Model Gut-on-A-Chip do badania osi mikrobiom jelitowy i układu nerwowego

Protokół ten jest istotny, ponieważ po raz pierwszy pozwala na zbadanie wpływu gatunku bakterii na komórki jelitowego układu nerwowego. Ponieważ jelitowy układ nerwowy nie jest łatwo dostępny, model ten pozwala na badanie wpływu mikrobiomu jelitowego na komórki jelitowego układu nerwowego. W przyszłości model ten może zostać wykorzystany do sprawdzenia, jak mikrobiom jelitowy chorych pacjentów wpływa na komórki jelitowego układu nerwowego, na przykład w chorobie Parkinsona.

Możliwym celem w przyszłości byłoby połączenie tego modelu z innymi modelami narządów na chipie w celu zbudowania modelu reprezentatywnego dla osi jelito-mózg. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie, ponieważ protokół obejmuje wiele kroków, a każdy krok ma kluczowe znaczenie dla pomyślnej realizacji tego modelu. Procedurę tę zademonstruje Catherine Sedrani, doktorantka z Laboratorium Ekologii Systemów.

Aby rozpocząć, dokręć, zabezpieczając górną i dolną część zacisku, a następnie przenieś powlekaną i wysuszoną dolną pokrywę z poliwęglanu z kwadratowej szalki Petriego na górę podstawy zacisku, przytrzymując cztery w rogu pokrywy. Użyj sterylnej pęsety, aby umieścić uszczelkę komory nabłonkowej z membraną skierowaną do góry na pokrywie z poliwęglanu. Dopasuj uszczelkę i pokrywę za pomocą, upewniając się, że narożne otwory wlotowe i wylotowe są wyrównane z otworami uszczelki.

Umieść uszczelkę typu sandwich na uszczelce kolagenowej górną stroną skierowaną do góry. A następnie umieść górną pokrywę z poliwęglanu na uszczelce wielowarstwowej. Upewnij się, że zadziory na clamp pokrywa jest wyrównana z otworem wlotowym i wylotowym zespołów membrany oraz że dolnej pokrywy pasują do otworu górnej pokrywy.

Aby zamknąć urządzenie, umieść clamp pokrywa na pokrywie z poliwęglanu i zamknij zatrzaski. W celu zalania przewodów rurowych należy włożyć igły napowietrzające z filtrami w przegrodę każdej butelki dopływającej i odpływowej. Za pomocą czystej, sterylnej pęsety włóż 120-milimetrowe igły do 250-milimetrowych butelek z surowicą i 80-milimetrowe igły do 15-milimetrowych butelek z surowicą.

Włóż 40-milimetrowe igły na końcu każdej rurki do butelki z surowicą odpływową. 40-milimetrowe igły przewodów nabłonkowych i neuronalnych są połączone z tą samą butelką odpływową w celu wyrzucenia pożywki. Przewód rurki bakteryjnej przechodzi do drugiej butelki odpływowej.

Włóż przewody rurkowe pompy do kaset pompy. Ustaw pompę perystaltyczną tak, aby kierowała media z dopływu do butelki odpływowej z prędkością pięciu obrotów na minutę i naciśnij przycisk start, aby uruchomić pompę. Upewnij się, że wszystkie trójdrogowe zawory odcinające przewodów rurowych są otwarte.

Gdy media wpadną do butelek odpływowych, upewnij się, że w przewodach rurowych i punktach połączeń nie ma wycieków ani pęcherzyków powietrza. Gdy wszystkie przewody rurowe wpadną do butelek odpływowych, ustaw natężenie przepływu na dwie prędkości obrotowe, aby podłączyć początkowe urządzenie. Aby podłączyć przewód, należy zamknąć zawory trójdrogowe odcinające, zaczynając od strony odpływowej.

Odłącz krótką rurkę od żeńskiego łącznika przynęty i przymocuj ją do portu wylotowego urządzenia, przesuwając rurkę przez zadzior. Aby zapewnić bezpieczne, szczelne połączenie, wepchnij rurkę całkowicie w dół na złącze, upewniając się, że styka się z pokrywą. Otwórz kran odcinający, gdy jedna linia jest całkowicie podłączona do urządzenia.

Ustaw natężenie przepływu pompy na dwie prędkości obrotowe i zwiększ prędkość pompy do maksymalnie 2.5 obr./min, aby uniknąć wycieków spowodowanych wzrostem ciśnienia. Pozwól pompie zalać komory. Zmniejsz prędkość pompy do 0,5 obr./min, gdy wszystkie komory zostaną wypełnione pożywką do hodowli komórkowych i w urządzeniu nie pozostaną żadne pęcherzyki.

