Name: Model Gut-on-A-Chip do badania osi mikrobiom jelitowy i układu nerwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Odkryj model neuroHuMiX gut-on-a-chip do badania interakcji między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym. Ta metoda umożliwia analizę wpływu bakterii na neurony w chorobach takich jak Parkinson.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Jaredowi Sterneckertowi za dostarczenie nam komórek z linii K7. Pragniemy również podziękować wieloletnim współpracownikom, dr Fredericowi Zenhausernowi i Matthew W. Barretowi z University of Arizona, za ich pomoc w aspektach inżynieryjnych. Chcielibyśmy również podziękować dr Valentinie Galatie za pomoc w zaprojektowaniu schematycznego przedstawienia neuroHuMiX. Projekt ten otrzymał dofinansowanie Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (umowa o grant 863664). Rysunek 1 został częściowo utworzony za pomocą Biorender.com.

<ol><li>Heintz-Buschart, A., Wilmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+microbiome%3A+function+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Human gut microbiome: function matters.</a> Trends in Microbiology. 26 (7), 563-574 (2018).</li>
<li>Toor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysbiosis+disrupts+gut+immune+homeostasis+and+promotes+gastric+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dysbiosis disrupts gut immune homeostasis and promotes gastric diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2432(2019).</li>
<li>Braak, H., de Vos, R. A. I., Bohl, J., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+%CE%B1-synuclein+immunoreactive+inclusions+in+Meissner%27s+and+Auerbach%27s+plexuses+in+cases+staged+for+Parkinson%27s+disease-related+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Gastric α-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology.</a> Neuroscience Letters. 396 (1), 67-72 (2006).</li>
<li>Schmit, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fibre+deprivation+and+bacterial+curli+exposure+shift+gut+microbiome+and+exacerbate+Parkinson%27s+disease-like+pathologies+in+an+alpha-synuclein-overexpressing+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Dietary fibre deprivation and bacterial curli exposure shift gut microbiome and exacerbate Parkinson's disease-like pathologies in an alpha-synuclein-overexpressing mouse.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Fritz, J. V., Desai, M. S., Shah, P., Schneider, J. G., Wilmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+meta-omics+to+causality%3A+experimental+models+for+human+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">From meta-omics to causality: experimental models for human microbiome research.</a> Microbiome. 1 (1), 14(2013).</li>
<li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-chip%3A+Recent+breakthroughs+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22BioMedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-chip: Recent breakthroughs and future prospects.</a> BioMedical Engineering Online. 19 (1), 9(2020).</li>
<li>May, S., Evans, S., Parry, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%2C+organs-on-chips+and+other+systems%2C+and+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Organoids, organs-on-chips and other systems, and microbiota.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 1 (4), 385-400 (2017).</li>
<li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nature Communications. 7, 11535(2016).</li>
<li>Greenhalgh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+in+vitro+and+in+silico+modeling+delineates+the+molecular+effects+of+a+synbiotic+regimen+on+colorectal-cancer-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated in vitro and in silico modeling delineates the molecular effects of a synbiotic regimen on colorectal-cancer-derived cells.</a> Cell Reports. 27 (5), 1621-1632 (2019).</li>
<li>Mao, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+metabolic+links+between+the+murine+microbiome+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Genetic and metabolic links between the murine microbiome and memory.</a> Microbiome. 8 (1), 53(2020).</li>
<li>Moysidou, C. M., Owens, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+modelling+the+human+microbiome-gut-brain+axis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Advances in modelling the human microbiome-gut-brain axis in vitro.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (1), 187-201 (2021).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+propagation+of+pathologic+%CE%B1-synuclein+from+the+gut+to+the+brain+models+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transneuronal propagation of pathologic α-synuclein from the gut to the brain models Parkinson's disease.</a> Neuron. 103 (4), 627-641 (2019).</li>
<li>Hugenholtz, F., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+human+intestinal+microbiota+research%3A+a+critical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).</li>
<li>Marshall, J. J., Mason, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+vs+man%3A+Organoid+models+of+brain+development+%26+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse vs man: Organoid models of brain development & disease.</a> Brain Research. 1724, 146427(2019).</li>
<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>Sedrani, C., Wilmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+hypothesis-driven%2C+personalized+microbiome+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Toward hypothesis-driven, personalized microbiome screening.</a> Cell Reports Methods. 2 (1), 100139(2022).</li>
</ol>

P.W. oświadcza, że jest wymieniony jako wynalazca na patentach PCT/EP2013/056607, PCT/EP2016/062024, PCT/US2017/061602 i PCT/EP2019/081424. P.W., C.S. i L.G. oświadczają, że są wymienieni jako wynalazcy na LU503075 patentowej.

