In vitro Metoda badania różnic opartych na płci w komórkach kubkowych spojówek

Badając funkcję komórek kubkowych w hodowli pierwotnej, uzyskujemy cenne informacje na temat mechanizmów stojących za różnicami w zdrowiu powierzchni oka ze względu na płeć. Zmodyfikowaliśmy już ustaloną metodę hodowli pierwotnej komórek kubkowych spojówek, eliminując z ustroju hormony i substancje estrogenowe, umożliwiając bardziej precyzyjną kontrolę poziomu hormonów płciowych. Ta modyfikacja zwiększa dokładność i wiarygodność naszych ustaleń.

Wewnątrzkomórkowy pomiar wapnia jest metodą badania funkcji komórek kubkowych pod wpływem różnych bodźców i wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych wyzwalanych przez każdy bodziec. Technikę tę można rozszerzyć na opracowywanie leków na choroby powierzchni oka, takie jak alergia oczu, zespół suchego oka lub zapalenie spojówek. Technika ta ułatwia badanie przesiewowe wpływu różnych cząsteczek na komórki kubkowe przy określonych poziomach hormonów.

Osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą techniką, często mają problemy z oddzieleniem tkanki spojówkowej od tkanki łącznej. Radzimy zwrócić szczególną uwagę na teksturę i właściwości materiałowe tkanki. Spojówka powinna być elastyczna i półprzezroczysta, podczas gdy tkanka łączna jest zwykle jaśniejsza i przypomina włókno bawełniane.

Na początek za pomocą sterylnego skalpela zmiel ludzką tkankę spojówki na milimetrowe kawałki sześcienne. Na sześciodołkowej płytce wysiej cztery kawałki w każdym dołku zawierające jeden milimetr kompletnego podłoża RPMI. Upewnij się, że elementy są zakotwiczone do płyty.

Inkubuj fragmenty tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza. Odświeżaj pożywkę co drugi dzień. Po 72 godzinach od wysiewu usuń korek tkankowy i kontynuuj inkubację, aż komórki kubkowe osiągną 70 do 80% zbieżności.

Następnie przepłucz komórki PBS i dodaj 0,05% trypsyny EDTA, aby oderwać komórki od dna płytki. Obserwuj oderwanie komórek pod mikroskopem. A gdy komórki się odłączą, dodaj pełną pożywkę RPMI, aby dezaktywować trypsynę.

Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 150 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w pożywce RPMI wolnej od czerwieni fenolowej. Następnie ponownie umieść zawiesinę komórkową na naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem w celu pomiaru wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. W przypadku ładowania Fura-2 AM dodaj bufor wodorowęglanowy Krebsa-Ringera zawierający 0,5% HEPES, 0,5% BSA i 0,5 mikromolowego Fura-2 AM, osiem mikromolowych kwasów pluronowych F127 i 250 mikromolowych sulfinpirazonów do naczynia o szklanym dnie zawierającym komórki kubkowe.

Inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem. Po inkubacji przemyć komórki buforem wodorowęglanowym Krebsa-Ringera zawierającym 250 mikromolowych sulfinpirazonów. W celu wewnątrzkomórkowego pomiaru stężenia wapnia umieść pod mikroskopem naczynie zawierające komórki załadowane Fura-2.

Następnie dodaj 200-krotne powiększenie. Zlokalizuj reprezentatywne pole zawierające od 20 do 50 komórek. Korzystając z funkcji odręcznej, narysuj kontur wokół każdej komórki, aby odróżnić ją od fluorescencji tła i poczekaj, aż oprogramowanie automatycznie odejmie fluorescencję tła od pomiaru.

Kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment i odczekaj od ośmiu do 15 sekund, aby określić podstawowy poziom wapnia w komórkach. Następnie ostrożnie dodać cholinergiczny agonista karbachol i kontynuować pomiar przez co najmniej 120 sekund lub do momentu, gdy poziom wapnia powróci do wartości wyjściowej. Wykorzystując zmianę szczytowego wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, oblicz średni podstawowy poziom wapnia w każdej komórce z pierwszych ośmiu do 15 sekund pomiarów.

Usuń ze zbioru danych komórki, których średni podstawowy poziom wapnia jest równy lub wyższy niż 500 nanomolowców. Następnie oblicz maksymalne wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia dla każdej komórki. Następnie odejmij wartość podstawowego poziomu wapnia od maksymalnego zmierzonego stężenia wewnątrzkomórkowego dla tej samej komórki.

Na koniec uśrednij zmianę szczytowego wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia dla wszystkich komórek w naczyniu. Czystość ludzkich komórek kubkowych spojówek potwierdzono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla markerów komórek kubkowych, cytokeratyny i lektyny Helix pomatia 1. Wyniki testu Fura-2 AM nie wykazały istotnych różnic między komórkami inkubowanymi w wolnym od czerwieni fenolowej RPMI z 1% BSA i kompletną pożywką RPMI.

Jednak znaczny wzrost wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapniowej na karbachol zaobserwowano podczas porównywania grupy zaawansowanej pożywki RPMI z pełną grupą pożywki RPMI. Najważniejszą rzeczą jest uzyskanie pierwotnej hodowli ludzkich komórek kubkowych o wystarczającej gęstości komórek. Podczas wzrostu upewnij się, że kawałki tkanki przylegają do płytki hodowlanej, aby zapewnić efektywny wzrost.

Naukowcy mogli zbadać udział określonych szlaków poprzez stosowanie różnych inhibitorów, celowania w receptory lub cząsteczki sygnałowe do komórek przed stymulacją. Można również ocenić inne parametry wskazujące na funkcję komórek kubkowych, takie jak wydzielanie mucyny i dezaktywacja kinaz białkowych aktywowanych mitogenem. Uzupełniające się pomiary zapewniają kompleksowe zrozumienie reakcji komórek kubkowych na różne bodźce.