Name: In vitro Metoda badania różnic opartych na płci w komórkach kubkowych spojówek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Poznaj metodę hodowli komórek kubkowych spojówek bez hormonów, umożliwiającą badanie różnic płciowych w zdrowiu powierzchni oka. Technika ta wspiera rozwój leków na choroby powierzchni oka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca jest finansowana przez National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).

Wszystkie ludzkie tkanki zostały przekazane do banku oczu za uprzednią świadomą zgodą i upoważnieniem dawcy do wykorzystania w badaniach naukowych. Wykorzystanie ludzkiej tkanki spojówki zostało ocenione przez Komitet Badań nad Oczami i Uchami w Massachusetts i uznane za wyłączone i niespełniające definicji badań z udziałem ludzi.
1. Pierwotna ludzka hodowla komórek kubkowych
<ol>
	<li>Z banku oczu pobierz ludzką tkankę spojówkową16.</li>
	<li>Przygotować pożywkę, pożywkę hodowlaną RPMI-1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM glutaminy, 2 mM aminokwasów endogennych (NEAA), 2 mM pirogronianu sodu, 100 μg/ml penicyliny-streptomycyny i 2 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES).</li>
	<li>Przeprowadź pierwotną hodowlę komórkową zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Zmielić tkankę na 1 mm3 kawałki za pomocą sterylnego skalpela i nasiona na płytkach hodowlanych w kapturze hodowlanym. Wysiewać cztery kawałki w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml kompletnego podłoża RPMI. Chociaż orientacja fragmentu tkanki nie ma wpływu na wzrost komórek, upewnij się, że kawałki przylegają do płytki hodowlanej, aby zapewnić wzrost za pomocą ostrza skalpela.</li>
		<li>Umieścić fragmenty tkanek w inkubatorze zawierającym 95% powietrza i 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Odświeżać tę samą pożywkę co drugi dzień, aż komórki kubkowe osiągną zlewność 70%-80% w ciągu około 14 dni. Usunąć zatyczkę tkankową około 72 godziny po wysiewie. 
		UWAGA: Ludzki nabłonek spojówek zawiera głównie warstwowe komórki płaskonabłonkowe i komórki kubkowe. RPMI jest selektywnym podłożem dla komórek kubkowych. Rzadko w ludzkiej hodowli CGC fibroblasty mogą rosnąć około 7 dnia. Metoda oczyszczania kultury została opisana w poprzedniej publikacji 22.</li>
		<li>Sprawdzić czystość kultury GC za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej (IFM) ukierunkowanej na cytokeratynę (CK)7 i lektynę Helix pomatia-1 (HPA-1)22 zgodnie ze standardową metodą IFM opisaną w19; patrz reprezentatywne wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przejście ludzkiej błony kielichowej spojówki i przygotowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Przepłukać komórki PBS (pH = 7,4) i odłączyć komórki trypsynizacją za pomocą 0,05% trypsyny w 1x EDTA. Obserwuj komórki co minutę pod mikroskopem. Gdy komórki oderwą się od dna, dezaktywuj trypsynę za pomocą kompletnych pożywek RPMI.</li>
	<li>Odwirować komórki o masie 150 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad komórkowy w kompletnej pożywce hodowlanej RPMI i ponownie wysiać na szalkach hodowlanych ze szklanym dnem w celu pomiaru [Ca2+]i. Całkowita objętość pożywki wynosi 300 μl na naczynie. Trzymaj nośnik na środku szklanej części naczynia.</li>
	<li>Eliminacja hormonów w pożywkach hodowlanych: Pożywka hodowlana może zawierać hormony płciowe, zwłaszcza FBS. Ponieważ czerwień fenolowa zawarta w RPMI-1640 ma aktywność estrogenną 23,24, zastąp pożywkę RPMI pożywką RPMI wolną od czerwieni fenolowej i dostosuj pH do 7,45 za pomocą pasków pH po przygotowaniu kompletnej pożywki. HEPES zawarty w kompletnej pożywce utrzymuje pH w stosunkowo niewielkim zakresie.</li>
</ol>
3. Test fura-2/acetoksymetylowy (AM) do pomiaru [Ca2+]i
<ol>
	<li>Wykonaj ładowanie Fura-2/AM zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Inkubować komórki w naczyniach ze szklanym dnem przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, w atmosferze otoczenia, chronić przed światłem buforem wodorowęglanowym Krebsa-Ringera (KRB; zawierającym 119 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,0 mM CaCl2, 1,2 mMMgSO4 i 25 mM NaHCO3) z 0,5% HEPES (Tabela 1) plus 0,5% BSA, 0,5 μM fura-2/AM, 8 μM kwasu pluronowego F127 i 250 μM sulfinpirazonu.</li>
		<li>Przed użyciem dostosuj pH do 7,45 za pomocą pH-metru. Po załadowaniu fura-2/AM przemyć komórki KRB zawierającym 250 μM sulfinpirazon bezpośrednio przed pomiarem [Ca2+]i.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj pomiar [Ca2+]i zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Umieść szalki zawierające komórki załadowane furą-2 pod mikroskopem, zlokalizuj reprezentatywne pole zawierające od 20 komórek do 50 komórek w 200-krotnym powiększeniu i użyj funkcji Freehand, aby narysować kontur wokół każdej komórki, aby wskazać oprogramowaniu, co jest, a co nie jest fluorescencją tła.</li>
