Name: Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Naucz się izolować hepatocyty regenerujące się po częściowej hepatektomii u myszy. Ta metoda zachowuje komórki obciążone lipidami, które zwykle giną podczas tradycyjnej wirówki gradientowej, umożliwiając dokładniejsze badanie biologii wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Swiss National Fond (grant projektu 310030_189262).

<ol><li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li>
<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+from+myth+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li>
<li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 1 Suppl 81-88 (2015).</li>
<li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li>
<li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li>
<li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLizardo+Thiebaud%2C+MJ+%22Liver+Pathology%22">Liver Pathology</a>. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).</li>
<li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086(2020).</li>
<li>Smedsrød, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li>
<li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+a+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2%2B+on+enzymatic+dispersion+of+isolated%2C+perfused+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li>
<li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+down-regulation+promotes+%CE%B2-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li>
<li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).</li>
<li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+%28HABR%29+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877(2015).</li>
<li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li>
<li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2%2F3+partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li>
<li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li>
<li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li>
<li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li>
<li>Roche, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoche%2C++%22Liberase+TM+Research+Grade%22">Liberase TM Research Grade</a>. , (2020).</li>
<li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes%2C+which+inhibits+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li>
<li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li>
<li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li>
<li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+failure+following+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22HPB%22%5BJournal%5D)">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li>
<li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li>
<li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-sweetened+beverage%2C+diet+soda%2C+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years%3A+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenteroly+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li>
<li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma%3A+a+problem+of+growing+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li>
<li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+body+weight+and+metabolic+%28dysfunction%29-associated+fatty+liver+disease+%28MAFLD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Visceral+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Opublikowany protokół zapewnia niezawodną i prostą metodę izolowania wysokiej wydajności normalnych i stłuszczeniowych mysich hepatocytów do analiz pojedynczych komórek lub analizy masowej komórek po sortowaniu FACS. Wyraźną przewagą nad oczyszczaniem w gradiencie gęstości jest to, że zawartość lipidów w komórkach zasadniczo nie ma wpływu na efektywną wydajność hepatocytów. W ten sposób frakcja hepatocytów stłuszczeniowych zostanie zachowana i uwzględniona w dalszych analizach. Ma to kluczowe znaczenie nie tylko dla bada...

Wątroba może się zregenerować nawet po dużej utracie tkanki. Ta wyjątkowa zdolność regeneracyjna jest wyraźnie zilustrowana przez eksperymentalny model częściowej (70%) hepatektomii, po raz pierwszy opisany na szczurach przez Higginsa i Andersona w 1931 roku1. W tym modelu 70% wątroby jest chirurgicznie usuwane u zwierząt poprzez odcięcie większych płatów wątroby. Pozostałe płaty następnie rosną w wyniku kompensacyjnego przerostu, aby przywrócić pierwotną masę wątroby w ciągu około 1 tygodnia po operacji, aczkolwiek bez przywrócenia pierwotnej architektury wątroby2,3. Opracowano dodatkowe hepatektomie z różną ilością usuwanych tkanek, takie jak hepatektomia rozszerzona o 86%, w której resztki wątroby są zbyt małe, aby się zregenerować, co ostatecznie prowadzi do niewydolności wątroby po hepatektomii (PHLF), a następnie śmierci u 30%-50% zwierząt4,5,6. Modele te umożliwiają badanie prawidłowej i nieudanej regeneracji wątroby, w zależności od ilości wyciętej tkanki (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).
