z dołków 12-dołkowej płytki zawierającej organoidy.</li>
	<li>Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml z odciętą końcówką przenieś 500 μl 4% paraformaldehydu do każdego dołka i delikatnie odłącz kopułki matrycy żelowej od dna płytki.</li>
	<li>Delikatnie zassać całe kopułki z matrycą żelową do końcówki pipety i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Utrwalić organoidy, umieszczając je na rotatorze w temperaturze 4 °C na noc.</li>
	<li>Następnego ranka odwirować probówkę o stężeniu 600 × g przez 5 minut, aby otopić organoidy. Delikatnie usunąć 4% roztwór paraformaldehydu za pomocą pipety i wyrzucić. Umyj organoidy 2x 70% etanolem.</li>
	<li>Po ostatnim praniu usuń z probówki wszystko, z wyjątkiem 50-100 μl. Odłóż rurkę na bok.</li>
	<li>Umieść tubkę żelu do przetwarzania próbek w łaźni wodnej i kuchence mikrofalowej na ~30 s, aby stopić żel. Upewnij się, że żel do przetwarzania próbki nie wykipi, monitorując konsystencję żelu. 
	UWAGA: Gdy żel do przetwarzania próbek zostanie stopiony, ale nie wrzący gorący, pracuj szybko, aby zamknąć organoidy.</li>
	<li>Przenieść wystarczającą ilość żelu do obróbki próbki, aby pokryć całą powierzchnię formy (około 250 μl).</li>
	<li>Podczas gdy żel do przetwarzania próbek jest nadal stopiony, szybko przenieś 50 μl 70% roztworu etanolu zawierającego organoidy. Upewnij się, że organoidy są zatopione lub wepchnięte do dolnej części formy.</li>
	<li>Umieść formę histologiczną na wiadrze z lodem i pozwól, aby żel do przetwarzania próbki ostygł i zestalił się.</li>
	<li>Gdy żel do przetwarzania próbek całkowicie wyschnie, ostrożnie przenieś żel do przetwarzania próbek w kwadracie do worka na próbki, śledząc płaszczyznę, w której znajdują się organoidy.</li>
	<li>Umieść worek w kasecie histologicznej i poddaj go procesowi przy użyciu standardowych metod stosowanych do utrwalania formaliny i zatapiania parafiny w tkankach18.</li>
	<li>Po utrwaleniu i zatopieniu w parafinie, podziel na skrawki o wielkości 5 μm za pomocą mikrotomu19. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) lub barwieniem immunologicznym, jak opisano poniżej.</li>
</ol>
6. Barwienie hematoksyliną i eozyną
<ol>
	<li>Odparafinować skrawki w następujący sposób: ksylen, 2 x 10 min; 100% etanol, 2 x 3 min; 80% etanol, 3 min; 60% etanolu, 3 min; dH2O, 2 x 3 min; 1 min w hematoksylinie; woda z kranu (3 x 5 s); 1 min w eozynie.</li>
	<li>Odwodnić sekcje w następujący sposób: 60% etanol, 3 min; 80% etanolu, 3 min; 95% etanolu, 3 min; 100% etanolu, 2 x 3 min; ksylen, 2 x 15 min.</li>
	<li>Zamontuj za pomocą medium montażowego.</li>
</ol>
7. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Odparafinować skrawki zgodnie z opisem w kroku 6.1.</li>
	<li>Wykonaj pobieranie antygenu
	<ol>
		<li>Zanurz szkiełka w roztworze do pobierania antygenu w pojemniku nadającym się do kuchenki mikrofalowej.</li>
		<li>Kuchenkę mikrofalową na dużym ogniu przez 20 minut, w odstępach 5-minutowych, aby upewnić się, że roztwór nie wykipi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu 20-minutowego etapu pobierania antygenu pozwól szkiełkom ostygnąć na lodzie przez 40 minut, nadal zanurzając je w buforze do pobierania antygenu.</li>
	<li>Myj szkiełka 1x TBST przez 3 minuty</li>
	<li>Zablokować szkiełka poprzez inkubację w 3% BSA w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało w 3% BSA w TBST (1:50-1:1,000, w zależności od Ab).</li>
		<li>Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.</li>
		<li>Myć 3 x 5 min z TBST.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał wtórnych
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało w 3% BSA (w TBST) (1:250) lub w 5% normalnej surowicy osła.</li>
		<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności, ponieważ przeciwciało jest sprzężone z fluoroforem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie jądrowe
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) w stosunku 1:1,000 w TBST.</li>
		<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Myć 2 x 5 min z TBST.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montażu
	<ol>
		<li>Użyj jednej kropli podłoża montażowego, aby zamontować szkiełko nakrywkowe.</li>
		<li>Następnego dnia uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym miejscu opisujemy metody generowania organoidów nabłonka endometrium z endometrium myszy oraz protokoły rutynowo stosowane do ich dalszej analizy. Organoidy endometrium są potężnym narzędziem do badania mechanizmów kontrolujących choroby związane z endometrium, takie jak endometrioza, rak endometrium i niepowodzenie implantacji. Przełomowe badania opublikowane w 2017 r. opisały warunki do hodowli długoterminowych i odnawialnych kultur organoidów endometrialnych z nabłonka 4,5<sup ...