		<li>Poczekaj, aż oprogramowanie automatycznie odejmie fluorescencję tła od pomiaru i kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment.</li>
		<li>Następnie odczekaj od 8 s do 15 s, aby ustalić podstawowy poziom wapnia w komórkach przed ostrożnym pipetowaniem w interesującym Cię agoniście. Kontynuuj pomiar przez co najmniej 120 s po dodaniu agonisty lub do momentu, gdy poziom wapnia powróci do wartości wyjściowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź analizę danych zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Użyj zmiany piku [Ca2+]i, aby przedstawić działanie bodźców. Oblicz średni podstawowy poziom wapnia w każdej komórce z pierwszych 8-15 s pomiarów. Jeśli ta liczba jest równa lub wyższa niż 500 nM, usuń tę komórkę ze zbioru danych, ponieważ przechodzi apoptozę lub martwicę.</li>
		<li>Po obliczeniu podstawowego poziomu każdej komórki odejmij tę ilość od maksymalnej zmierzonej [Ca2 + ]i dla tej samej komórki. Uśrednij zmianę piku [Ca2+]I dla wszystkich komórek w danym naczyniu.</li>
		<li>Aby zapewnić spójność, należy zapisać reakcje każdego bodźca w dwóch egzemplarzach i obliczyć średnią wartość zmian piku [Ca2 +] i uzyskaną z duplikatów jako jeden punkt danych z pojedynczej próbki ludzkiej. Porównaj dane z różnych grup przy użyciu odpowiedniej metody analizy danych opartej na projekcie badania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female-specific+downregulation+of+tissue+polymorphonuclear+neutrophils+drives+impaired+regulatory+T+cell+and+amplified+effector+T+cell+responses+in+autoimmune+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease.</a> Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).</li>
<li>Wang, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+negatively+regulates+epithelial+wound+healing+and+protective+lipid+mediator+circuits+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea.</a> FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).</li>
<li>Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+androgens+and+pituitary+hormones+on+the+structural+profile+and+secretory+activity+of+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland.</a> Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).</li>
<li>Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+dry+eye+disease+among+US+men%3A+estimates+from+the+Physicians%27+Health+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies.</a> Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).</li>
<li>Tellefsen Nøland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+and+age+differences+in+symptoms+and+signs+of+dry+eye+disease+in+a+Norwegian+cohort+of+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients.</a> The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).</li>
<li>Sullivan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFOS+DEWS+II+Sex%2C+gender%2C+and+hormones+report%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report.</a> The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).</li>
<li>Meester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeXY+chromosomes+and+the+immune+system%3A+reflections+after+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Sex+Differences%22%5BJournal%5D)">SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study.</a> Biology of Sex Differences. 11, 3(2020).</li>
<li>Yang, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+replacement+therapy+reverses+the+decrease+in+natural+killer+cytotoxicity+but+does+not+reverse+the+decreases+in+the+T-cell+subpopulation+or+interferon-gamma+production+in+postmenopausal+women%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women.</a> Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).</li>
<li>Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+age%2C+refractive+error+and+gender+related+changes+of+the+cornea+and+the+anterior+segment+of+the+eye+with+Scheimpflug+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Lens+%26+Anterior+Eye%22%5BJournal%5D)">Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging.</a> Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).</li>
<li>Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+age+and+gender+on+corneal+biomechanical+properties+in+a+healthy+Italian+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population.</a> Cornea. 33, 968-972 (2014).</li>
