Name: Potrójny pierwotny model hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg do badania udaru niedokrwiennego in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj potrójny model hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg do badania udaru niedokrwiennego in vitro. Ta metoda umożliwia badanie zmian molekularnych i odkrywanie nowych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 i DA047157.

UWAGA: Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich linii komórkowych, materiałów, sprzętu i roztworów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie potrójnego modelu hodowli komórkowej BBB
<ol>
	<li>Wysiewanie perycytów
	<ol>
		<li>Hodować HBVP w kolbach hodowlanych T75 z powierzchnią aktywowaną do adhezji komórek w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C aż do uzyskania konfluencji. Po osiągnięciu konfluencji odessać stare podłoże do perycytów i przemyć komórki 5 mL ciepłego roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS). Odessać DPBS i odłączyć komórki od ścianek kolby, używając kombinacji 4 mL ciepłego roztworu trypsyny-EDTA oraz 1 mL DPBS. 
		UWAGA: Należy unikać używania pasaży późniejszych niż P7.</li>
		<li>Inkubować kolbę przez 5 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2. Sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki zostały odłączone od ścianek kolby. Dodać do kolby 5 mL ciepłego podłoża do perycytów (zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) i przenieść odłączone komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL.</li>
		<li>Wirować zawiesinę komórkową przez 3 min przy 200 × g, aby komórki utworzyły osad na dnie probówki. Odessać podłoże z probówki, dbając o to, aby osad komórkowy pozostał nienaruszony.</li>
		<li>Resuspendować osad komórkowy w podłożu do perycytów; obliczyć ilość podłoża w zależności od konfluencji komórek i liczby potrzebnych wkładów do dołków. Pobrać 10 µL resuspendowanych komórek, umieścić je na szkiełku do liczenia komórek i policzyć liczbę komórek.</li>
		<li>Określić gęstość komórek i wysiać 300 000 komórek/wkład w 1 mL podłoża do perycytów na stronę abluminalną wkładów do dołków (format 6-dołkowy). 
		UWAGA: Podczas wysiewania HBVP na stronę dolną wkładów bardzo ważne jest, aby najpierw odwrócić płytki z wkładami do góry dnem. Gdy płytka leży płasko na powierzchni, należy zdjąć dolną sekcję, aby odsłonić stronę abluminalną wkładów. Po dodaniu zawiesiny komórek perycytów na stronę abluminalną, przykryć wkłady odwróconą płytką, aby zapobiec parowaniu. Wszystkie płytki przechowywać odwrócone w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie astrocytów
	<ol>
		<li>Hodować HA w kolbach T75 w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C aż do uzyskania konfluencji. Postępować zgodnie z powyższymi krokami 1.1.1-1.1.4, stosując podłoże do astrocytów (również zawierające 2% FBS) zamiast podłoża do perycytów. 
		UWAGA: Należy unikać używania pasaży późniejszych niż P9.</li>
		<li>Określić gęstość komórek i wysiać 300 000 komórek/dołek na dno 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowej. Przykryć płytkę, aby zapobiec parowaniu i przechowywać wszystkie płytki w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie komórek śródbłonka
	<ol>
		<li>Hodować HBMEC w naczyniach do hodowli tkankowej w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C aż do uzyskania konfluencji. Postępować zgodnie z powyższymi krokami 1.1.1-1.1.4, stosując kompletne podłoże klasyczne (zawierające 10% FBS) zamiast podłoża do perycytów. 
		​UWAGA: Należy unikać używania pasaży późniejszych niż P12.</li>
		<li>Wyjąć z inkubatora z 5% CO2 w temperaturze 37 °C 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowej zawierające astrocyty oraz wkłady do dołków (format 6-dołkowy) zawierające perycyty. Odessać podłoże do astrocytów z 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowej. Do każdego dołka dodać 1 mL podłoża do perycytów i 1 mL podłoża do astrocytów.</li>