Chociaż mysie modele hepatektomii są z powodzeniem stosowane od wielu lat, dopiero niedawno bardziej zaawansowane metody analityczne pozwoliły na głębszy wgląd na poziomie pojedynczej komórki. Jednak w przypadku większości tych metod obecność pojedynczych hepatocytów jest podstawowym warunkiem wstępnym. Większość protokołów izolacji hepatocytów pierwotnych opiera się na dwuetapowej technice perfuzji kolagenazy i późniejszym oczyszczaniu w gradieniu gęstości w celu oddzielenia żywotnych hepatocytów od szczątków i komórek niemiąższowych, a także martwych7,8,9. Ta metoda została po raz pierwszy opisana przez Berry'ego i Frienda w 1969 roku10 i zaadaptowana przez Seglena i współpracowników w 1972 roku11,12. Ponieważ jednak wirowanie gradientowe zależy od gęstości i wielkości komórek, hepatocyty obciążone lipidami są często tracone podczas standardowego oczyszczania. Chociaż taka utrata może być nieistotna dla wielu pytań badawczych, jest to kluczowy aspekt dla wczesnej regeneracji wątroby. W ciągu pierwszych 2 dni hepatocyty w regenerującej się wątrobie myszy gromadzą lipidy, zwiększając w ten sposób swój rozmiar i zmniejszając gęstość. Ta przejściowa stłuszczenie związane z regeneracją (TRAS) służy do dostarczania paliwa regeneracyjnego i jest tymczasowe, ale częściowo nakłada się na główną fazę proliferacyjną i jest nierównomiernie rozmieszczone w zrazikach wątroby - jednostkach funkcjonalnych klasy wątroba<sup="xref">13,14. Jednak po przedłużonej hepatektomii 86% TRAS również występuje, ale utrzymuje się, ponieważ regeneracja jest zatrzymana, a lipidy nie są utleniane14. W związku z tym gradientowe oczyszczanie hepatocytów po hepatektomii 70% lub 86% da niereprezentatywne frakcje, ponieważ większość hepatocytów obciążonych lipidami jest tracona z powodu ich niskiej gęstości15.
W tym zmodyfikowanym protokole izolacji, hepatocyty myszy C57BL/6 są izolowane 24-48 godzin po hepatektomii za pomocą klasycznego dwuetapowego podejścia perfuzji kolagenazy. Zwykle kaniulacja i perfuzja pozostałości w celu izolacji komórek odbywa się przez żyłę wrotną. Jednak opór wrotno-naczyniowy w małych pozostałościach po dużej resekcji jest wysoki16, a zatem perfuzja jest delikatna. Ponieważ żyła główna pozostaje nienaruszona przez hepatektomię, perfuzję można łatwo przeprowadzić w kierunku wstecznym poprzez kaniulację żyły głównej. Standardowa pompa perystaltyczna kieruje podgrzane roztwory przez cewnikowaną żyłę główną dolną do pozostałości wątroby, wykorzystując perfuzję wsteczną z odpływem przez żyłę wrotną (rysunek uzupełniający S1). Hepatocyty są dysocjowane przez kolagenazy i uwalniane z kapsułki Glissona. Po umyciu i starannym przetworzeniu żywotnych hepatocytów poprzez stopniową izolację przy użyciu metody wirowania z niską prędkością, hepatocyty można wykorzystać do dalszych analiz.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Zombie green</td><td>BioLegend</td><td>423111</td><td>Amino-reaktywny barwnik</td></tr> żywotności <tr><td>Attane Isoflurane ad us. weterynarz 99.9%</td><td>Provet AG</td><td>QN01AB06</td><td>UWAGA: wymaga wentylacji</td></tr><tr><td>Roztwór EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008-100ML-Etanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V001229</td><td>Rozcieńczyć wodą do 70%</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FCS)</td>Zrównoważony roztwór soli <td>Gibco</td><td></td> <td>A5256701-Hanks</td></tr> <tr><td>(HBSS), Ca2+, Mg2+, czerwień fenolowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9269-6x600ML</td><td>Do trawienia/konserwacji</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS), bez Ca2+, bez Mg2+, bez czerwieni fenolowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6x500ML</td><td>Do roztworu buforu perfuzyjnego</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M</td> Klej tkankowy <td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-100ML-F-Histoacryl</td><td></td></tr> <tr><td>(butylo-2-cyjanoakryl)</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td>Do stabilizacji miejsca kaniulacji</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 