<li>Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+sex+steroids+exert+sex-specific+and%2For+opposite+effects+on+gene+expression+in+lacrimal+and+meibomian+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands.</a> Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).</li>
<li>Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age%2C+gender%2C+and+interracial+variability+of+normal+lacrimal+gland+volume+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI.</a> Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).</li>
<li>Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+aging+on+the+polar+and+neutral+lipid+profiles+in+human+meibomian+gland+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions.</a> Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).</li>
<li>Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+sex+hormone+levels+on+tear+production+in+postmenopausal+Nigerian+women%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Medicine+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women.</a> African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen%27s+and+progesterone%27s+impact+on+gene+expression+in+the+mouse+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).</li>
<li>Shatos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cultured+human+conjunctival+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).</li>
<li>Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+rat+conjunctival+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D1+and+aspirin-triggered+resolvin+D1+regulate+histamine-stimulated+conjunctival+goblet+cell+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion.</a> Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).</li>
<li>Dartt, D. A., Masli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctival+epithelial+and+goblet+cell+function+in+chronic+inflammation+and+ocular+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).</li>
<li>Mantelli, F., Argüeso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+ocular+surface+mucins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functions of ocular surface mucins in health and disease.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).</li>
<li>García-Posadas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+performance+of+a+commercial+human+conjunctival+epithelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line.</a> Experimental Eye Research. 223, 109220(2022).</li>
<li>Shatos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+propagation+of+rat+conjunctival+goblet+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).</li>
<li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).</li>
<li>García-Posadas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+IFN-%CE%B3+with+cholinergic+agonists+to+modulate+rat+and+human+goblet+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function.</a> Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).</li>
<li>Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+VIP+on+intracellular+%5BCa2+%5D%2C+extracellular+regulated+kinase+1%2F2%2C+and+secretion+in+cultured+rat+conjunctival+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells.</a> Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).</li>
<li>Contrò, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+steroid+hormone+receptors%2C+their+ligands%2C+and+nuclear+and+non-nuclear+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways.</a> AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).</li>
<li>Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variation+in+estrogen+receptor-alpha+protein+turnover+in+the+presence+of+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).</li>
<li>Campen, C. A., Gorski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+behavior+of+protein+synthesis+inhibitors+on+the+turnover+of+the+estrogen+receptor+as+measured+by+density+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling.</a> Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-based+differences+in+conjunctival+goblet+cell+responses+to+pro-inflammatory+and+pro-resolving+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators.</a> Scientific Reports. 12, 16305(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Badanie różnic w tkankach oka ze względu na płeć pomaga zrozumieć procesy zachodzące w chorobach, zwłaszcza zespołu suchego oka i alergicznego zapalenia spojówek, które w nieproporcjonalny sposób dotykają jedną płeć 4,5,6. Mimo że do tych badań można wykorzystać modele zwierzęce, dane uzyskane bezpośrednio z tkanek ludzkich są niezbędne ze względu na najwyższe podobieństwo do komórek ludzkich in vivo. Tkanki spojówek wy...