		<li>Odessać podłoże do perycytów z wkładów do dołków i umieścić je w 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej zawierających wysiane astrocyty. Wysiać HBMEC z gęstością 300 000 komórek/dołek w 2 mL kompletnego podłoża klasycznego na stronę apikalną tych samych wkładów. 
		UWAGA: Komórki śródbłonka należy wysiać na stronę apikalną wkładów następnego dnia po wysianiu perycytów na stronę abluminalną wkładów oraz astrocytów na 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej. Komórki należy utrzymywać w potrójnej hodowli przez 6 dni, aby indukować właściwości przypominające barierę krew-mózg (BBB). Podłoże hodowlane w obu przedziałach wkładów należy wymienić na 24 h przed rozpoczęciem eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indukcja deprywacji tlenu i glukozy
<ol>
	<li>Przemyj komórki 3x za pomocą DPBS. W przypadku potrójnych kultur komórkowych poddanych OGD, dodaj pożywkę bezglukozową (bez L-glutaminy i czerwieni fenolowej) zarówno do komory apikalnej, jak i bazolateralnej. W kontrolnych kulturach komórkowych w warunkach normoksji wymień pożywkę hodowlaną na świeżą. Umieść kontrolne kultury potrójne w 5% CO2 inkubator w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Wymiany pożywki przed indukcją OGD lub bezpośrednio po OGD mogą wywołać stres mechaniczny, który dodatkowo wpłynąłby na monowarstwy komórek śródbłonka. Z tego względu etapy obejmujące wymianę pożywki zostały uwzględnione jedynie dla kontrolnych kultur komórkowych w warunkach normoksji.</li>
	<li>Umieść w komorze inkubatora hipoksycznego szalkę Petriego zawierającą 20 ml sterylnej wody, aby zapewnić odpowiednie nawilżenie kultur. Otwórz komorę, zwalniając zacisk pierścieniowy. Rozmieść kultury komórkowe na półkach. Zamknij komorę, zaciągając zacisk pierścieniowy.</li>
	<li>Otwórz oba porty komory: wlotowy i wylotowy. Podłącz rurkę wychodzącą z górnej części przepływomierza do komory. Podłącz rurkę wychodzącą z dolnej części przepływomierza do butli z mieszaniną gazową zawierającą 95% N2/5% CO2 poprzez filtr powietrza</li>
	<li>Otwórz zawór sterujący przepływem ze zbiornika, obracając go przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby dopuścić minimalny przepływ gazu. Powoli otwórz zawór regulatora ciśnienia, obracając go zgodnie z ruchem wskazówek zegara.</li>
	<li>Przepłucz komorę mieszaniną gazów przy przepływie 20 L/min przez 5 min. Odłącz komorę od źródła gazu i szczelnie zamknij oba białe plastikowe zaciski.</li>
	<li>Zakręć zawór kontrolny przepływu zbiornika, obracając go zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Zamknij zawór regulatora ciśnienia, obracając go przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.</li>
	<li>Umieść komorę hipoksji w konwencjonalnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 h. 
	UWAGA: W celu wprowadzenia kolejnego okresu reoksygenacji, należy przemyć komórki 3x przy użyciu DPBS, dodać świeżą pożywkę do wszystkich kultur potrójnych i inkubować przez dodatkowe 24 h w 5% CO22 inkubator w temperaturze 37°CZgodnie z instrukcjami producenta, stężenie tlenu pozostałe w komorze wynosi 0% po nie krótszym niż 4-minutowym płukaniu anaerobową mieszaniną gazową z przepływem 20 L/min.</li>
</ol>
3. Pomiary TEER
<ol>
	<li>Umieść wysterylizowany przyrząd do pomiaru TEER w komorze z laminarem i podłącz elektrody do woltomierza nabłonkowego. Sterylizuj elektrody w 30 mL 70% roztworu alkoholu izopropylowego przez co najmniej 30 min.</li>
	<li>Włącz przyrząd do pomiaru TEER i ustaw funkcję na omy.</li>
	<li>Wyjmij elektrody z 70% roztworu alkoholu izopropylowego i umieść je w 20 mL DPBS na co najmniej 30 min, aż cyfrowy odczyt na urządzeniu TEER wskaże 0 omów.</li>
	<li>Wsuń długi bolec elektrody przez jeden z trzech otworów w uchwycie wkładki do studni kontrolnej (blank), opuszczając go aż do dotknięcia dna studni. Upewnij się, że krótki bolec spoczywa nad kulturą apikalną na dnie wkładki do studni. 
