Mysi model złożonej niestabilności stawu skokowo-podskokowego

Pomyślne opracowanie mysiego modelu niezdolności ASCJ rozszerza prosty model zwierzęcy niezdolności do gry w kostkę i dostarcza nowych koncepcji do badania klinicznych chorób stóp. Stworzyliśmy model zwierzęcy, który jest bardziej zgodny z rzeczywistą sytuacją kliniczną, który może być wykorzystany do dalszych badań nad diagnostyką i leczeniem chorób stopy. Na tydzień przed eksperymentem poddaj myszy ćwiczeniu na równoważni i chodzie, przechodząc z jednego końca równoważni lub rury w kształcie litery U na drugi, bez zatrzymywania się.

Po znieczuleniu i usunięciu owłosienia na stawie skokowym prawych tylnych kończyn myszy należy zdezynfekować odsłoniętą skórę wacikiem jodowym. Przenieś mysz na salę operacyjną dla zwierząt mikrochirurgicznych za pomocą sterylnej podkładki chirurgicznej. W przypadku poprzecznych grup więzadeł szyjnych i przednich kości skokowo-piszczelowych wykonaj siedmiomilimetrowe ukośne w dół podłużne nacięcie skalpelem na skórze powyżej prawego stawu skokowego.

I sonda z mikroskopijnymi prostymi kleszczami w przedniej części stawu skokowego. Zapewniając odsłonięcie więzadła skokowego przedniego na dolnej granicy kości skokowej i strzałkowej, przeciąć je delikatnie skalpelem. Oddziel długie i krótkie ścięgna strzałkowe oraz ścięgna prostownika długiego palca

Odsłoń więzadło szyjne i przetnij je skalpelem. W przypadku poprzecznego więzadła szyjnego i grupy więzadła naramiennego wykonaj ośmiomilimetrowe pionowe nacięcie na przyśrodkowej skórze prawego stawu skokowego i tępo oddziel DL od kostki przyśrodkowej, aby ją przeciąć. Następnie przetnij więzadło szyjne, jak pokazano wcześniej.

W przypadku grupy pozorowanej należy wykonać pozorowaną operację prawego stawu skokowego. Po przepłukaniu nacięcia sterylną solą fizjologiczną należy je zszyć nylonową nicią chirurgiczną 5-0, a następnie zdezynfekować zszyte nacięcie wacikiem jodowym. Gdy obrzęk stawu kątowego zmniejszy się po dwóch tygodniach od operacji, ćwicz myszy w maszynie do zmęczenia obrotowego myszy przez godzinę dziennie.

W przypadku testu równoważni zaciśnij okrągłą drewnianą belkę nachyloną pod kątem 15 stopni na jednym końcu za pomocą klipsa do statywu fotograficznego, a drugi koniec umieść na powierzchni roboczej połączonej z zamkniętą kasetą. Wykonaj trening na równoważni na tydzień przed operacją, aby upewnić się, że myszy płynnie przechodzą z jednego końca belki na drugi. Wyobraźmy sobie, że mysz zdała test, gdy przechodzi przez wiązkę dwa razy w ciągu 60 sekund bez przerwy.

Po każdej próbie spryskaj równoważnię 75% alkoholem, aby przedstawić resztkowy zapach poprzedniej myszy przed wpływem na następną mysz. Wykonaj test równoważni i zapisz średni czas, w którym każda mysz przechodzi przez równoważnię dwa razy z rzędu. I ile razy prawa tylna stopa ześlizguje się z belki, jako zmienne zależne.

W celu analizy śladu umieść plastikowy kanał w kształcie litery U na stole doświadczalnym i podłącz jeden koniec plastikowego kanału do zamkniętej kasety. Umieść zwykły papier pigmentowy płasko w kanale. Następnie chwyć mysz obiema rękami i równomiernie pomaluj przednią i tylną nóżkę nietoksycznym czerwonym i zielonym pigmentem.

Teraz umieść pomalowaną mysz na jednym końcu kanału i pozwól jej przesunąć się na drugi koniec kasety. Weź pigmentowany papier ze śladami stóp, zaznacz go i pozostaw do wyschnięcia w wentylowanym i zacienionym miejscu. Spryskaj plastikowy kanał w kształcie litery U 75% alkoholem po przejściu każdej myszy, aby zapobiec wpływowi resztkowego zapachu poprzedniej myszy na następną mysz.

Zaznacz trzy kolejne wyraźne ślady myszy na każdym papierze. Za pomocą linijki zmierz długość kroku śladu prawej stopy myszy z szerokością kroku między lewym i prawym footprintem. Użyj mikroskopijnej pęsety i nożyczek, aby usunąć nadmiar tkanki miękkiej wokół próbek kostki.

Następnie umieść próbki w probówce wirówkowej zawierającej 10% roztwór odwapniający EDTA i zaznacz różne grupy. Następnie umieść probówkę wirówkową na stole do wytrząsania w celu odwapnienia. Zmieniaj roztwór odwapniający raz dziennie i określ odwapnienie próbek.