Endometrium - wewnętrzna błona śluzowa jamy macicy - jest unikalną i wysoce dynamiczną tkanką, która odgrywa kluczową rolę w zdrowiu reprodukcyjnym kobiety. W okresie rozrodczym błona śluzowa macicy może przejść setki cykli proliferacji, różnicowania i rozpadu, koordynowanych przez skoordynowane działanie hormonów jajnikowych - estrogenu i progesteronu. Badania na genetycznie modyfikowanych myszach ujawniły podstawowe mechanizmy biologiczne leżące u podstaw odpowiedzi endometrium na hormony i kontrolę implantacji zarodka, decydualizację komórek zrębu i ciążę1. Badania in vitro były jednak ograniczone ze względu na trudności w utrzymaniu nieprzekształconych pierwotnych tkanek endometrium myszy w tradycyjnych hodowlach komórkowych 2D2,3. Ostatnie postępy w hodowli tkanek endometrium jako trójwymiarowych układów narządów lub organoidów stanowią nową okazję do zbadania szlaków biologicznych kontrolujących regenerację i różnicowanie komórek endometrium. Mysie i ludzkie systemy organoidów endometrium zostały opracowane z czystego nabłonka endometrium zamkniętego w różnych matrycach4,5, podczas gdy ludzka endometrium została wyhodowana jako kokultura nabłonkowa/zrębowa bez rusztowań6,7, a ostatnio jako asembloidy nabłonkowe/zrębowe otoczone kolagenem8. Potencjał wzrostu i regeneracji nabłonkowych kultur organoidów jest wspierany przez zdefiniowany koktajl czynników wzrostu i inhibitorów małych cząsteczek, które zostały empirycznie określone w celu maksymalizacji wzrostu i regeneracji organoidów4,5,9. Co więcej, zdolność do zamrażania i rozmrażania organoidów endometrialnych pozwala na długoterminowe przechowywanie organoidów endometrialnych od myszy i ludzi do przyszłych badań.
Genetycznie modyfikowane myszy odkryły skomplikowane szlaki sygnałowe, które kontrolują wczesną ciążę i decydualizację, i były używane jako modele utraty ciąży, raka endometrium i endometriozy. Te badania genetyczne zostały w dużej mierze osiągnięte dzięki specyficznej dla komórki delecji alleli flankowanych loxP ("floxed") przy użyciu rekombinaz cre, które są specyficznie aktywne w żeńskich tkankach rozrodczych. Te modele myszy obejmują szeroko stosowany receptor progesteronu-cre10, który ma silną aktywność rekombinazy w tkankach nabłonka endometrium i zrębu, laktoferynę i-cre, która indukuje rekombinację nabłonka endometrium u dorosłych myszy11, lub Wnt7a-cre, która wyzwala specyficzną dla nabłonka delecję w tkankach pochodzących z Müllera12. Hodowla tkanek endometrium z genetycznie modyfikowanych modeli myszy jako organoidów 3D stworzyła doskonałą okazję do zbadania biologii endometrium i ułatwienia identyfikacji czynników wzrostu i szlaków sygnałowych, które kontrolują odnowę i różnicowanie komórek endometrium13,14. Metody izolacji i hodowli tkanki endometrium myszy są opisane w literaturze i opisują zastosowanie różnych strategii enzymatycznych do izolacji nabłonka macicy w celu późniejszego wyhodowania organoidów nabłonka endometrium4. Podczas gdy poprzednia literatura zapewnia krytyczne ramy dla protokołów hodowli organoidów nabłonka endometrium4,5,6, ten artykuł zapewnia jasną, kompleksową metodę generowania, utrzymywania, przetwarzania i analizowania tych organoidów. Standaryzacja tych technik jest ważna dla przyspieszenia postępu w dziedzinie biologii rozrodu kobiet. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodologię enzymatycznego i mechanicznego oczyszczania tkanki nabłonka endometrium myszy w celu późniejszej hodowli organoidów endometrialnych w rusztowaniu z matrycą żelową. Opisano również metodologie dalszych analiz histologicznych i molekularnych organoidów nabłonka endometrium myszy w żelowej matrycy.