	UWAGA: Kontrolna wkładka do studni (blank) składa się z 2 mL kompletnej klasycznej pożywki w przedziale apikalnym oraz mieszaniny 1 mL pożywki dla pericytów i 1 mL pożywki dla astrocytów w przedziale basolateralnym. Upewnij się, że elektrody są trzymane pod kątem 90° do wkładki do studni podczas pomiaru TEER. Wykorzystanie średniej z dwóch lub trzech odczytów uzyskanych w tej samej studni (na otwór) może pomóc zmniejszyć zmienność.</li>
	<li>Odczekaj, aż wartości odczytu cyfrowego na przyrządzie TEER ustabilizują się przed zapisaniem wartości. Umieść elektrody z powrotem w DPBS, aby je wypłukać pomiędzy pomiarami. Kontynuuj zbieranie wszystkich pomiarów TEER dla dwóch kolejnych kontrolnych wkładek do studni.</li>
	<li>Zbierz pomiary TEER dla płytek z próbkami, stosując kroki 3.4-3.5 wykorzystane podczas pomiarów kontrolnych. Po wykonaniu wszystkich pomiarów umieść elektrodę z powrotem w 70% roztworze alkoholu izopropylowego na 30 min. Odłącz elektrody od przyrządu TEER i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Oblicz wartości TEER. Użyj równania (1), aby odjąć średnią wartość w omach kontrolnej wkładki do studni od wartości w omach próbki, a następnie pomnóż tę wartość rezystancji przez powierzchnię wkładki z membraną (cm2), aby otrzymać raportowaną wartość TEER w Ω∙cm2. 
	<img alt="Wzór na transepitelialną oporność elektryczną, obliczanie TEER, powierzchnia wkładki z membraną, równanie." src="/files/ftp_upload/64469/64469eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> (1)</li>
</ol>
4. Ocena przepuszczalności parakomórkowej BHE
UWAGA: Wszystkie etapy z wykorzystaniem FITC-dekstranu należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli komórkowych przy wyłączonym oświetleniu. Roztwory FITC-dekstranu należy owinąć folią aluminiową, aby zminimalizować fotowyblakanie.
<ol>
	<li>Przygotować roztwory zawierające FITC-dekstrany o masach 20 i 70 kDa (0,1 mg/mL), wykorzystując pożywkę do wzrostu komórek śródbłonka bez czerwieni fenolowej, i pozostawić do mieszania na wstrząsarce platformowej przez 1 h. Przefiltrować roztwory za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 µm.</li>
	<li>Odssać pożywkę z komory bazalnej i zastąpić ją 2 mL pożywki do wzrostu komórek śródbłonka bez czerwieni fenolowej w potrójnym modelu hodowli komórkowej BBB. Przemyć komórki w komorze apikalnej dwukrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS).</li>
	<li>Dodać 1 mL roztworu FITC-dekstranu do komory apikalnej i przykryć płytkę folią aluminiową. Umieścić płytkę w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C na 1 h.</li>
	<li>Pobrać 100 µL pożywki z komór bazalnych i przenieść ją do czarnej płytki 96-dołkowej. Zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika płytek mikrodołkowych, ustawiając długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio na 480 nm i 530 nm.</li>
</ol>
5. Detekcja hipoksji w żywych komórkach
<ol>
	<li>Nasiono 200 µL HBMEC, HA i HBVP w centrum z poli-D-szkiełka z dnem o średnicy 35 mm pokryte lizyną, z gęstością 150 000 komórek na szkiełko. Przed wysianiem HBMEC należy pokryć dno szkiełek czynnikiem adhezyjnym. Pozostawić komórki aby przywrzębiły się do szklanej powierzchni po pozostawieniu ich na noc w temperaturze 37 °C w CO2 inkubator 
	UWAGA: Ważne jest, aby naczynia z ludzkimi komórkami pierwotnymi umieścić w komorze hipoksji do przeprowadzenia OGD w tym samym czasie, co model BBB z wkładką trójdołkową..</li>
	<li>Po osiągnięciu konfluencji usunąć medium hodowlane i dodać 2 mL uprzednio ogrzanego medium pozbawionego glukozy (dla grupy OGD) lub medium standardowego (dla grupy kontrolnej) zawierającego 2 µL 1 mM Hoechst 33342 (stężenie końcowe 0.2 µM) i 0.5 µL z 5 mM roztworu zapasowego wspomnianego znacznika Image-iT green hypoxia odczynnik (stężenie końcowe 1 µM). Po traktowaniu w warunkach OGD, w każdej płytce należy wymienić pożywkę na pożywkę zoptymalizowaną do obrazowania.</li>
	<li>Przeprowadzić obrazowanie żywych komórek metodą fluorescencyjną z użyciem filtra GFP oraz inkubatora do konfokalnego mikroskopu montowanego na stoliku, zgodnie z wcześniejszym opisem.14,15.</li>
</ol>