Obecnie wiadomo, że ludzki mikrobiom jelitowy wpływa na zdrowie i choroby gospodarza. Pomimo wiedzy sugerującej znaczenie naszego mikrobiomu, zwłaszcza w zaburzeniach neurologicznych, takich jak choroba Alzheimeraczy Parkinsona 3,13, pozostaje w dużej mierze nieznane, w jaki sposób mikrobiom jelitowy oddziałuje na jelitowy układ nerwowy, a następnie na mózg.
Reprezentatywny model do badania interakcji między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym był do tej pory niedostępny. Badania dotyczące osi jelitowo-mózgowej tradycyjnie przeprowadza się przy użyciu modeli mysich13. Myszy i ludzie dzielą 85% swoich sekwencji genomowych14, ale istnieją znaczące różnice, które należy wziąć pod uwagę przy porównywaniu myszy z ludźmi. Jeśli chodzi o jelita, należy zauważyć, że w porównaniu z ludźmi myszy są wyłącznie roślinożercami. W rezultacie ich przewód pokarmowy różni się długością i cechami, takimi jak "opróżnianie żołądka"14. Mózgi myszy wykazują również istotne różnice, przy czym ogólna struktura między myszami i ludźmi jest różna15. Co ważne, ludzie mają dłuższe czasy cyklu komórkowego neuronalnych komórek progenitorowych15. W związku z tym ważne jest opracowanie reprezentatywnych modeli, które obejmują komórki pochodzenia ludzkiego, w tym komórki jelitowe i neuronalne5. W tym kontekście opracowanie bardziej powtarzalnych badań za pomocą modeli in vitro zmniejsza potrzebę korzystania z modeli zwierzęcych i poprawia odtwarzalność.
neuroHuMiX to zaawansowana wersja poprzedniego modelu HuMiX9. HuMiX to model typu gut-on-a-chip, który umożliwia proksymalne i reprezentatywne kohodowle komórek nabłonkowych i bakteryjnych. Komunikacja komórka-komórka jest możliwa poprzez proksymalną kokulturę i dyfuzję wydzielanych czynników i metabolitów przez błony półprzepuszczalne. Jednak, aby rozszerzyć użyteczność początkowego urządzenia do badania środowiska jelitowego człowieka, konieczne jest wprowadzenie dodatkowego typu komórek. Aby rozwiązać ten problem, neuroHuMiX, opracowany wraz z wprowadzeniem EN pochodzących z iPSC, umożliwia proksymalną kokulturę bakterii, komórek nabłonka jelitowego i EN. Uzyskany w ten sposób model in vitro pozwala odpowiedzieć na pytania dotyczące mikrobiomu jelitowego człowieka w odniesieniu do układu nerwowego człowieka. Wspólna hodowla różnych typów komórek, zwłaszcza kokultur komórek ssaków i bakterii, wiąże się z kilkoma wyzwaniami, w tym utratą żywotności, słabą adhezją i ogólną utratą konfluencji16. W tym przypadku wykazaliśmy, że w ramach tego urządzenia jesteśmy w stanie wspólnie hodować trzy różne typy komórek w tym samym systemie, utrzymując jednocześnie wysoką żywotność komórek.
Krytycznym krokiem w protokole jest zapewnienie zbiegu komórek nerwowych - 80%-90% zbiegu i żywotności komórek - przed zaszczepieniem urządzenia. Ponieważ nie jest możliwa ocena wzrostu komórek podczas biegu, niezwykle ważne jest, aby upewnić się, że komórki zlewają się i dobrze rosną przed wprowadzeniem ich do modelu. Chociaż może to być czynnik ograniczający, ogólna żywotność i zbieżność obserwowana w urządzeniu jest na ogół wysoka.
Urządzenie jest połączone przewodami rurowymi z pompą perystaltyczną. Każda komora komórkowa ma swoją specyficzną linię przewodów. Rurka składa się z rurki pompy, która umożliwia użycie pompy perystaltycznej do perfuzji medium, a także rurki łączącej rurkę pompy z urządzeniem oraz rurki łączącej urządzenie z butelkami odpływowymi/odpadowymi. Porty do pobierania próbek znajdują się przed i za urządzeniem, aby umożliwić inokulację i pobieranie próbek pożywki odpływowej. Każda komora może być podłączona do innego podłoża, co pozwala na uzyskanie najlepszych warunków hodowli dla każdego typu komórek. Każda komora może być otwierana lub zamykana w zależności od konkretnych potrzeb w zakresie dostarczania medium. W urządzeniu komora neuronalna pozostaje zamknięta przez większość eksperymentu, podczas gdy komory bakteryjne i nabłonkowe są otwarte przez cały czas, co oznacza, że otrzymują świeżą pożywkę przez cały okres eksperymentu. Aby mieć pewność, że medium przepływa bez zakłóceń, ważne jest, aby nie pozostało powietrze w przewodach, złączach ani w urządzeniu. Dlatego ważne jest, aby najpierw pozwolić urządzeniom pracować przez kilka minut na etapie zalewania. To często rozwiązuje problem. Jeśli nie, jedną z pozostałych linii, które opadają, można zamknąć na krótki czas, zamykając trójdrogowy kran odpływu. Powoduje to przekierowanie medium do linii z pęcherzykiem powietrza, rozwiązując w ten sposób problem poprzez wypychanie pęcherzyka na zewnątrz przez rurkę.
W każdym eksperymencie z hodowlą komórkową kluczowym elementem jest pożywka, w której każdy typ komórki ma swoje odpowiednie podłoże. W konfiguracji kohodowli pożywka musi być kompatybilna nie tylko z typem komórek rosnących w niej, ale także z innymi typami komórek w kokulturze. Nie inaczej jest w przypadku urządzenia, co stanowi dodatkowe wyzwanie, ponieważ mamy trzy różne przedziały z trzema różnymi typami komórek wewnątrz - komórkami bakteryjnymi, nabłonkowymi i neuronalnymi. Wykazaliśmy jednak, że poprzez modyfikację pożywki bakteryjnej - z dodatkiem 5% MRS do RPMI 1640 z 10% FBS - wszystkie typy komórek, w szczególności komórki bakteryjne i nabłonkowe, mogą być z powodzeniem hodowane w systemie. Jednak w urządzeniu różne typy komórek są hodowane w pobliżu siebie, a zatem nie są ze sobą w bezpośrednim kontakcie. Mimo że nie jest to w pełni reprezentatywne dla bezpośredniego kontaktu między komórkami w ludzkim jelicie, a zatem stanowi ograniczenie, proksymalny i reprezentatywny warunek kohodowli jest mocną stroną dla dalszych analiz. Wymiana czynników rozpuszczalnych między różnymi komorami i typami komórek; W związku z tym komórki nadal wchodzą ze sobą w interakcje. Dodatkowo, fakt, że typy komórek mogą być zbierane i analizowane oddzielnie, pozwala nam badać wpływ zdrowego i/lub chorego mikrobiomu na różne typy komórek (w tym komórki neuronalne), a tym samym określać/odzyskiwać odczyty specyficzne dla typu komórki. Innym ograniczeniem jest to, że morfologia komórek nie może być śledzona podczas przebiegu eksperymentalnego, ponieważ urządzenie można otworzyć i sprawdzić komórki dopiero pod koniec każdego eksperymentu.
Zgodnie z naszą wiedzą, neuroHuMiX jest pierwszym modelem typu gut-on-a-chip zawierającym EN. Jest to krok w kierunku wyjaśnienia komunikacji między mikrobiotą jelitową a jelitowym układem nerwowym. Jest to model pozwalający na badanie wzajemnych oddziaływań między gatunkami bakterii, warstwą nabłonkową i EN. Jego konstrukcja pozwala nam badać wymianę rozpuszczalnych czynników wydzielanych przez różne typy komórek i ich wzajemny wpływ. Idąc dalej, ważne byłoby, aby wewnątrz urządzenia znajdowały się nie tylko EN pochodzące z iPSC, ale także komórki nabłonkowe pochodzące z iPSC, aby przekształcić urządzenie w spersonalizowany model. Co ważne, ten spersonalizowany model może być wykorzystany do testowania pre-, pro- i synbiotyków10,11 oraz potencjalnie do opracowania spersonalizowanych badań przesiewowych i podejść terapeutycznych17. Spersonalizowany projekt neuroHuMiX może ostatecznie rzucić światło na "ciemną materię" ludzkiego mikrobiomu jelitowego i jej interakcje z układem nerwowym na osi mikrobiomu jelitowego i układu nerwowego, torując drogę do oceny terapeutycznej i interwencji.
Możemy wywnioskować, że możliwość posiadania jelita na chipie, w tym jelitowego układu neuronalnego, ma kluczowe znaczenie dla postępów w badaniu i zrozumienia interakcji wzdłuż osi mikrobiomu jelitowego i układu nerwowego. NeuroHuMiX pozwala nam badać wpływ gatunków bakterii na komórki gospodarza i daje nam dobrą podstawę do dalszego ulepszania modelu w jeszcze bardziej reprezentatywny fizjologicznie sposób.