Różnice oparte na płci wpływają na wiele procesów zachodzących na powierzchni oka1,2,3. Klinicznym przejawem tych różnic związanych z płcią jest różnica w częstości występowania wielu chorób powierzchni oka między mężczyznami i kobietami, takich jak suche oko i zapalenie spojówek4,5,6. Dowody sugerują, że różnice oparte na płci wynikają z wielu poziomów biologicznych, w tym z różnych profili genów na chromosomach X i Y7 oraz wpływu hormonów8. Badanie molekularnych podstaw różnic ze względu na płeć może zapewnić lepsze zrozumienie choroby i ostatecznie ulepszyć medycynę spersonalizowaną.
Powierzchnia oka składa się z leżącego nad nią filmu łzowego, rogówki i spojówki. Różnice związane z płcią obserwuje się w wielu elementach powierzchni oka, w tym w filmie łzowym9,10, cornea11, gruczole łzowym12,13 oraz gruczołach Meiboma, które również wydzielają łzy12. Liczne badania mechanistyczne badały wpływ hormonów płciowych na rogówkę i związane z nią składniki14,15; Jednak niewiele wiadomo na temat różnic opartych na płci w spojówce i jej komórkach kubkowych. Spojówka to błona śluzowa, która pokrywa twardówkę i wewnętrzną powierzchnię powieki. Nabłonek spojówki składa się z nierogowaciejących, wielowarstwowych, warstwowych komórek płaskonabłonkowych16.
Wśród warstwowych komórek płaskonabłonkowych spojówki znajdują się komórki kubkowe (CGC) przeplatane na wierzchołkowej powierzchni nabłonka. Te komórki kubkowe charakteryzują się dużą liczbą granulek wydzielniczych znajdujących się na wierzchołkowym biegunie17. CGC syntetyzują i wydzielają tworzącą żel mucynę MUC5AC, która nawilża powierzchnię oka i smaruje ją podczas mrugania17. Wydzielanie mucyny jest ściśle regulowane przez wewnątrzkomórkowy [Ca2+] ([Ca2+]i) i aktywację zależnej od Ras kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK1/2)18. Niezdolność do wydzielania mucyny skutkuje suchością powierzchni oka i następstwami nieprawidłowości patologicznych. Jednak na powierzchni oka w stanie zapalnym intensywne wydzielanie mucyny stymulowane przez mediatory stanu zapalnego prowadzi do odczuwania lepkości i swędzenia oka19. Te stany z zaburzonym wydzielaniem mucyny ostatecznie doprowadzą do pogorszenia powierzchni oka.
Rola komórek kubkowych jako głównego źródła mucyny w oku została już dawno uznana20, jednak różnice w regulacji mucyny oparte na płci zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych pozostają nieodkryte. System in vitro byłby przydatny do monitorowania funkcji komórek kubkowych bez efektu hormonalnego lub z precyzyjnie kontrolowanym poziomem hormonów płciowych. Mimo że rozwinęła się linia komórek nabłonka spojówek21, nie ma dostępnej linii komórkowej kubkowej z funkcjonalnym wydzielaniem mucyny. W związku z tym zmodyfikowaliśmy naszą opracowaną pierwotną ludzką hodowlę CGC, aby ustalić metodę analizy różnic opartych na płci w in vitro16 i przedstawić ją jak poniżej.