<ol><li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38(2016).</li>
<li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li>
<li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+in+the+21st+century%3A+a+snapshot+of+the+burden%2C+epidemiology%2C+and+quality+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165(2018).</li>
<li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blood-brain+barrier+overview+on+structure%2C+function%2C+impairment%2C+and+biomarkers+of+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69(2020).</li>
<li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282(2019).</li>
<li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier%3A+perspectives+on+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211(2014).</li>
<li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke%3A+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li>
<li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%2C+stroke%2C+blood-brain+barrier+dysfunction%2C+and+imaging+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li>
<li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li>
<li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells%2C+astrocytes+and+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765(2015).</li>
<li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis%3A+one+cell+type+vs+three+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li>
<li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772(2021).</li>
<li>Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382(2020).</li>
<li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li>
<li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li>
<li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li>
<li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P50%3A+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li>
<li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230(2019).</li>
<li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy ujawnili, że nie ma konfliktu interesów.

W tym protokole opisujemy metodę tworzenia wiarygodnego modelu hodowli BBB z potrójnym śródbłonkiem komórek-perycytów-astrocytów do badania dysfunkcji BBB w warunkach udaru niedokrwiennego in vitro. Biorąc pod uwagę, że perycyty są najbliższymi sąsiadami komórek śródbłonka in vivo, HBVP są posiane na spodniej stronie wkładów studzienek w tym modelu16. Chociaż w tej konfiguracji brakuje bezpośredniej komunikacji międzykomórkowej między astrocytami a komórkami śródbłonka, ten układ...