Mikrobiom jelitowy człowieka odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie człowieka. Był intensywnie badany przez ostatnie półtorej dekady, a jego potencjalna rola w modulowaniu zdrowia i choroby została już ustalona1. Postuluje się, że zaburzenie mikrobiomu prowadzące do niezrównoważonej społeczności drobnoustrojów (dysbiozy) jest zaangażowane w patogenezę wielu przewlekłych zaburzeń, takich jak otyłość, nieswoiste zapalenie jelit i rak jelita grubego, a nawet choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona2,3.
Chociaż mikrobiom jelitowy człowieka jest związany ze schorzeniami neurologicznymi, nadal nie jest jasne, w jaki sposób mikrobiom jelitowy komunikuje się z jelitowym układem nerwowym i wpływa na niego. Ponieważ ludzki jelitowy układ nerwowy nie jest łatwo dostępny do natychmiastowego badania, do tej pory w eksperymentach wykorzystano modele zwierzęce4. Biorąc jednak pod uwagę widoczne różnice między modelami zwierzęcymi a ludzkimi5, rozwój modeli in vitro naśladujących ludzkie jelita jest natychmiastowym zainteresowaniem. W tym kontekście, rozwijająca się i rozwijająca się dziedzina ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) pozwoliła nam uzyskać reprezentatywne neurony jelitowe (ENs)6. EN pochodzące z iPSC pozwalają na badanie jelitowego układu nerwowego w modelach hodowli in vitro, takich jak wkładki do hodowli komórkowych, organoidy lub narządy na chipie7,8.
Model przesłuchu ludzko-mikrobiologicznego (HuMiX) to model jelita na chipie, naśladujący ludzki <[>gut9. Początkowy model HuMiX (zwany dalej urządzeniem początkowym) zawierał komórki nabłonkowe (Caco-2) i komórki bakteryjne10,11. Jednakże, aby zbadać związek między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym, do systemu wprowadzono również ENs6 pochodzące z iPSC (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Proksymalna kokultura komórek neuronalnych, nabłonkowych i bakteryjnych umożliwia indywidualną analizę różnych typów komórek i badanie interakcji między różnymi typami komórek w środowisku naśladującym ludzkie jelito.
W ostatnich latach poczyniono postępy w rozwoju modeli do badania narządów w bardziej fizjologicznie reprezentatywny sposób, używając modeli organów na chipie (np. gut-on-a-chip). Modele te są bardziej reprezentatywne dla środowiska jelitowego człowieka ze względu na ciągłe dostarczanie składników odżywczych i usuwanie odpadów, a także monitorowanie w czasie rzeczywistym, na przykład poziomu tlenu lub integralności bariery8,12. Modele te umożliwiają w szczególności badanie wpływu bakterii jelitowych na komórki gospodarza. Jednak, aby móc wykorzystać narządy na chipie do badania wzajemnych powiązań między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym, komórki neuronalne muszą zostać zintegrowane z takimi systemami. W związku z tym celem dalszego rozwoju HuMiX i stworzenia systemu neuroHuMiX (zwanego dalej urządzeniem) było opracowanie modelu jelita na chipie, który obejmuje komórki neuronów jelitowych w proksymalnej kohodowli z komórkami nabłonka jelitowego i bakteriami.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10712</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula napowietrzająca (długość: 1,10 średnica: 30 mm)</td><td>VWR (B.Braun)</td><td>BRAU4190050</td><td></td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>Merck Millipore</td><td>1.01614.1000</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa</td> gwinciarka do zaciskania<td>&auml; tebau Ochs</td><td>102050</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement Minus Witamina A (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Bakteryjna błona komórkowa, wielkość porów: 1 i mikro; m</td><td>VWR (Whatman)</td><td>515-2084</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa Caco-2</td><td>DSMZ</td><td>ACC169</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek i Analizator CASY</td><td>OMNI Life Sceince</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR</td><td>Axon Mechem BV</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, Rat Tail</td><td>Invitrogen</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plates</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS Broth</td><td>BD Biosciences</td><td>288130</td><td></td></tr><tr><td>Discofix 3-drogowy kran</td><td>B. Braun</td><td>BRAU40951111</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, bez glutaminy</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco, D-PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>Female Łącznik Luer Lock do Barb</td><td>Qosina</td><td>11733</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu, FBS</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Błona komórek ludzkich, wielkość porów: 50 nm</td><td>Sigma Aldrich (GE Healthcare)</td><td>WHA111703</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka HuMiX Kolagen</td><td>Auer Precision</td><td>216891-003</td><td></td></tr><tr><td>HuMiX Uszczelka Kanapka Dolna</td><td>precyzja Auera</td><td>216891-002</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka HuMiX Sandwich Top</td><td>Auer Precision</td><td>216891-001</td><td></td></tr><tr><td>iPSC</td><td>Max Planck Institute for Molecular Biomedicine</td><td>K7 line</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Laminin z Engelbreth-Holmswarm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>Limosilactobacillus reuteri</td><td>ATCC</td><td>23272</td><td></td></tr><tr><td>Żywy/martwy BacLight Zestaw żywotności bakterii</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>Męski Luer z blokadą spinu do Barb</td><td>Qosina</td><td>11735</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Marprene (0,8 mm x 1,6 mm)</td><td>Watson-Marlow</td><td>902.0008.J16</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matryca z kwalifikacją hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Mucyna, z żołądka świni</td><td>Suplement Sigma Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>N2 (100x)</td><td>Igła Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>(długość: 120 mm; średnica: 0,80 mm)</td><td>B.Braun (kod koloru: zielony)</td><td>466 5643</td><td></td></tr><tr><td>Igła (długość: 40 mm; średnica: 0,70 mm)</td><td>Henke Sass Wolf (kod koloru:)</td><td>4710007040</td><td></td></tr><tr><td>Igła (długość: 80 mm; średnica: 0,60 mm)</td><td>B.Braun (kod koloru: niebieski)</td><td>466 5635</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anty-ludzkie przeciwciało CD49d</td><td>Biolegend</td><td>304314</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Watson-Marlow</td><td>205CA</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-ornityny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywki z poliwęglanu (HuMiX)</td><td>University of Arizona</td><td>HuMiX 1.0 / 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RLT Bufor (RNeasy Minikit)</td> <td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>72400-021</td><td></td></tr><tr><td>SB431542, inhibitor ALK</td><td>Abcam</td><td>ab120163</td><td></td></tr><tr><td>Butelki z surowicą</td><td>Glasger&auml; tebau Ochs</td><td>102091</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD Biosciences</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dichlorowodorek</td><td>R& Systemy D</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