<table><tbody><tr><td>0,05% trypsyna z 1x EDTA</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy</td><td>Bioreagent Fishera (Pittsburgh, PA)</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowane podłoża RPMI</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>12633020</td><td></td></tr><tr><td>karbachol</td><td>Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)</td><td>144.86</td><td></td></tr><tr><td>Surowica płodu Bovin</td><td>R& D (Minneapolis, MN)</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Ester fura-2-acetoksymetylowy&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka tkanka spojówkowa</td><td>Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)</td>Sól nieorganiczna <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>do buforu KRB</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td></td><td>Każda marka będzie działać</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Lonza Group (Bazylea, Szwajcaria)</td><td>17-605F</td><td></td></tr><tr><td>aminokwasy endogenne</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>fenol czerwone pożywki RPMI&nbsp;</td><td>Gibco (Grand Island, Nowy Jork)</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pluronowy F127</td><td>MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana RPMI-1640</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>skalpel</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>12460451</td><td>Każdy sterylny skalpel chirurgiczny może działać</td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>sulfinpirazon</td><td>MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)</td><td>S9509-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro metoda badania różnic opartych na płci w komórkach kubkowych spojówek

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Suche oko to wieloczynnikowa choroba wpływająca na zdrowie powierzchni oka, z znacznie częstszym występowaniem u kobiet. Przerwanie mucyny tworzącej żel, która jest wydzielana przez komórki kubkowe spojówki (CGC) na powierzchnię oka, przyczynia się do wielu chorób powierzchni oka. Eliminacja egzogennych hormonów płciowych jest niezbędna do uzyskania spójnych wyników podczas badania in vitro różnic w CGC ze względu na płeć. W pracy opisano metodę minimalizacji obecności hormonów egzogennych w badaniu różnic CGC ze względu na płeć przy zachowaniu ich funkcji fizjologicznej. CGC od pośmiertnych dawców ludzkich obu płci hodowano z fragmentów spojówki w pożywce RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (określaną jako kompletna pożywka) aż do zbiegu. Prawie 48 godzin przed rozpoczęciem eksperymentów CGC przeniesiono na pożywkę RPMI bez czerwieni fenolowej lub FBS, ale z 1% BSA (określaną jako pożywka wolna od czerwieni fenolowej). Prawidłową funkcję komórkową badano, mierząc wzrost wewnątrzkomórkowego [Ca2+] ([Ca2+]i) po stymulacji karbacholem (Cch, 1 x 10-4 M) za pomocą mikroskopii fura 2 / acetoksymetylu (AM). Wynik pokazuje, że CGC utrzymywały normalne funkcjonowanie w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej po 48 godzinach. Nie zaobserwowano istotnej różnicy w odpowiedzi [Ca2 +] i między pożywką RPMI wolną od czerwieni fenolowej a kompletną pożywką po stymulacji Tch. Dlatego zalecamy stosowanie pożywki RPMI wolnej od czerwieni fenolowej z 1% BSA w celu wyeliminowania hormonów egzogennych bez zmiany normalnej funkcji CGC w badaniu różnic ze względu na płeć.

Ludzkie CGC w hodowli pierwotnej osiągają 80% konfluencji w ciągu około 14 dni. Typ komórek potwierdzono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego przeciwciałami przeciwko markerom komórek kubkowych CK7 i HPA-125 (Rysunek 1). Chociaż usunięcie FBS z pożywki może wyeliminować hormony płciowe, brak FBS mógłby potencjalnie wpłynąć na odpowiedź komórkową. Aby zweryfikować metodę eliminacji hormonów, jako bodziec wykorzystano agonistę cholinergicicznego (karbachol, Cch 1...

Pożywka bez płodowej surowicy bydlęcej bez czerwieni fenolowej jest lepszą opcją niż zaawansowane RPMI, aby wyeliminować egzogenne hormony bez zmiany normalnej funkcji komórek kubkowych spojówki w badaniu różnic związanych z płcią.

In vitro Metoda badania różnic opartych na płci w komórkach kubkowych spojówek

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin ...