Udar mózgu jest jedną z głównych przyczyn zgonów i długotrwałej niepełnosprawności na całym świecie1. Częstość występowania udaru mózgu gwałtownie wzrasta wraz z wiekiem, podwajając się co 10 lat po ukończeniu 55 roku życia2. Udar niedokrwienny występuje w wyniku zakłócenia przepływu krwi w mózgu z powodu zdarzeń zakrzepowych i zatorowych, co obejmuje ponad 80% wszystkich przypadków udaru3. Nawet obecnie dostępnych jest stosunkowo niewiele opcji leczenia w celu zminimalizowania obumarcia tkanek po udarze niedokrwiennym. Terapie, które istnieją, są wrażliwe na czas i w konsekwencji nie zawsze prowadzą do dobrych wyników klinicznych. Dlatego pilnie potrzebne są badania nad złożonymi mechanizmami komórkowymi udaru niedokrwiennego, które wpływają na powrót do zdrowia po udarze.
BBB to dynamiczny interfejs do wymiany cząsteczek między krwią a miąższem mózgu. Strukturalnie BBB składa się z mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu połączonych kompleksami połączeniowymi otoczonymi błoną podstawną, perycytami i astrocytami końcówkami4. Perycyty i astrocyty odgrywają istotną rolę w utrzymaniu integralności BBB poprzez wydzielanie różnych czynników niezbędnych do tworzenia silnych, ścisłych połączeń5,6. Rozpad bariery krew-mózg jest jedną z cech charakterystycznych udaru niedokrwiennego. Ostra reakcja zapalna i stres oksydacyjny związane z niedokrwieniem mózgu powodują zakłócenie kompleksów białkowych połączeń ścisłych i rozregulowane przesłuchy między astrocytami, perycytami i komórkami śródbłonka, co prowadzi do zwiększonej przepuszczalności substancji rozpuszczonej w obrębie BBB7. Dysfunkcja bariery krew-mózg dodatkowo sprzyja powstawaniu obrzęku mózgu i zwiększa ryzyko transformacji krwotocznej8. Biorąc pod uwagę wszystkie powyższe, istnieje duże zainteresowanie zrozumieniem zmian molekularnych i komórkowych, które zachodzą na poziomie BBB podczas i po udarze niedokrwiennym.
Chociaż wiele modeli BBB in vitro zostało opracowanych w ciągu ostatnich dziesięcioleci i wykorzystywanych w różnych badaniach, żaden z nich nie jest w stanie w pełni odtworzyć warunków in vivo9. Podczas gdy niektóre modele opierają się na monowarstwach komórek śródbłonka hodowanych na dobrze wstawionych przepuszczalnych nośnikach samodzielnie lub w połączeniu z perycytami lub astrocytami, dopiero nowsze badania wprowadziły projekty modeli hodowli trójkomórkowych. Prawie wszystkie istniejące modele BBB z potrójną hodowlą zawierają pierwotne komórki śródbłonka mózgu wraz z astrocytami i perycytami wyizolowanymi z gatunków zwierząt lub komórkami pochodzącymi z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych10,11,12,13.
Uznając potrzebę lepszego podsumowania ludzkiego BBB in vitro, stworzyliśmy model potrójnej hodowli komórkowej in vitro BBB złożony z komórek mikronaczyniowych śródbłonka ludzkiego mózgu (HBMEC), pierwotnych ludzkich astrocytów (HA) i pierwotnych perycytów naczyniowych ludzkiego mózgu (HBVP). Ten model BBB z potrójną hodowlą jest osadzony na 6-dołkowych płytkach z membraną poliestrową o wielkości porów 0,4 μm. Te studzienki zapewniają optymalne środowisko do przyczepiania się komórek i umożliwiają łatwy dostęp zarówno do przedziałów wierzchołkowych (krew), jak i podstawno-bocznych (mózg) w celu pobierania próbek na pożywkę lub aplikacji związku. Cechy tego proponowanego modelu potrójnej hodowli komórkowej BBB są oceniane poprzez pomiar TEER i strumienia parakomórkowego po OGD naśladującego udar niedokrwienny in vitro, z niedoborem tlenu (<1%O2) i składników odżywczych (przy użyciu pożywki bezglukozowej) osiągniętym przy użyciu wilgotnej, szczelnej komory. Dodatkowo, indukowane stany niedokrwienne w tym modelu są dokładnie weryfikowane przez bezpośrednią wizualizację niedotlenionych komórek.

