Modelowanie rozwoju móżdżku człowieka in vitro w strukturze 2D
16 września 2022
Obecny protokół wyjaśnia tworzenie monowarstwy 2D komórek móżdżku z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu zbadania wczesnych etapów rozwoju móżdżku.
Ta metoda może pomóc w badaniu wczesnego rozwoju móżdżku człowieka i tego, jak można go zmienić w zaburzeniach neuropsychiatrycznych. Kluczową zaletą tej metody jest generowanie wczesnych rozwojowo komórek ludzkiego móżdżku w strukturze warstwowej 2D bez wykonywania skomplikowanych czynności. Jest również opłacalny.
Wykonywanie pipet ciągnionych może być na początku trudne, ale wraz z praktyką i czasem łatwiej jest wyciągnąć pipety w sposób, który będzie łatwiejszy w obsłudze. Przygotowanie eksperymentalne należy rozpocząć od pociągnięcia pipety Pasteura o długości 22,9 cm około dwóch centymetrów poniżej szyjki, powyżej palnika Bunsena, aby utworzyć dwie szklane pipety. Cieńsza strona będzie o około cztery centymetry krótsza od drugiej.
Zegnij końcówki ciągniętej strony na płomieniu, aby uzyskać gładkie R, a następnie umieść wyciągnięte pipety w rękawach autoklawu i wysterylizuj je w autoklawie. W dniu zerowym dodaj jeden mililitr pożywki do różnicowania móżdżku uzupełnionej 10 mikromolowymi Y-27632 i SB-431542 do każdej studzienki sześciodołkowej płytki o ultraniskim naczepowaniu lub ULA i umieść ją w inkubatorze, aż podniesione kolonie będą gotowe do dodania do studzienek. Oczyść zróżnicowane komórki za pomocą wyciągniętej szklanej pipety.
Odessać pożywkę i dodać jeden milimetr roztworu pasażującego iPSC na każdą 35-milimetrową szalkę. Po trzech minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza odessać pożywkę i dodać dwa milimetry pożywki różnicującej móżdżek uzupełnionej 10 mikromolowymi Y-27632 i SB-431542 Pod 4-krotnym powiększeniem mikroskopu odwróconego w świetle przechodzącym, podnieś kolonie za pomocą zagiętej krawędzi wyciągniętej szklanej pipety. Po podniesieniu każdej kolonii delikatnie przenieś wszystkie kolonie do jednego dołka sześciodołkowej płytki ULA za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej.
Powtórz ten proces dla każdej płytki iPSC i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Drugiego dnia dodaj FGF2 do każdej studzienki, aby dostosować końcowe stężenie 50 nanogramów na mililitr. Siódmego dnia zmień jedną trzecią pożywki, odsysając jeden mililitr zużytej pożywki i zastępując ją jednym mililitrem świeżej pożywki różnicującej móżdżek.
Inkubować ciała zarodków przez siedem dni. W dniu 14 zakręć płytką, aby zebrać wszystkie ciała zarodków w środku płytki. Następnie przechyl płytkę i odessaj całe zużyte podłoże za pomocą pipetera o pojemności 1000 mikrolitrów od krawędzi.
W miarę zmniejszania się ilości pożywki, powoli ułóż płytkę płasko i kontynuuj aspirację, pozostawiając wystarczającą ilość pożywki, aby uniknąć wyciągania ciał zarodkowych. Następnie dodaj trzy mililitry świeżej pożywki różnicującej móżdżek uzupełnionej 10 mikromolami Y-27632. Następnie przenieś ciała zarodków za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej do naczynia pokrytego poli-L-ornityną i lamininą.
W 15 dniu odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką różnicującą móżdżek. W dniu zero, kolonie iPSC zostały oczyszczone i podniesione do pożywki różnicującej móżdżek zawierającej SB-431542 i Y-27632 i umieszczono w ultra-niskich płytkach mocujących w celu wytworzenia ciał zarodkowych. Dodanie FGF2 w drugim dniu i zmiana pożywki o 1/3 w siódmym dniu spowodowało, że ciała zarodków wykazały powiększenie w 14 dniu.
Komórki zaczęły migrować na zewnątrz z ciał embrionów wzdłuż pokrytej powierzchni w 15 dniu. Całkowita zmiana pożywki na pożywkę do dojrzewania móżdżku od 21 dnia spowodowała powstanie monowarstwy komórek o morfologii i złożoności neuronalnej do 35 dnia. Analiza ekspresji genów w 35 dniu wykazała, że komórki wyrażają wczesne markery progenitorowe móżdżku, takie jak progenitory glutaminergiczne, ATOH1, progenitorzy GABA-ergiczni, PTF1 alfa i markery komórek progenitorowych Purkinjego KIRREL2 i SKOR2.