model gut-on-a-chip do badania osi mikrobiom jelitowy i układu nerwowego

A Gut-on-a-Chip Model to Study the Gut Microbiome-Nervous System Axis

Ciało ludzkie jest skolonizowane przez co najmniej taką samą liczbę komórek mikrobiologicznych, jak składa się z komórek ludzkich, a większość tych mikroorganizmów znajduje się w jelitach. Chociaż wzajemne oddziaływanie między mikrobiomem jelitowym a gospodarzem zostało szeroko zbadane, sposób, w jaki mikrobiom jelitowy oddziałuje z jelitowym układem nerwowym, pozostaje w dużej mierze nieznany. Do tej pory nie istnieje fizjologicznie reprezentatywny model in vitro do badania interakcji mikrobiomu jelitowego z układem nerwowym. 
Aby wypełnić tę lukę, rozwinęliśmy model przesłuchu ludzko-mikrobiologicznego (HuMiX) jelita na chipie, wprowadzając do urządzenia indukowane pluripotencjalne neurony jelitowe pochodzące z komórek macierzystych. Powstały w ten sposób model "neuroHuMiX" umożliwia kohodowlę komórek bakteryjnych, nabłonkowych i neuronalnych w kanałach mikroprzepływowych, oddzielonych półprzepuszczalnymi błonami. Pomimo separacji różnych typów komórek, komórki mogą komunikować się ze sobą za pośrednictwem rozpuszczalnych czynników, zapewniając jednocześnie możliwość badania każdego typu komórek z osobna. Ta konfiguracja pozwala na pierwszy wgląd w to, jak mikrobiom jelitowy wpływa na komórki neuronów jelitowych. Jest to kluczowy pierwszy krok w badaniu i zrozumieniu osi mikrobiomu jelitowego człowieka i układu nerwowego.