<table><tbody><tr><td>Organoid Formulacja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej, *bez LDEV</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>100%</td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426-1G</td><td>1%</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td>1X</td></tr><tr><td>N2 suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B-27&handel; Suplement (50X), bez witaminy A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>inhibitor ALK-4, -5, -7, A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng / ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng / ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki Rspondin-1</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td>500 ng / ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng / ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>50 ng / ml</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>R& Systemy D</td><td>5036-WN</td><td>200 ng/ml</td></tr><tr><td><silny>Inne materiały eksploatacyjne i odczynniki</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny</td><td>><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny>Stężenie końcowe</silny></td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td>5 mg/ ml</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>1X</td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>ThermoFisher</td><td>14170112</td><td>1X</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Mikropłytki polistyrenowe (24-dołkowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Mikropłytki polistyrenowe (12-dołkowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#0877229</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do komórek Falcon, 40 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep Bezpośredni zol RNA (50 &mikro; g)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>11-331</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, węglowa pozbawiona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td>2%</td></tr><tr><td>Estratiol (E2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1024-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Formaldehyd 16% w roztworze wodnym roztwór, klasa EM</td><td>VWR</td><td>15710</td><td>4%</td></tr> <tr><td>Kaseta Epredia 1 Kasety szczelinowe na tkanki</td><td>Fisher Scientific</td><td>1000961</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Formy bazowe ze stali nierdzewnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-010-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 proof (100%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-277-97</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowe worki do biopsji Epredia</td><td>Fisher Scientific</td><td>6774010</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel Żel do przetwarzania próbek</td><td>VWR</td><td>83009-992</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny Premium</td><td>VWR</td><td>95057-844</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór eozyny Y (żółtawy) Premium</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>TBS Bufor 20X, pH 7,4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8054</td><td>1X</td></tr><tr><td>TBST (10X), pH 7,4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8056</td><td>1X</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>3%</td></tr> <tr><td>roztwór DAPI (1 mg / ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>1:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier do paznokci</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037246</td><td></td></tr><tr><td>Mikro okulary nakrywkowe VWR</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4364346</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Krt8 (TROMA-I)&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I&nbsp;</td><td>Rozcieńczenie 1:50</td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td>wimentyny Antobody</td><td>5741S</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-szczurze IgG (H + L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne , Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21209</td><td>1:250 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Osioł anty-Rabbin IgG (H + L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne , Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21206</td><td>1:250 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 508 Stereo Mikroskop</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 Odwrócony mikroskop rutynowy z kamerą cyfrową</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>silny>sekwencja starterów</silny></td><td><silny>naprzód (5'-3')</silny></td><td><silny>odwrócony (5'-3')</td><td>_</td></tr><tr><td>Lipokalina 2 (Lcn2)</td><td>GCAGGGTGGTACGTTGTGGG</td><td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td><td></td></tr><tr><td>Laktoferyna (Ltf)</td><td>TGAGGCCCTTGGACTCTGT</td><td>ACCCACTTTTCTCATCTCTCTTC</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron (Pgr)</td><td>CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC</td><td>TAACTTCAGACATCATTTCCGG</td><td></td></tr><tr><td>Dehydrogenaza fosforanowa 3 aldehydu glicerynowego (Gapdh)</td><td>CAATGTGTCCGTCGTGGATCT</td><td>GCCTGCTTCACCACCACCTTCTT</td><td></td></tr></tbody></table>