<table><tbody><tr><td>Transwell 24 mm z 0,4 i mikro; m Wkładka membrany poliestrowej z porami</td><td>Corning</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Naczynia ze szklanym dnem</td><td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyty Medium</td><td>Science Cell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr>Systemy komórkowe<td>czynnika przyczepu</td><td>(Fisher Scientific)</td><td>4Z0-201</td><td></td></tr><tr><td>BD 60 mL Strzykawka</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie BrainPhys Optimized Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5791</td><td></td></tr><tr><td>Complete Classic Medium z serum i CultureBoost</td><td>4Z0-500</td><td>Cell Systems</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe Corning 50 ml PP (stożkowe dno z nasadką CentriStar</td><td>VWR</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Corning 75cm&sup2; Kolba do hodowli komórkowych w kształcie litery U bez obróbki szyjki&nbsp;</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Corning CellBIND 96-dołkowa płaska przezroczysta dolna mikropłytki polistyrenowe</td><td>Corning</td><td>3340</td><td></td></tr><tr><td>Countes Szkiełka komory do liczenia komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td><td></td></tr><tr><td>Decon CiDehol 70 Roztwór alkoholu izopropylowego&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>04-355-71</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Podłoże (bez glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej)</td><td>ThermoFisher</td><td>A14430-01</td><td>Pożywka bez glukozy</td></tr><tr><td>DPBS (bez wapnia, bez magnezu)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>EBM Podłoże podstawowe do wzrostu komórek śródbłonka, bez czerwieni fenolowej, 500 ml</td><td>Lonza</td><td>CC-3129</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2 Nabłonkowy woltomierz/omomierz (TEER) z elektrodami STX2</td><td>World Precison Instruments</td><td>NC9792051</td><td>Woltomierz nabłonkowy&nbsp;</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny&ndash; Dekstran (20 000 wag.)</td><td>Millipore Sigma</td><td>FD20-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny&ndash; Dekstran (WT 70,000)</td><td>Millipore Sigma</td><td>FD70S-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluorview FV3000 Mikroskop konfokalny</td><td>Zbiornik gazu Olympus</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>(95% N2, 5% CO2)</td><td>Airgas</td><td>X02NI95C2003071</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej)</td><td>Thermofisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trichlorowodorek, trójwodzian - 10 mg / ml roztwór w wodzie</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie astrocyty</td><td>Science Cell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Perycyty naczyniowe ludzkiego mózgu Komórka naczyniowa Komórka</td><td>naczyniowa 1200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora inkubatora hipoksji</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27310</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do hipoksji Image-iT</td><td>ThermoFisher</td><td>I14834</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte Medium</td><td>Science Cell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne mikronaczyniowe komórki śródbłonka ludzkiego mózgu</td><td>ACBRI 376</td><td>Cell Systems</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka z platformą kołyszącą, podwójna</td> Pojedynczy przepływomierz <td>VWR</td><td>10860-658</td><td></td></tr><tr><td></td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27311</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek SpectraMax iD3</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>75886-128</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, 25 mm, 0,22 &mu; m, PVDF, sterylne</td><td>NEST Scientific</td><td>380121</td><td></td></tr><tr><td>TPP Płytki wielodołkowe (6 dołków)</td><td>Kolby do</td><td></td> hodowli tkankowych MidSci TP92406 <td></td></tr><tr><td>TPP Kolby T-75 Kolby</td><td>MidSci</td><td>TP90075</td><td>z aktywowaną powierzchnią do adhezji komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Destylowana woda</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Uno Stage-Oko</td> <td>Lab</td><td>UNO-T-H-CO2-TTL</td><td></td></tr></tbody></table>

potrójny pierwotny model hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg do badania udaru niedokrwiennego in vitro