W układzie neuroHuMiX zastosowano kokulturę trzech różnych typów komórek: bakteryjnych, nabłonkowych oraz neuronalnych (Rysunek 1). Aby upewnić się, że wszystkie komórki były żywotne, przeprowadzono odpowiednie testy dla każdego z typów komórek. Przykładowo, w przypadku komórek bakteryjnych wykonano oznaczenie CFU, dla komórek nabłonkowych przeprowadzono analizy liczby komórek oraz ich żywotności, natomiast komórki neuronalne oceniono poprzez analizy mikroskopowe.
<img alt="Schemat organu na chipie przedstawiający komory bakteryjną, nabłonkową i neuronalną oraz układ pompy perystaltycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie neuroHuMiX i jego układu eksperymentalnego. (A) Trzy komory są utrzymywane między dwiema pokrywami z PC, aby pozostały zamknięte. Każda komora jest wypełniona specyficzną pożywką dla hodowanych w niej komórek. Poszczególne komory są oddzielone membranami półprzepuszczalnymi, które umożliwiają komunikację komórkową poprzez rozpuszczalne czynniki przenikające przez membrany. (B) Przedstawienie układu neuroHuMiX. Każda komora jest połączona z innymi butelkami z pożywkami. W przypadku komory bakteryjnej, przez pierwsze 12,5 dnia komora jest połączona z RPMI + 10% FBS, a następnie w ciągu ostatnich 36 h pożywka zostaje zmieniona na RPMI + 10% FBS + 5% MRS. Skróty: PC = poliwęglan; P/L/F = poli-L-ornityna/laminina/fibronektyna; RPMI = pożywka do hodowli komórkowej Roswell Park Memorial Institute; MRS = pożywka De Mana, Rogosy i Shapre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby określić, czy komórki prawidłowo przylgnęły, po otwarciu urządzeń oceniono powstanie warstwy komórek na membranie pokrytej kolagenem (Rysunek 6A). W celu upewnienia się, że komórki w urządzeniu były żywotne, wykonano pomiar automatycznym licznikiem komórek (Rysunek 6B) oraz pomiar liczby komórek z użyciem testu wykluczania trypanu niebieskiego (Rysunek 6C). Testy przeprowadzono na komórkach Caco-2 z trzech różnych konfiguracji HuMiX: (i) Caco-2 w kulturze z EN, (ii) Caco-2 w kulturze z L. reuteri oraz (iii) urządzenie obejmujące kokulturę wszystkich trzech typów komórek. Analiza statystyczna z użyciem jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) nie wykazała istotnych różnic między typami komórek, co sugeruje, że komórki Caco-2 pozostały żywotne we wszystkich tych początkowych konfiguracjach urządzeń i warunkach badanych w niniejszym badaniu. Podkreśla to fakt, że gęstość bakterii osiągnięta podczas kokultury L. reuteri i dwóch ludzkich typów komórek nie wykazuje efektów cytotoksycznych wobec komórek ludzkich.
<img alt="Mikrofluidyczne urządzenie spiralne do sortowania komórek; analiza żywotności za pomocą Casy i wykresy pudełkowe błękitu trypanu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Ocena komórek Caco-2 na membranie powlekanej kolagenem. (A) Warstwa komórek Caco-2 na membranie powlekanej kolagenem po otwarciu. Strzałka wskazuje membranę powlekaną kolagenem, która jest otoczona przerywanym okręgiem. Komórki Caco-2 rosły na membranie w kształcie spirali. Żywotność komórek Caco-2 po 14 dniach w systemie HuMiX. Liczbę komórek uzyskano za pomocą (B) automatycznego licznika komórek oraz (C) testu wykluczania błękitu trypanu. Liczbę komórek Caco-2 określono dla różnych układów hodowli w urządzeniu początkowym: kokultury z neuronami jelitowymi (ENs) (czarny), kokultury z L. reuteri (pomarańczowy) oraz w urządzeniu (ENs i L. reuteri) (niebieski). Przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji (one-way ANOVA), która wykazała brak istotnych różnic między poszczególnymi układami hodowli (one-way ANOVA, p = 0.1234 [ns]; słupki błędów oznaczają błąd standardowy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Aby móc hodować L. reuteri w przypadku komórek ssaków w pierwszej kolejności zoptymalizowano i dostosowano pożywki hodowlane do zastosowania w urządzeniu. Ustalono, że mieszanina MRS w stężeniu 5% w pożywce RPMI 1640 (uzupełnionej o 10% FBS) była optymalna dla wzrostu L. reuteri, nie wykazując jednocześnie cytotoksyczności wobec komórek ssaków użytych w tych analizach. Następnie wykonano zliczanie CFU w celu oceny wzrostu L. reuteri po hodowli w urządzeniu przez 24 h. Liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) oceniono dla dwóch różnych początkowych konfiguracji urządzenia (Rycina 7)-L. reuteri współhodowane z Caco-2 i L. reuteri w urządzeniu. W obu układach liczba CFU różniła się istotnie od liczby w inokulum HuMiX oraz od liczby zebranych komórek (jednoczynnikowa ANOVA, p = 0,0002), co wskazuje na wzrost komórek bakteryjnych wewnątrz początkowego urządzenia.
<img alt="Porównanie wzrostu bakterii, wykres słupkowy, analiza CFU, istotność statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Liczba CFU Limosilactobacillus reuteri w inokulum (rozcieńczonym 1:100 000) oraz po 24 h w HuMiX. Dwie różne konfiguracje: komórki Caco-2 w ko-kulturze z L. reuteri oraz urządzenie. Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) wykazuje istotną różnicę (p = 0,0002 [***]) pomiędzy inokulum a zebranymi komórkami, co oznacza, że bakterie rosną wewnątrz HuMiX. Słupki błędów wskazują błąd standardowy. Skróty: CB.HX = Caco-2 bacteria HuMiX; nHX = neuroHuMiX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby ocenić, czy hodowla EN w urządzeniu zmienia fenotyp komórek, za pomocą odwróconego mikroskopu fazowego zaobserwowano ogólną morfologię EN. Na tym etapie oceniono zarówno stopień konfluencji, jak i morfologię EN. Powstanie konfluentnej sieci neuronalnej wskazywało na dobrą adhezję komórek do pokrywy PC powleczonego urządzenia. Co istotne, podkreśla to fakt, że komórki rosły w ko-kulturze z Caco-2 oraz L. reuteri. Granica między konfluentną siecią neuronalną a spiralą wyznaczoną przez uszczelkę była wyraźnie widoczna (Ryc. 8).