ustalanie organoidów endometrialnych 3d z macicy myszy

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Tkanka endometrium pokrywa wewnętrzną jamę macicy i jest pod cykliczną kontrolą estrogenu i progesteronu. Jest to tkanka składająca się z nabłonka świetlnego i gruczołowego, przedziału zrębu, sieci naczyniowej i złożonej populacji komórek odpornościowych. Modele mysie są potężnym narzędziem do badania endometrium, ujawniając krytyczne mechanizmy kontrolujące implantację, łożysko i raka. Niedawny rozwój 3D hodowli organoidów endometrialnych przedstawia najnowocześniejszy model do analizy szlaków sygnałowych, które leżą u podstaw biologii endometrium. Ustalanie organoidów endometrialnych na podstawie genetycznie modyfikowanych modeli myszy, analiza ich transkryptomów i wizualizacja ich morfologii w rozdzielczości pojedynczej komórki są kluczowymi narzędziami do badania chorób endometrium. W artykule przedstawiono metody tworzenia kultur 3D nabłonka endometrium od myszy i opisano techniki ilościowego określania ekspresji genów i analizy histologii organoidów. Celem jest zapewnienie zasobów, które można wykorzystać do ustanowienia, hodowli i badania ekspresji genów i cech morfologicznych organoidów nabłonka endometrium.

Kontrast fazowy obrazów organoidów endometrialnych myszy 
Ustaliliśmy organoidy z nabłonka endometrium myszy WT, zgodnie z opisem w załączonym protokole (patrz diagram w <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Po enzymatycznej dysocjacji nabłonka endometrium myszy, arkusze nabłonka zostały mechanicznie oddzielone od komórek zrębu macicy i następnie zdysocjowane za pomocą kolagenazy w celu wytworzenia zawiesiny jednokomórkowej. Jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo, ta metoda separacji komórek nabłonka i zr...

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia organoidów nabłonka endometrium myszy do ekspresji genów i analiz histologicznych.

Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pokazuje krok po kroku metodologię izolowania wysoce czystego nabłonka macicy z macicy myszy w celu hodowli organoidów endometrialnych. Metoda ta skutecznie wykorzystuje dysocjację enzymatyczną i mechaniczną do izolacji nabłonka macicy. Techniki zostały usprawnione w celu ustalenia, leczenia i analizy organoidów nabłonka endometrium pochodzących z izolowanego nabłonka.Rozpocznij od rozmrożenia matrycy żelowej na lodzie przez około jedną do dwóch godzin przed użyciem. Następnie przeprowadź sekcję uświęconej myszy, wykonując nacięcie w linii środkowej brzucha za pomocą nożyczek i delikatnie odrywając skórę, aby odsłonić leżącą poniżej warstwę otrzewnej. Zlokalizuj rogi macicy, delikatnie przesuwając poduszeczki tłuszczowe brzucha na bok i przytrzymaj rogi macicy na skrzyżowaniu szyjki macicy przed przecięciem ich wzdłuż tłuszczu krezkowego.Po wycięciu macicy myszy dokładnie usuń tkankę tłuszczową z rogu macicy małymi nożyczkami. Po zakończeniu pokrój każdy róg macicy na małe fragmenty, z których każdy mierzy około czterech do pięciu milimetrów. Umieść wszystkie fragmenty macicy z jednej macicy w jednym dołku 24-dołkowej płytki zawierającej 0,5 mililitra 1% trypsyny.Następnie inkubować 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych nawilżanych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około godzinę w celu enzymatycznego oddzielenia nabłonka endometrium od leżącego poniżej zrębu. Po inkubacji przenieś fragmenty macicy na 35-milimetrową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą jeden mililitr buforowanego fosforanem roztworu Dulbecco lub DPBS. Następnie oddziel nabłonek macicy od jajowodu macicy pod mikroskopem preparacyjnym, przytrzymując jeden koniec fragmentu macicy kleszczami i delikatnie przesuwając końcówkę pipety wzdłużnie po fragmencie, wyciskając nabłonek z drugiego końca jajowodu.Następnie obserwuj oddzielone arkusze nabłonka od fragmentu macicy pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie delikatnie przenieś wszystkie arkusze nabłonka do tej samej 1,5-mililitrowej rurki za pomocą jednomililitrowej pipety. I granulować zdysocjowane arkusze nabłonka przez odwirowanie przy 375 x g przez pięć minut.Ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 mililitra 2,5 miligrama na mililitr kolagenazy plus dwa miligramy na mililitr roztworu DNA. Pipetować w górę i w dół około 10 razy lub do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Następnie dodaj 0,5 mililitra DMEM F/12 plus 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS plus antybiotyki i odwiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 375 x g.Usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze DMEM/F12 plus 10% FBS plus antybiotyki i odwirować komórki. Umieść matrycę żelową na lodzie, aż będzie gotowa. Następnie usunąć supernatant z komór wirówki i ponownie zawiesić osad komórkowy, używając 20-krotności objętości matrycy żelowej bez wprowadzania pęcherzyków.Pozostawić zawiesinę komórek z matrycą żelową do osiadania w temperaturze pokojowej przez około 10 minut. Gdy zawiesina komórek z matrycą żelową stanie się żelem półstałym, użyj mikropipety P200 z końcówką o szerokim otworze 200 mikrolitrów i delikatnie zassaj 25 mikrolitrów zawiesiny komórek z matrycą żelową. Dozować trzy oddzielne kopułki o pojemności 25 mikrolitrów na dołek 12-dołkowej płytki i pozostawić matrycę żelową do utwardzenia przez 15 minut i umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych nawilżonych o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po utwardzeniu matrycy żelowej dodać 750 mikrolitrów pożywki organoidowej do każdej studzienki zawierającej kopułę z matrycą żelową i inkubator w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych. Obrazy z kontrastem fazowym organoidów endometrialnych myszy wykazały, że separacja komórek nabłonka i zrębu dała próbki z nie więcej niż 10% do 15% zanieczyszczeniem przeciwnego typu komórek. Komórki nabłonka endometrium zostały złożone w organoidy w ciągu trzech do czterech dni.Pokrojone organoidy endometrialne zatopione w parafinie w formalinie uwidoczniono za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną, które uwidoczniły pojedynczą warstwę nabłonka i puste środki, światła organoidów. Obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym wykazało, że wszystkie komórki w organoidach były 8-dodatnie pod względem cytokeratyny i zawierały DAPI, co wskazuje, że utrwalanie, osadzanie i przetwarzanie organoidów endometrium jest zgodne z barwieniem immunologicznym opartym na przeciwciałach. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym wykazał, że stymulacja 10 nanomolowym estradiolem zwiększyła ekspresję lipokaliny 2, laktoferyny i receptora progesteronu w organoidach nabłonkowych, co wskazuje, że organoidy nabłonka endometrium mogą być z powodzeniem stosowane do pomiaru zmian ekspresji genów w odpowiedzi na estradiol.Ważne jest, aby upewnić się, że podczas etapu dysocjacji mechanicznej uzyskuje się wyraźne oddzielenie nabłonka endometrium. Powinno być w stanie zaobserwować nabłonek wyłaniający się z jajowodu. Inne metody obejmują tworzenie organoidów nabłonkowych poprzez enkapsulację w matrycy żelowej.W razie potrzeby przedział zrębu może być dalej trawiony w celu utworzenia nabłonkowych kokultur zrębu 3D. Metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania dotyczące sygnałów kontrolujących odnowę endometrium. Może pomóc w leczeniu chorób u kobiet, takich jak endometrioza, utrata ciąży i rak.

establishing-3d-endometrial-organoids-from-the-mouse-uterus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opis chirurgicznego indukowania endometriozy u myszy i szczurów poprzez autotransplantację tkanki macicy do kaskady tętniczej krezki jelitowej.