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Udar niedokrwienny jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie, z ograniczonymi możliwościami terapeutycznymi. Neuropatologia udaru niedokrwiennego charakteryzuje się przerwaniem dopływu krwi do mózgu, co prowadzi do śmierci komórki i dysfunkcji poznawczych. W trakcie i po udarze niedokrwiennym dysfunkcja bariery krew-mózg (BBB) ułatwia postęp urazu i przyczynia się do słabej rekonwalescencji pacjenta. Obecne modele BBB obejmują przede wszystkim monokultury śródbłonka i podwójne kokultury z astrocytami lub perycytami.
Takie modele nie są w stanie w pełni naśladować dynamicznego mikrośrodowiska mózgu, co jest niezbędne do komunikacji między komórkami. Ponadto powszechnie stosowane modele BBB często zawierają unieśmiertelnione ludzkie komórki śródbłonka lub hodowle komórek pochodzenia zwierzęcego (gryzoni, świń lub bydła), które stanowią ograniczenia translacyjne. W artykule opisano nowatorski model BBB oparty na dobrze wstawionej, zawierający tylko pierwotne komórki ludzkie (komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, astrocyty i perycyty naczyń mózgowych), umożliwiający badanie niedokrwiennego uszkodzenia mózgu in vitro. 
Wpływ deprywacji tlenu i glukozy (OGD) na integralność bariery został oceniony przez pasywną przepuszczalność, pomiary przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i bezpośrednią wizualizację niedotlenionych komórek. Prezentowany protokół oferuje wyraźną zaletę, naśladując środowisko międzykomórkowe BBB in vivo, służąc jako bardziej realistyczny model BBB in vitro do opracowywania nowych strategii terapeutycznych w warunkach niedokrwiennego uszkodzenia mózgu.

Aby zbadać wpływ astrocytów i pericytów na funkcję barierową HBMEC, skonstruowano trójskładnikowy model hodowli komórkowej BBB na insertach do hodowli komórkowej (Rysunek 1A) wraz z monokulturą HBMEC oraz dwoma modelami kokultury jako kontrolami (Rysunek 1B). Kontrole kokultury dwuskładnikowej obejmowały kokulturę bezkontaktową HBMEC z HA oraz kokulturę kontaktową HBMEC z HBVP. Po 6 dniach kokultury wszystkie układy eksperymentalne poddano OGD przez 4 h. Integra...

Tutaj opisujemy metodę tworzenia modelu potrójnej hodowli komórkowej bariery krew-mózg na podstawie pierwotnych komórek śródbłonka mikronaczyniowego, astrocytów i perycytów ludzkiego mózgu. Ten wielokomórkowy model nadaje się do badań dysfunkcji jednostek nerwowo-naczyniowych podczas udaru niedokrwiennego in vitro lub do badań przesiewowych kandydatów na leki.

Potrójny pierwotny model hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg do badania udaru niedokrwiennego in vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

W naszym protokole uznano potrzebę lepszego odtworzenia ludzkiej bariery krew-mózg in vitro w celu zbadania złożonych mechanizmów komórkowych, które wpływają na powrót do zdrowia po udarze. Nasz potrójny model wykazuje solidną integralność, która jest częściowo związana z dużymi przegrodami wkładów studzienek, co pozwala nam zmniejszyć częstotliwość zmian i uniknąć zakłóceń w populacji. Nasz model jest doskonałym narzędziem do badania zmian molekularnych i komórkowych, które zachodzą na barierze krew-mózg w trakcie i po udarze niedokrwiennym.Nasz protokół pozwala na odkrycie nowych celów i terapii w celu poprawy powrotu do zdrowia po udarze. Obecne metody leczenia udaru niedokrwiennego są wrażliwe na czas i w związku z tym nie zawsze są skuteczne. Rozpocznij od hodowli HBVP w kolbach hodowlanych T75 z aktywowaną powierzchnią do adhezji komórek w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza aż do zlewania się.Po osiągnięciu konfluencji odessać starą pożywkę perycytową i umyć komórki pięcioma mililitrami ciepłego PBS firmy Dulbecco. Odessać PBS Dulbecco i odłączyć komórki od kolby, używając kombinacji czterech mililitrów ciepłego roztworu trypsyny EDTA i jedn