<img alt="Mikroskopowy obraz hodowli komórkowej; badanie analizy komórkowej; pasek skali 200 µm; do użytku badawczego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Neurony jelitowe po 14 dniach hodowli w urządzeniu. Po lewej stronie obrazu neurony wyrosły w konfluentną warstwę na spirali. Krawędź między warstwą neuronalną a przestrzenią bez komórek stanowi krawędź spirali; powiększenie 10x, pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Komponenty urządzenia mikrofluidycznego do analizy przepływu; przezroczyste kwadratowe płytki z okrągłymi wlotami i wylotami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Pokrywki stosowane w urządzeniu. Zdjęcia przedstawiają górną (lewo) i dolną (prawo) pokrywkę z PC. Każdy bok pokrywki z PC ma długość 6.4 cm. Skrót: PC = poliwęglan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Projekt chipa mikrofluidycznego, spiralny wzór kanału, schemat eksperymentalny do badania dynamiki płynów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Uszczelka komory nabłonkowej na dolnej pokrywie z PC. Widok z góry uszczelki komory nabłonkowej umieszczonej na dolnej pokrywie z PC (po lewej) oraz widok z dołu (po prawej) pokazujący dopasowanie uszczelki komory nabłonkowej do wlotów i wylotów dolnej pokrywy z PC. Każdy bok uszczelek, jak i pokrywy z PC, ma wymiar 6,4 cm. Skrót: PC = poliwęglan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Montaż urządzenia mikrofluidycznego przedstawiający warstwowe komponenty ze spiralnymi kanałami do badań nad dynamiką płynów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Montaż urządzenia. (A) Poszczególne części do montażu HuMiX: (1) dolna pokrywa PC; (2) uszczelka z mikroporowatą membraną powleczoną kolagenem, umieszczona na górze (1); (3) uszczelka warstwowa z nanoporowatą membraną powleczoną mucyną pomiędzy nimi, umieszczona na górze (2); (4) górna pokrywa PC umieszczona na górze (3). Każdy bok uszczelek i pokryw PC ma wymiar 6,4 cm. (B) Wszystkie części z (A) ułożone razem. (C,D) Zmontowane urządzenie – widok z góry (lewo) i z boku (prawo). Element B jest umieszczany w systemie zaciskowym w celu zamknięcia układu. (C) Każdy bok górnego zacisku ma wymiar 8 cm. Skrót: PC = poliwęglan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat zestawu przewodów medycznych, części i złączy dla systemu transferu cieczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Części potrzebne do stworzenia linii przewodów oraz zmontowana linia przewodów dla jednej komory. (A) Różne elementy do budowy linii przewodów: a. linia przewodów pompy; b. trójdrożny kranik; c. igła 40 mm; d. igła 80 mm; e. igła 120 mm; f. długa linia przewodów (20 cm); g. krótka linia przewodów (8 cm); h. złącze Luer męskie; i. złącze Luer żeńskie; j. adapter. (B) Zmontowana linia przewodów dla komory bakteryjnej lub nabłonkowej. W przypadku komory neuronalnej igłę 120 mm należałoby zamienić na igłę 80 mm. (C) Zawór trójdrożnego kranika przekręcony w celu przekierowania przepływu medium z urządzenia do „otwartego złącza” i zamknięcia komory. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dzień</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>4</td>
			<td>6</td>
			<td>8</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">Skład pożywki</td>
			<td>100% E6</td>
			<td>100% E6</td>
			<td>75% E6</td>
			<td>50% E6</td>
			<td>25% E6</td>
			<td>100% N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ LDN</td>
			<td>+ LDN</td>
			<td>25% N2</td>
			<td>50% N2</td>
			<td>75% N2</td>
			<td>+ LDN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ LDN</td>
			<td>+ LDN</td>
			<td>+ LDN</td>
			<td>+ SB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>+ CHIR</td>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ CHIR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>+ CHIR</td>
			<td>+ CHIR</td>
			<td>+ CHIR</td>
			<td>+ RA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>+ RA</td>
			<td>+ RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cząsteczka</td>
			<td>stężenie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN</td>
			<td>100 nM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB</td>
			<td>10 µM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR</td>
			<td>3 µM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas retinowy (RA)</td>
			<td>1 µM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład pożywek.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pożywki</td>
			<td>Komponenty (stężenia wymienione w tabeli materiałów)</td>
			<td>Objętość (ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">pożywka N2 (50 ml)</td>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suplement N2</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina/Streptomycyna</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nieesencjalne aminokwasy</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Pożywka N2B27/ENS (50 ml)</td>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suplement N2</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina/Streptomycyna</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-A</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Składy pożywek.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Temperatura sterylizacji (°C)</td>
			<td>116</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas sterylizacji (min)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas schnięcia (min)</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rośliny strączkowe</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura końcowa (°C)</td>
			<td>99</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Cykl autoklawowania HuMiX. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Obroty na minutę (rpm)</td>
			<td>Średnia szybkość przepływu (µL/min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>180</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Prędkości przepływu pompy perystaltycznej.