Badając funkcję komórek kubkowych w hodowli pierwotnej, uzyskujemy cenne informacje na temat mechanizmów stojących za różnicami w zdrowiu powierzchni oka ze względu na płeć. Zmodyfikowaliśmy już ustaloną metodę hodowli pierwotnej komórek kubkowych spojówek, eliminując z ustroju hormony i substancje estrogenowe, umożliwiając bardziej precyzyjną kontrolę poziomu hormonów płciowych. Ta modyfikacja zwiększa dokładność i wiarygodność naszych ustaleń.Wewnątrzkomórkowy pomiar wapnia jest metodą badania funkcji komórek kubkowych pod wpływem różnych bodźców i wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych wyzwalanych przez każdy bodziec. Technikę tę można rozszerzyć na opracowywanie leków na choroby powierzchni oka, takie jak alergia oczu, zespół suchego oka lub zapalenie spojówek. Technika ta ułatwia badanie przesiewowe wpływu różnych cząsteczek na komórki kubkowe przy określonych poziomach hormonów.Osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą techniką, często mają problemy z oddzieleniem tkanki spojówkowej od tkanki łącznej. Radzimy zwrócić szczególną uwagę na teksturę i właściwości materiałowe tkanki. Spojówka powinna być elastyczna i półprzezroczysta, podczas gdy tkanka łączna jest zwykle jaśniejsza i przypomina włókno bawełniane.Na początek za pomocą sterylnego skalpela zmiel ludzką tkankę spojówki na milimetrowe kawałki sześcienne. Na sześciodołkowej płytce wysiej cztery kawałki w każdym dołku zawierające jeden milimetr kompletnego podłoża RPMI. Upewnij się, że elementy są zakotwiczone do płyty.Inkubuj fragmenty tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza. Odświeżaj pożywkę co drugi dzień. Po 72 godzinach od wysiewu usuń korek tkankowy i kontynuuj inkubację, aż komórki kubkowe osiągną 70 do 80% zbieżności.Następnie przepłucz komórki PBS i dodaj 0,05% trypsyny EDTA, aby oderwać komórki od dna płytki. Obserwuj oderwanie komórek pod mikroskopem. A gdy komórki się odłączą, dodaj pełną pożywkę RPMI, aby dezaktywować trypsynę.Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 150 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w pożywce RPMI wolnej od czerwieni fenolowej. Następnie ponownie umieść zawiesinę komórkową na naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem w celu pomiaru wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. W przypadku ładowania Fura-2 AM dodaj bufor wodorowęglanowy Krebsa-Ringera zawierający 0,5% HEPES, 0,5% BSA i 0,5 mikromolowego Fura-2 AM, osiem mikromolowych kwasów pluronowych F127 i 250 mikromolowych sulfinpirazonów do naczynia o szklanym dnie zawierającym komórki kubkowe.Inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem. Po inkubacji przemyć komórki buforem wodorowęglanowym Krebsa-Ringera zawierającym 250 mikromolowych sulfinpirazonów. W celu wewnątrzkomórkowego pomiaru stężenia wapnia umieść pod mikroskopem naczynie zawierające komórki załadowane Fura-2.Następnie dodaj 200-krotne powiększenie. Zlokalizuj reprezentatywne pole zawierające od 20 do 50 komórek. Korzystając z funkcji odręcznej, narysuj kontur wokół każdej komórki, aby odróżnić ją od fluorescencji tła i poczekaj, aż oprogramowanie automatycznie odejmie fluorescencję tła od pomiaru.Kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment i odczekaj od ośmiu do 15 sekund, aby określić podstawowy poziom wapnia w komórkach. Następnie ostrożnie dodać cholinergiczny agonista karbachol i kontynuować pomiar przez co najmniej 120 sekund lub do momentu, gdy poziom wapnia powróci do wartości wyjściowej. Wykorzystując zmianę szczytowego wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, oblicz średni podstawowy poziom wapnia w każdej komórce z pierwszych ośmiu do 15 sekund pomiarów.Usuń ze zbioru danych komórki, których średni podstawowy poziom wapnia jest równy lub wyższy niż 500 nanomolowców. Następnie oblicz maksymalne wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia dla każdej komórki. Następnie odejmij wartość podstawowego poziomu wapnia od maksymalnego zmierzonego stężenia wewnątrzkomórkowego dla tej samej komórki.Na koniec uśrednij zmianę szczytowego wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia dla wszystkich komórek w naczyniu. Czystość ludzkich komórek kubkowych spojówek potwierdzono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla markerów komórek kubkowych, cytokeratyny i lektyny Helix pomatia 1. Wyniki testu Fura-2 AM nie wykazały istotnych różnic między komórkami inkubowanymi w wolnym od czerwieni fenolowej RPMI z 1% BSA i kompletną pożywką RPMI.Jednak znaczny wzrost wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapniowej na karbachol zaobserwowano podczas porównywania grupy zaawansowanej pożywki RPMI z pełną grupą pożywki RPMI. Najważniejszą rzeczą jest uzyskanie pierwotnej hodowli ludzkich komórek kubkowych o wystarczającej gęstości komórek. Podczas wzrostu upewnij się, że kawałki tkanki przylegają do płytki hodowlanej, aby zapewnić efektywny wzrost.Naukowcy mogli zbadać udział określonych szlaków poprzez stosowanie różnych inhibitorów, celowania w receptory lub cząsteczki sygnałowe do komórek przed stymulacją. Można również ocenić inne parametry wskazujące na funkcję komórek kubkowych, takie jak wydzielanie mucyny i dezaktywacja kinaz białkowych aktywowanych mitogenem. Uzupełniające się pomiary zapewniają kompleksowe zrozumienie reakcji komórek kubkowych na różne bodźce.

in-vitro-method-to-study-sex-based-differences-conjunctival-goblet

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje metodę mechanicznego usuwania błon kosmówkowych i witelinowych z wcześniej utrwalonych dojrzałych oocytów Drosophila. Przedstawiony protokół przedstawia szczegółową demonstrację procedury, w wyniku której uzyskuje się oocyty kompatybilne z fluorescencyjnymi testami hybrydyzacji in situ.