a-triple-primary-cell-culture-model-human-blood-brain-barrier-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejsza metoda opisuje sposób izolacji i unieśmiertelniania mikro naczyniowych komórek śródbłonka z mózgu myszy. Przedstawiamy szczegółowy protokół, obejmujący kolejno homogenizację tkanki mózgowej, etapy trawienia, wysiew oraz unieśmiertelnianie komórek. Uzyskanie homogennej, unieśmiertelnionej linii mikro naczyniowych komórek śródbłonka zajmuje zazwyczaj około pięciu tygodni.

Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Ten film pokazuje współhodowlę komórek ludzkiego mózgu perycytów, astrocytów i śródbłonka. Każda warstwa komórkowa jest tworzona oddzielnie, a następnie hodowana razem, tworząc trójwarstwowy system, który naśladuje układ komórkowy bariery...

Opracowanie modelu potrójnej hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg

Stworzenie ludzkich modeli bariery krew-mózg (BBB) może przynieść korzyści badaniom nad chorobami mózgu związanymi z niewydolnością bariery krew-mózg. Opisujemy tutaj ulepszoną technikę przygotowania kontaktowego modelu BBB, która umożliwia kokulturację ludzkich astrocytów i komórek śródbłonka mózgu po przeciwnych stronach porowatej błony.

Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie wysoce powtarzalnej techniki oceny in vivo naruszenia bariery krew-mózg w szczurzych modelach udaru niedokrwiennego.

Ocena in vivo przerwania bariery krew-mózg w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Izolowane naczynia włosowate mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej mogą być użyte jako model przedkliniczny do badania funkcji bariery w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od świeżej ludzkiej tkanki mózgowej.

Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący ustawienie systemu hodowli z porowatej membrany poliestrowej BBB (bariera krew-mózg) w celulonowym systemie hodowli w celu oceny transportu biomolekuł lub czynników zakaźnych przez ludzki BBB i ich fizjologicznego wpływu na sąsiednie komórki mózgowe.

Model interfejsu krew-mózg człowieka do badania przekraczania barier przez patogeny lub leki oraz ich interakcji z mózgiem

Tutaj prezentujemy proste podejście wykorzystujące specyficzne podłoża hodowlane, które pozwala na tworzenie kultur wzbogaconych o neurony i astrocyty, lub kultur gleju neuronów z kory embrionalnej, o wysokiej wydajności i odtwarzalności.

Model hodowli komórkowej do badania roli interakcji neuron-glej w niedokrwieniu

Ten protokół opisuje metodę tworzenia ludzkiej bariery krew-mózg (BBB) w modelu in vitro. Komórki śródbłonka i perycyty są wysiewane po obu stronach wkładki filtracyjnej (przedział krwi), a astrocyty są wysiewane w dolnej studzience (przedział mózgowy). Scharakteryzowany model wykorzystano w eksperymentach z transportem nanocząstek.

System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

Bariera krew-mózg (BBB) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilnego i zdrowego środowiska mózgu. Dysfunkcja bariery krew-mózg jest związana z wieloma chorobami neurologicznymi. Opracowaliśmy trójwymiarowy model bariery krew-mózg pochodzący z komórek macierzystych, aby zbadać patologię naczyń mózgowych, integralność bariery krew-mózg oraz sposób, w jaki bariera krew-mózg jest zmieniona przez genetykę i chorobę.

Rekonstrukcja bariery krew-mózg in vitro w celu modelowania i terapeutycznego ukierunkowania choroby neurologicznej

Poznaj potrójny model hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg do badania udaru niedokrwiennego in vitro. Ta metoda umożliwia badanie zmian molekularnych i odkrywanie nowych celów terapeutycznych.

Potrójny pierwotny model hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg do badania udaru niedokrwiennego in vitro

Przeglądaj więcej filmów