neuroHuMiX to zaawansowany model jelita na chipie do badania interakcji komórek bakteryjnych, nabłonkowych i neuronalnych w proksymalnych i reprezentatywnych warunkach wspólnej hodowli. Model ten pozwala na rozwikłanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw komunikacji między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym.

Model Gut-on-A-Chip do badania osi mikrobiom jelitowy i układu nerwowego

The human body is colonized by at least the same number of microbial cells as it is composed of human cells, and most of these microorganisms are located ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ po raz pierwszy pozwala na zbadanie wpływu gatunku bakterii na komórki jelitowego układu nerwowego. Ponieważ jelitowy układ nerwowy nie jest łatwo dostępny, model ten pozwala na badanie wpływu mikrobiomu jelitowego na komórki jelitowego układu nerwowego. W przyszłości model ten może zostać wykorzystany do sprawdzenia, jak mikrobiom jelitowy chorych pacjentów wpływa na komórki jelitowego układu nerwowego, na przykład w chorobie Parkinsona.Możliwym celem w przyszłości byłoby połączenie tego modelu z innymi modelami narządów na chipie w celu zbudowania modelu reprezentatywnego dla osi jelito-mózg. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie, ponieważ protokół obejmuje wiele kroków, a każdy krok ma kluczowe znaczenie dla pomyślnej realizacji tego modelu. Procedurę tę zademonstruje Catherine Sedrani, doktorantka z Laboratorium Ekologii Systemów.Aby rozpocząć, dokręć, zabezpieczając górną i dolną część zacisku, a następnie przenieś powlekaną i wysuszoną dolną pokrywę z poliwęglanu z kwadratowej szalki Petriego na górę podstawy zacisku, przytrzymując cztery w rogu pokrywy. Użyj sterylnej pęsety, aby umieścić uszczelkę komory nabłonkowej z membraną skierowaną do góry na pokrywie z poliwęglanu. Dopasuj uszczelkę i pokrywę za pomocą, upewniając się, że narożne otwory wlotowe i wylotowe są wyrównane z otworami uszczelki.Umieść uszczelkę typu sandwich na uszczelce kolagenowej górną stroną skierowaną do góry. A następnie umieść górną pokrywę z poliwęglanu na uszczelce wielowarstwowej. Upewnij się, że zadziory na clamp pokrywa jest wyrównana z otworem wlotowym i wylotowym zespołów membrany oraz że dolnej pokrywy pasują do otworu górnej pokrywy.Aby zamknąć urządzenie, umieść clamp pokrywa na pokrywie z poliwęglanu i zamknij zatrzaski. W celu zalania przewodów rurowych należy włożyć igły napowietrzające z filtrami w przegrodę każdej butelki dopływającej i odpływowej. Za pomocą czystej, sterylnej pęsety włóż 120-milimetrowe igły do 250-milimetrowych butelek z surowicą i 80-milimetrowe igły do 15-milimetrowych butelek z surowicą.Włóż 40-milimetrowe igły na końcu każdej rurki do butelki z surowicą odpływową. 40-milimetrowe igły przewodów nabłonkowych i neuronalnych są połączone z tą samą butelką odpływową w celu wyrzucenia pożywki. Przewód rurki bakteryjnej przechodzi do drugiej butelki odpływowej.Włóż przewody rurkowe pompy do kaset pompy. Ustaw pompę perystaltyczną tak, aby kierowała media z dopływu do butelki odpływowej z prędkością pięciu obrotów na minutę i naciśnij przycisk start, aby uruchomić pompę. Upewnij się, że wszystkie trójdrogowe zawory odcinające przewodów rurowych są otwarte.Gdy media wpadną do butelek odpływowych, upewnij się, że w przewodach rurowych i punktach połączeń nie ma wycieków ani pęcherzyków powietrza. Gdy wszystkie przewody rurowe wpadną do butelek odpływowych, ustaw natężenie przepływu na dwie prędkości obrotowe, aby podłączyć początkowe urządzenie. Aby podłączyć przewód, należy zamknąć zawory trójdrogowe odcinające, zaczynając od strony odpływowej.Odłącz krótką rurkę od żeńskiego łącznika przynęty i przymocuj ją do portu wylotowego urządzenia, przesuwając rurkę przez zadzior. Aby zapewnić bezpieczne, szczelne połączenie, wepchnij rurkę całkowicie w dół na złącze, upewniając się, że styka się z pokrywą. Otwórz kran odcinający, gdy jedna linia jest całkowicie podłączona do urządzenia.Ustaw natężenie przepływu pompy na dwie prędkości obrotowe i zwiększ prędkość pompy do maksymalnie 2.5 obr./min, aby uniknąć wycieków spowodowanych wzrostem ciśnienia. Pozwól pompie zalać komory. Zmniejsz prędkość pompy do 0,5 obr./min, gdy wszystkie komory zostaną wypełnione pożywką do hodowli komórkowych i w urządzeniu nie pozostaną żadne pęcherzyki.W przypadku komórek nabłonka odłączyć komórki Caco-2 od kolby za pomocą trypsyny EDTA. Zawieś je ponownie w RPMI 1640 plus 10% FBS i policz je w liczniku komórek Neubauera za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanowego. Odwirować zawiesinę komórek Caco-2 przez trzy minuty w temperaturze 300 G i odrzucić supernatant w celu usunięcia pozostałych cykli EDTA.Ponownie zawieś ogniwa Caco-2 w RPMI 1640 plus 10% FBS, aby uzyskać zawiesinę 0,35 miliona komórek na mililitr. Przenieść 1,5 mililitra zawiesiny komórek Caco-2 do sterylnej strzykawki o pojemności dwóch mililitrów i usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza ze strzykawki. Zamknij trójdrogowe zawory odcinające na rurkach zarówno komory bakteryjnej, jak i neuronalnej i odłącz rurkę od pompy, wyjmując kasety z odpowiednimi rurkami z wirnika.Otworzyć nakrętkę zaworu odcinającego rurki dopływowej prowadzącej do komory nabłonkowej i przekręcić zawór, aby przekierować przepływ medium z urządzenia do otwartego złącza. Pozwól medium płynąć, aż kropla medium pojawi się na otwartym końcu zaworu odcinającego. Włożyć strzykawkę z komórkami nabłonkowymi do otwartego łącznika, stosując metodę połączenia kropla-kropla, aby zapobiec wprowadzaniu pęcherzyków powietrza podczas wprowadzania.Przekręcić zawór zaworu odcinającego, aby zatrzymać przepływ pożywki z butelki dopływowej i umożliwić przepływ z podłączonej strzykawki do urządzenia początkowego. Odłącz komorę nabłonkową od pompy i powoli naciśnij strzykawkę, aby zaszczepić komorę nabłonkową 1,5 mililitra zawiesiny komórkowej. Zamknąć zawór zaworu odpływowego i odłączyć strzykawkę.Zamknij otwarty koniec kranu nakrętką i trzymaj komorę zamkniętą przez co najmniej dwie godziny. W międzyczasie zaszczepij komórki neuronalne. Po wyjęciu urządzenia z inkubatora i wyjęciu przewodów rurowych, powoli otwórz zacisk i zdejmij pokrywę.Ostrożnie zdejmij górną pokrywę z poliwęglanu. Zbierz pożywkę do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i umieść ją na lodzie. Delikatnie zdejmij uszczelkę wielowarstwową, jednocześnie zbierając pożywkę z komory nabłonkowej bez dotykania warstwy komórek.Umieść uszczelkę kanapkową na kwadratowej szalce Petriego i dodaj sterylny 0,9% roztwór chlorku sodu i wody do komory bakteryjnej, aż komora zostanie całkowicie pokryta. Powoli zdejmij uszczelkę kolagenową, jednocześnie zbierając pożywkę z komory neuronalnej. Po przeniesieniu pożywki do mikroprobówki wirówkowej umieść probówki na lodzie.Umieść uszczelkę kolagenową w kwadratowym naczyniu i delikatnie dodaj kilka mililitrów PBS do warstwy Caco-2, aż warstwa komórkowa zostanie całkowicie pokryta. Umieść dolną pokrywkę z poliwęglanu na kwadratowej szalce Petriego i delikatnie dodaj około dwóch mililitrów PBS na komórki neuronalne, aby nie wyschły podczas procesu pobierania próbek. Odwirowywać probówkę z pożywką przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po przeniesieniu supernatantów z każdej probówki do nowej mikroprobówki wirówkowej, należy ją natychmiast umieścić na suchym lodzie. Liczba CFU została oceniona dla dwóch różnych początkowych konfiguracji urządzeń. L.reuteri hodowany jednocześnie z Caco-2 i L.reuteri w ludzkim urządzeniu do przesłuchu mikrobiologicznego.W obu konfiguracjach liczba CFU znacznie różniła się od inokulum HuMix i pobranych komórek, co wskazuje na wzrost komórek bakteryjnych wewnątrz początkowego urządzenia. Aby ocenić, czy hodowla neuronów jelitowych w urządzeniu zmienia fenotyp komórki, obserwowano ich ogólną morfologię za pomocą mikroskopu z kontrastem odwróconej fazy. Ustanowienie zlewającej się sieci neuronalnej wskazywało, że komórki dobrze przyczepiły się do pokrytej poliwęglanowej pokrywy urządzeń.Krawędź między zlewającą się siecią neuronalną a spiralą wyznaczoną uszczelką była wyraźnie widoczna. Potencjał neurohumików polega na udzieleniu odpowiedzi na pytania, które wcześniej były trudne do rozwiązania, dotyczące interakcji między mikrobiomem ludzko-jelitowym a jelitowym układem nerwowym ze względu na brak reprezentatywnego modelu.