Ponadto zaobserwowano również ekspresję rombowego markera wargi OTX2 i SIX3 specyficznego dla neuronu przedniego. Znakowanie immunofluorescencyjne komórek pobranych w 35. dniu wykazało pozytywne zabarwienie markerów móżdżku EN2 i PTF1 alfa, markera neuronalnego beta tubuliny III i markera proliferacji KI67. Barwienie jądrowe za pomocą 4'6-diamidino-2-fenyloindolu lub DAPI wykazało jądra komórkowe.
Aby skutecznie różnicować się, ważne jest, aby zacząć od zdrowych i niezróżnicowanych kolonii iPSC i używać odczynników, które są tak świeżo rozpuszczone, jak to tylko możliwe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje tworzenie 2D monowarstwy komórek móżdżku pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), mających na celu zbadanie wczesnego rozwoju móżdżku. System ten pozwala na zbadanie mechanizmów, które mogą być zaangażowane w zaburzenia neuropsychiatryczne.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Rozwój móżdżku
- Biologia komórek macierzystych
- Zaburzenia neuropsychiatryczne
Tło
- Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek, w tym neurony móżdżku.
- Zrozumienie rozwoju móżdżku jest istotne dla wglądu w zaburzenia rozwojowe.
- Ta metoda upraszcza generację komórek móżdżku bez skomplikowanej procedury.
- Opłacalność metody pozwala na szeroki dostęp do tego podejścia badawczego.
Cel badania
- Zbadać wczesne etapy ludzkiego rozwoju móżdżku.
- Zbadać zmiany w rozwoju związane z warunkami neuropsychiatrycznymi.
- Dostarczyć metodologię produkcji komórek móżdżku do zastosowań badawczych.
Stosowane metody
- Główna metoda polega na technikach kultury komórek do wytworzenia 2D warstwy komórek móżdżku z iPSC.
- Model biologiczny obejmuje progenitory móżdżku generowane z iPSC, rozpoczynając od zdrowych, niediferencjowanych kolonii.
- Kluczowe kroki eksperymentalne obejmują przygotowanie medium, transfer kolonii i czasowe zmiany medium w określonych dniach.
- Krytyczne fazy rozciągają się od różnicowania rozpoczętego w Dniu 0 do dojrzewania ocenionego w Dniu 35.
Główne wyniki
- Komórki wykazywały neuronalną morfologię i wyrażały kluczowe markery progenitorów móżdżku do Dnia 35.
- Pozytywne barwienie immunofluorescencyjne potwierdziło obecność istotnych markerów neuronalnych i móżdżku.
- Komórki wykazywały cechy migracji i różnicowania, podkreślając ich potencjał do modelowania aktywności móżdżku.
Wnioski
- Badanie umożliwia generowanie komórek móżdżku z iPSC do szczegółowych badań rozwojowych i patologicznych.
- To podejście zapewnia wgląd w rozwój móżdżku i jego związki z zaburzeniami neuropsychiatrycznymi.
- Zrozumienie tych procesów może prowadzić do innowacji w strategiach terapeutycznych dla powiązanych stanów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Modeling human cerebellar development in a 2D monolayer format enables pharmaceutical R&D teams to interrogate early neurodevelopmental mechanisms relevant to neuropsychiatric disease. This system provides a scalable, reproducible platform for studying molecular and cellular events underlying cerebellar differentiation, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The approach facilitates translational continuity from discovery biology to preclinical research for disorders with cerebellar involvement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of developmental pathways implicated in neurodevelopmental disorders.
- Supports functional validation of candidate targets in a human-relevant neuronal context.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling disease-relevant cell types and stages.
- Provides a platform for comparative analysis of gene expression and neuronal differentiation markers.
Screening & Assay Development
- Generates standardized 2D monolayer cultures suitable for high-content imaging and quantitative assays.
- Enables reproducible assessment of neuronal morphology and marker expression for assay development.
- Supports screening of compounds affecting cerebellar differentiation, neurite outgrowth, or synaptic connectivity.
- Provides a scalable system for downstream gene expression and physiological studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling for neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
- Enables investigation of molecular mechanisms underlying cerebellar dysfunction in translational studies.
- Supports risk-adjusted advancement of targets and pathways with human cellular evidence.
- Facilitates biomarker discovery and validation in a developmentally relevant context.
Pipeline & Workflow Integration
This 2D cerebellar differentiation protocol bridges early discovery and preclinical research by providing a human cell-based system for hypothesis testing and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of cerebellar development and disease mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables measurement of gene expression, neuronal markers, and morphological features for comparative analysis.
- Translational Research: Provides continuity for biomarker alignment and disease modeling in neurodevelopmental disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse R&D applications across neuroscience portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental research.
- Operational Value: Standardizes differentiation protocols for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing early human-relevant data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for neuropsychiatric indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, neuronal differentiation, and immunofluorescence analysis.
- Needs access to cell culture infrastructure, imaging systems, and molecular biology tools.
- Demands rigorous standardization of reagents and protocols for cross-team reproducibility.
- May require adaptation for different iPSC lines or disease-specific genetic backgrounds.
- Dependent on the quality of starting iPSC colonies and freshly prepared reagents for optimal outcomes.