Po miesiącu odwapnienia odwodnić próbki alkoholem gradientowym, a następnie użyć N-butanolu przez osiem godzin w celu oczyszczenia. Na koniec zanurz oczyszczone próbki w parafinie w pozycji koronalnej w celu zatopienia. Przed cięciem należy przenieść próbki z lodówki o temperaturze czterech stopni Celsjusza do zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na około 10 minut, aby ułatwić pełne cięcie płaszczyznami.

Umieść próbki na mikrotomie i pokrój je na kawałki o grubości sześciu mikrometrów. W tym samym czasie należy użyć mikroskopu, aby obserwować, czy próbki zostały pocięte na oczekiwanym poziomie, aby ułatwić wniknięcie igły strzykawki w tkankę kostną. Po wycięciu dwóch lub trzech pełnych odcinków parafiny z rzędu, przenieś je do tabletkarki, ustawionej na 40 stopni Celsjusza, w celu pełnego rozprężenia.

Następnie usuń skrawki parafiny za pomocą szkiełka podstawowego. Na koniec oznacz slajdy grupami i numerami. Obserwacja nienaruszonej struktury stawu ASCJ pod mikroskopem.

Umieść skrawki w inkubatorze ustawionym na 60 stopni Celsjusza na 40 do 50 minut. Następnie trzykrotnie odwoskuj skrawki ksylenem, zgodnie z opisem w rękopisie. Umieść odwoskowane części w 100% etanolu dwa razy na trzy minuty, a następnie 90% i 80% etanolu na pięć minut każdy.

Następnie myj sekcje podwójnie destylowaną wodą przez pięć minut. Po namoczeniu w Hematoxylinie przez jedną minutę umyj skrawki podwójnie destylowaną wodą, aż staną się bezbarwne. Namocz skrawki w 1% roztworze do różnicowania kwasu etylowego przez 30 sekund i umyj je wodą podwójnie destylowaną.

Po zabarwieniu skrawków 1% roztworem amoniaku i umyciu wodą podwójnie destylowaną, należy zabarwić próbki roztworem barwiącym eozynę przez jedną minutę. A następnie umieść je w 95% i 100% etanolu kolejno po jednej minucie każdy. Na koniec potraktuj skrawki ksylenem cztery przez jedną minutę.

Wysuszyć skrawki na powietrzu i przykryć je szkiełkiem nakrywkowym, po wklejeniu kropli neutralnej żywicy na próbki na szkiełkach. Następnie wykonuj zdjęcia pionowym mikroskopem fluorescencyjnym w jasnym polu przy powiększeniu od pięciu do 20x. Namocz skrawki poplamione hematoksyliną i amoniakiem w 0,05% fast green przez dwie minuty.

Następnie moczy się skrawki w 1% roztworze kwasu octowego przez 30 sekund i 0,1% safraninie przez pięć minut. Następnie przetworzyć szkiełka etanolem i ksylenem, jak pokazano wcześniej. Rób zdjęcia za pomocą pionowego mikroskopu fluorescencyjnego w jasnym polu przy powiększeniu 5x i 20x.

Po trzech dniach, ośmiu tygodniach i 12 tygodniach operacji zerwane grupy więzadeł potrzebowały znacznie więcej czasu, aby przejść przez równoważnię niż grupa pozorowana. Przed operacją długość kroku prawej tylnej stopy była porównywalna między trzema grupami myszy. Jednak 12 tygodni po operacji długość kroku była krótsza w grupie po przecięciu więzadeł niż w grupie pozorowanej.

Przed zabiegiem czas reakcji stóp myszy na nocycepcję termiczną podczas aktywności jest podobny w trzech grupach myszy. Po operacji myszy w grupie z przecięciem więzadła wykazywały dłuższy czas reakcji w porównaniu z grupą pozorowaną. ASCJ prawej tylnej stopy w zerwanych grupach więzadeł wykazywał szorstkie powierzchnie, nagromadzenie osteofitów, zmiany zwyrodnieniowe.

I znacznie wyższy udział objętości kości niż w grupie pozorowanej. Warstwa chrzęstna ASCJ w grupie przeciętej więzadła wykazała nieciągłość i zmniejszoną liczbę chondrocytów. Ponadto wyniki Malkin and Osteoarthritis Research Society International dotyczące myszy z amputacją więzadła były znacznie wyższe niż w grupie pozorowanej.

Kolagen typu drugiego w warstwie chrząstki stawowej ASCJ prawej tylnej stopy grupy pozorowanej był bardziej jednorodny i wyższy niż w dwóch grupach myszy z zerwanymi więzadłami. Badanie to może być wykorzystane do diagnozy i leczenia niestabilności stawu skokowego oraz stanowić eksperymentalne odniesienie do klinicznego leczenia tej choroby.