a-gut-on-a-chip-model-to-study-the-gut-microbiome-nervous-system-axis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy protokół in vitro do wspólnej hodowli mikrobiomu jelitowego i kosmków jelitowych przez dłuższy okres przy użyciu ludzkiego systemu mikrofizjologicznego typu gut-on-a-chip.

Współhodowla żywego mikrobiomu z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi człowieka w urządzeniu mikroprzepływowym typu gut-on-a-chip

Ten artykuł przedstawia unikalną metodę analizy interakcji gospodarz-mikrobiom przy użyciu nowatorskiego systemu hodowli narządów jelitowych do eksperymentów ex vivo.

System hodowli jelit i narządów do analizy interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Ten protokół opisuje model in vitro martwiczego zapalenia jelit (NEC), który może być wykorzystany do mechanistycznych badań nad patogenezą choroby. Posiada chip mikroprzepływowy wysiany enteroidami jelitowymi pochodzącymi z ludzkiego jelita noworodka, komórek śródbłonka i mikrobiomu jelitowego noworodka z ciężkim NEC.

Mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit zawierający enteroidy jelitowe ludzkiego noworodka i mikrobiom dysbiotyczny

Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.

Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit

Komunikacja jelitowo-mózgowa, ułatwiana przez nerw błędny, jest kluczowa dla komunikacji między układem hormonalnym przewodu pokarmowego a mózgiem. Jednak to, czy dożołądkowe wstrzyknięcie glukozy może zmienić aktywność kory mózgowej, nadal nie jest zrozumiałe. W tym miejscu oferujemy kompleksowy protokół obserwacji zmian w aktywności kory mózgowej po wstrzyknięciu glukozy do dwunastnicy.

Analiza komunikacji neuronalnej jelitowo-mózgowej w czasie rzeczywistym: dynamika wapnia w całej korze mózgowej w odpowiedzi na stymulację glukozy w jelitach

Niniejszy artykuł opisuje protokół tworzenia mikrofluidycznego urządzenia do hodowli pochwy na chipie (Vagina Chip), które umożliwia badanie interakcji ludzkiego gospodarza z żywym mikrobiomem pochwy w warunkach mikroaerofilnych. Ten chip może być wykorzystywany jako narzędzie do badania chorób pochwy oraz do opracowywania i testowania potencjalnych środków zaradczych terapeutycznych.

Modelowanie zdrowych i dysbiotycznych mikrośrodowisk pochwy w ludzkiej pochwie na chipie

Nasz szczegółowy protokół opisuje tworzenie i używanie zaawansowanego modelu jelita na chipie, który symuluje ludzką błonę śluzową jelit ze strukturami 3D i różnymi typami komórek, umożliwiając dogłębną analizę odpowiedzi immunologicznych i funkcji komórkowych w odpowiedzi na kolonizację mikrobiologiczną.

Immunokompetentny model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit

Testowanie wrażliwości wizualnej u jaszczurek przy operant paradygmat klimatyzacji, która zatrudnia odtwarzania wideo losowych punktów, kinematograms i generowanych komputerowo bezkręgowców.

Badania wizualne Wrażliwość na prędkość i kierunek ruchu w Jaszczurki

Bodźce wygenerowane komputerowo z wykorzystaniem smoka Jacky jako modelu.

Komputerowo generowane bodźce dla modeli zwierzęcych

Odkryj model neuroHuMiX gut-on-a-chip do badania interakcji między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym. Ta metoda umożliwia analizę wpływu bakterii na neurony w chorobach takich jak Parkinson.

Model Gut-on-A-Chip do badania osi mikrobiom jelitowy i układu nerwowego

Przeglądaj więcej filmów