Myszowy model chirurgicznie wywołanej endometriozy poprzez autotransplantację tkanki macicy

Przedstawiono protokół generowania ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych, które składają się z komórek nabłonkowych i zrębowych oraz zachowują cechy natywnej tkanki endometrium. Protokół ten opisuje metody od pozyskania tkanki macicy do histologicznego przetwarzania organoidów endometrialnych.

Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

Wiele modeli endometriozy u gryzoni jest ograniczonych przez techniczną złożoność, powtarzalność i/lub potrzebę stosowania zwierząt z obniżoną odpornością lub specjalnych myszy reporterowych. Przedstawiamy uproszczony system indukcji zmian chorobowych przy użyciu dowolnej myszy eksperymentalnej z niezależnie weryfikowalnym, obiektywnym systemem punktacji i bez konieczności wycinki owariektomii lub operacji przeżycia.

Syngeniczny mysi model endometriozy przy użyciu myszy z naturalną jazdą na rowerze

Badanie to wprowadza nowy model mysi zaprojektowany specjalnie do symulacji endometriozy, klinicznie istotnego podtypu endometriozy. Wykorzystując myszy C57BL/6J, model ma na celu wyjaśnienie patofizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw niepłodności związanej z endometrioma, oferując wyrafinowane narzędzie do wypełnienia obecnej luki w wiedzy w medycynie reprodukcyjnej.

Stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli komórek macierzystych nabłonka endometrium szczurów (reESC), generując organoidy endometrialne szczurów. Metoda ta ułatwia badania in vitro chorób endometrium, umożliwiając edycję genów i inne manipulacje komórkowe.

Generowanie i charakterystyka organoidów macicy szczura z komórek macierzystych nabłonka endometrium szczura

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania niezawodnego i powtarzalnego cienkiego endometrium o bardzo niskiej śmiertelności i minimalnych zrostach wewnątrzmacicznych poprzez wstrzyknięcie 95% etanolu do macicy myszy w ciągu 1-3 minut.

Ustalenie mysiego modelu cienkiego endometrium

Protokół ten szczegółowo opisuje opracowanie wysokostopieńskich modeli mysich raka surowicy (HGSOC) in vitro oraz in vivo. Od wyprowadzenia myszych jajowodów, ich modyfikacji genetycznej w celu powtórzenia genetyki ludzkiego HGSOC, aż po ich wprowadzenie do kaletki jajnikowej myszy syngenetycznych w celu in vivo rozwoju guzów.

Rozwój linii organoidalnych pochodzących z myszy z komórek nabłonkowych jajowodów do modelowania wysokopoziomowego surowiczego raka jajnika

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Iniekcja doszklistkowa jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach nad naukami o widzeniu w kontekście chorób oczu lub jako metoda bezpośredniego zastosowania miejscowego leczenia. W tym filmie zaprezentowano protokół iniekcji doszklistkowej z użyciem strzykawki o pojemności 1ml z szklaną pipetą. Przedstawiono praktyczne wskazówki dotyczące unikania masywnych krwawień oraz uszkodzeń soczewki.

Iniekcja doplastycznej w głąb ciała szklistego w celu ustanowienia modelu chorób oczu

Niniejszy artykuł opisuje protokół izolacji i hodowli pierwotnych kultur fibroblastów z tkanki skóry oraz płuc dzikich gryzoni.

Zakładanie pierwotnych kultur fibroblastów dorosłych gryzoni

Naucz się izolować nabłonek macicy myszy i hodować trójwymiarowe organoidy endometrialne. Ta metoda wykorzystuje trawienie enzymatyczne i mechaniczne do badania odnawiania endometrium oraz chorób takich jak endometrioza.

Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy

Przeglądaj więcej filmów