W przypadku komórek nabłonka odłączyć komórki Caco-2 od kolby za pomocą trypsyny EDTA. Zawieś je ponownie w RPMI 1640 plus 10% FBS i policz je w liczniku komórek Neubauera za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanowego. Odwirować zawiesinę komórek Caco-2 przez trzy minuty w temperaturze 300 G i odrzucić supernatant w celu usunięcia pozostałych cykli EDTA.

Ponownie zawieś ogniwa Caco-2 w RPMI 1640 plus 10% FBS, aby uzyskać zawiesinę 0,35 miliona komórek na mililitr. Przenieść 1,5 mililitra zawiesiny komórek Caco-2 do sterylnej strzykawki o pojemności dwóch mililitrów i usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza ze strzykawki. Zamknij trójdrogowe zawory odcinające na rurkach zarówno komory bakteryjnej, jak i neuronalnej i odłącz rurkę od pompy, wyjmując kasety z odpowiednimi rurkami z wirnika.

Otworzyć nakrętkę zaworu odcinającego rurki dopływowej prowadzącej do komory nabłonkowej i przekręcić zawór, aby przekierować przepływ medium z urządzenia do otwartego złącza. Pozwól medium płynąć, aż kropla medium pojawi się na otwartym końcu zaworu odcinającego. Włożyć strzykawkę z komórkami nabłonkowymi do otwartego łącznika, stosując metodę połączenia kropla-kropla, aby zapobiec wprowadzaniu pęcherzyków powietrza podczas wprowadzania.

Przekręcić zawór zaworu odcinającego, aby zatrzymać przepływ pożywki z butelki dopływowej i umożliwić przepływ z podłączonej strzykawki do urządzenia początkowego. Odłącz komorę nabłonkową od pompy i powoli naciśnij strzykawkę, aby zaszczepić komorę nabłonkową 1,5 mililitra zawiesiny komórkowej. Zamknąć zawór zaworu odpływowego i odłączyć strzykawkę.

Zamknij otwarty koniec kranu nakrętką i trzymaj komorę zamkniętą przez co najmniej dwie godziny. W międzyczasie zaszczepij komórki neuronalne. Po wyjęciu urządzenia z inkubatora i wyjęciu przewodów rurowych, powoli otwórz zacisk i zdejmij pokrywę.

Ostrożnie zdejmij górną pokrywę z poliwęglanu. Zbierz pożywkę do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i umieść ją na lodzie. Delikatnie zdejmij uszczelkę wielowarstwową, jednocześnie zbierając pożywkę z komory nabłonkowej bez dotykania warstwy komórek.

Umieść uszczelkę kanapkową na kwadratowej szalce Petriego i dodaj sterylny 0,9% roztwór chlorku sodu i wody do komory bakteryjnej, aż komora zostanie całkowicie pokryta. Powoli zdejmij uszczelkę kolagenową, jednocześnie zbierając pożywkę z komory neuronalnej. Po przeniesieniu pożywki do mikroprobówki wirówkowej umieść probówki na lodzie.

Umieść uszczelkę kolagenową w kwadratowym naczyniu i delikatnie dodaj kilka mililitrów PBS do warstwy Caco-2, aż warstwa komórkowa zostanie całkowicie pokryta. Umieść dolną pokrywkę z poliwęglanu na kwadratowej szalce Petriego i delikatnie dodaj około dwóch mililitrów PBS na komórki neuronalne, aby nie wyschły podczas procesu pobierania próbek. Odwirowywać probówkę z pożywką przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po przeniesieniu supernatantów z każdej probówki do nowej mikroprobówki wirówkowej, należy ją natychmiast umieścić na suchym lodzie. Liczba CFU została oceniona dla dwóch różnych początkowych konfiguracji urządzeń. L.reuteri hodowany jednocześnie z Caco-2 i L.reuteri w ludzkim urządzeniu do przesłuchu mikrobiologicznego.

W obu konfiguracjach liczba CFU znacznie różniła się od inokulum HuMix i pobranych komórek, co wskazuje na wzrost komórek bakteryjnych wewnątrz początkowego urządzenia. Aby ocenić, czy hodowla neuronów jelitowych w urządzeniu zmienia fenotyp komórki, obserwowano ich ogólną morfologię za pomocą mikroskopu z kontrastem odwróconej fazy. Ustanowienie zlewającej się sieci neuronalnej wskazywało, że komórki dobrze przyczepiły się do pokrytej poliwęglanowej pokrywy urządzeń.

Krawędź między zlewającą się siecią neuronalną a spiralą wyznaczoną uszczelką była wyraźnie widoczna. Potencjał neurohumików polega na udzieleniu odpowiedzi na pytania, które wcześniej były trudne do rozwiązania, dotyczące interakcji między mikrobiomem ludzko-jelitowym a jelitowym układem nerwowym ze względu na brak reprezentatywnego modelu.