Mechaniczne usuwanie kosmówki i błony witeliny: metoda przygotowania oocytów Drosophila do bezpośredniej obserwacji

Ten film opisuje technikę opartą na wymazówce, aby izolować żywe bakterie komensalne ze spojówki oka. Technika ta może być wykorzystana do profilowania komensalnego mikrobiomu bakteryjnego spojówki, który odgrywa rolę obronną przed patogenami.

Izolacja bakterii komensalnych spojówek na podstawie wymazówki: technika izolacji bakterii komensalnych z spojówki modelu mysiego

Zebraliśmy, wybarwiliśmy i zobrazowaliśmy komórki z spojówki wewnętrznej krawędzi powieki u ludzi. Charakteryzując morfologię komórek i aktywność metaboliczną, metoda ta może pogłębić naszą wiedzę na temat suchego oka i roli, jaką tarcie między powierzchniami oka może odgrywać w odczuwaniu dyskomfortu ocznego.

Cytologia wyciskowa obszaru wycieraczki pokrywy

Pierwotna hodowla bydlęcych komórek śródbłonka rogówki została wykorzystana do zbadania mechanizmu przejścia śródbłonka rogówki na mezenchym. Ponadto wykorzystano model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura, aby zademonstrować przejście śródbłonka rogówki i mezenchymów in vivo.

Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów

Opisujemy tutaj metodę izolacji w celu uzyskania ludzkich śródnabłonkowych limfocytów wewnątrzszyjkowych do analizy śródnabłonkowych limfocytów T gamma delta. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie komórek T gamma delta szyjki macicy za pomocą kulek magnetycznych lub sortowania komórek.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek T gamma Delta w obrębie szyjki macicy

Odsłonięta normalna powierzchnia oka składa się z rogówki i spojówki. Komórki nabłonkowe, komórki kubkowe i komórki odpornościowe są obecne w spojówce. W tym miejscu opisano nieinwazyjną technikę cytologii wyciskowej z wykorzystaniem urządzenia do cytologii wyciskowej i cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w spojówce.

Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji i amplifikacji tlenowych i fakultatywnych beztlenowych mysich bakterii komensalnych spojówek przy użyciu unikalnego wymazu z oka i etapu wzbogacania opartego na hodowli z późniejszą identyfikacją za pomocą metod mikrobiologicznych i spektrometrii mas MALDI-TOF.

Izolacja komensalna spojówek i identyfikacja u myszy

Ten protokół opisuje wspomaganą transiluminacją mikrodysekcję segmentów kanalików nasiennych dorosłych myszy reprezentujących określone etapy cyklu nabłonkowego nasienia i typy komórek w nim, a następnie barwienie immunologiczne preparatów dyni i nienaruszonych segmentów kanalików.

Wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących

Protokół ten określa ustandaryzowane metody izolacji i przetwarzania płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych oraz niedojrzałych oocytów z procedur IVF, umożliwiając wysokiej jakości analizy molekularne i komórkowe. Te podejścia wspierają badania translacyjne dotyczące płodności, starzenia się reprodukcyjnego i dysfunkcji jajników, wykorzystując materiały zwykle odrzucane w opiece klinicznej.

Pobieranie ludzkiego płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych mieszków mieszkowych oraz niedojrzałych oocytów od osób poddawanych zapłodnieniu in vitro

Niniejszy artykuł demonstruje działanie i wpływ mikroskopii konfokalnej in vivo w diagnozie i leczeniu suchego oka oraz bada zastosowanie i wyniki mikroskopii konfokalnej in vivo , aby stanowić podstawę przyszłych badań.

In Vivo Mikroskopia konfokalna w diagnostyce i leczeniu suchego oka: Skupienie się na protokołach obrazowania i interpretacji

Poznaj metodę hodowli komórek kubkowych spojówek bez hormonów, umożliwiającą badanie różnic płciowych w zdrowiu powierzchni oka. Technika ta wspiera rozwój leków na choroby powierzchni oka.

In vitro Metoda badania różnic opartych na płci w komórkach kubkowych spojówek

Przeglądaj więcej filmów