Roztwór barwnika barwiącego</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>-</td></tr><tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>Liofilizowane kolagenazy I/II</td></tr><tr><td>NaCl 0,9% 500 mL Ecotainer</td><td>B. Braun</td><td>123-Paralube</td><td></td></tr> <tr><td>Maść weterynaryjna</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38-Sól</td><td></td></tr> <tr><td>fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Gibco</td><td></td> <td>A1286301-Sudan</td></tr> <tr><td>IV &ndash; Barwienie lipidów</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>V001423-Temgesic</td></tr> <tr><td>(chlorowodorek buprenorfiny), roztwór do wstrzykiwań 0,3 mg/ml</td><td>Indivior Europe Ltd.</td><td>345928</td><td>Narkotyki. Przechowywać w bezpiecznym miejscu.</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy, 0,4%, sterylnie filtrowany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Williamsa Medium E</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4128-500ML</td><td>-</td></tr><tr><td><mocny>Materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL pipeta serologiczna, Greiner Cellstar</td><td>Merck</td><td>P7865-50</td><td></td></tr> <tr><td>mL Probówki Falcon</td><td>TPP</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-BD Neoflon, Cewnik Pro IV 26 G</td><td>BD Skrobak</td><td></td> <td>391349-Cell</td> Falcon</tr>, <tr><td>szerokość obrotowego ostrza 25 mm</td><td>TPP</td><td>99004-Falcon</td><td></td></tr> <tr><td>Sitko do komórek 100 i mikro; m Nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352360-Fenestrated</td><td></td></tr> <tr><td>sterylna serweta chirurgiczna</td> <td>-</td><td></td> materiał <td>z tkaniny wielokrotnego użytku</td></tr><tr><td>Dysza napełniająca do rurki o rozmiarze 16 # (ID 3,1 mm)</td> <td>Drifton</td><td>FILLINGNOZZLE # 16</td><td>Aby wejść do probówek</td></tr><tr><td>Rurki do cytometrii przepływowej, 5 ml</td><td>BD Falcon</td> <td>352008-męski</td><td></td></tr> <tr><td>Luer do Barb, ID rurki 3,2 mm</td><td>Rurka</td> przyłączeniowa Drifton <td>LM41</td><td> do strzykawki szalki</td></tr><tr><td>Petriego, 96 x 21 mm</td><td>TPP</td><td>93100-Prolene</td><td></td></tr> <tr><td>5-0</td><td>Ethicon</td><td>8614H</td><td>Aby schować mostek</td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Ethicon</td><td>8695H</td><td>Do szwu skórnego</td></tr><tr><td>Prolene 8-0</td><td>Ethicon</td><td>EH7470E</td><td>Rurka do podwiązki pęcherzyka żółciowego</td></tr><tr><td>16 #, WT 1,6 mm, ID 3,2 mm, średnica zewnętrzna 6,4 mm</td><td>Drifton</td><td>SC0374T</td><td>Rurka perfuzyjna</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa Analizator komórek Cytometr przepływowy</td><td>BD</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Golarka dla gryzoni Isis</td><td>Aesculap</td><td>GT421-Stacja</td><td></td></tr> <tr><td>Isofluran</td><td>Provet</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Wirówka wolnoobrotowa &ndash; Scanspeed 416</td><td>Labogene</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Ulepszona komora licząca Neubauera</td><td>Marienfeld</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Koncentrator tlenu &ndash; EverFlo</td><td>Philips&nbsp;</td><td>1020007</td><td>0 &ndash; 5 l/min</td></tr><tr><td>Pipetboy &ndash; Pipetor Turbo-Fix</td><td>TPP</td><td>94700-Shenchen</td><td></td></tr> <tr><td>pompa perfuzyjna &ndash; YZ1515x</td><td>Shenchen</td><td>YZ1515x-Mikroskop</td><td></td></tr> <tr><td>chirurgiczny &ndash; SZX9</td><td>Olympus</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Mata ocieplająca Thermo</td><td>Lux</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Vortex Genie 2, 2700 UpM</td><td>NeoLab</td><td>7-0092</td><td></td></tr> <tr><td>- Kąpiel wodna &ndash; Precision GP 02</td><td>Thermo</td> <td>scientific-Dostosuj</td> <td>do 42 &deg; Z</td></tr></tbody></table>

izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Częściowa hepatektomia była szeroko stosowana do badania regeneracji wątroby u myszy, ale izolacja wysokiej wydajności żywotnych hepatocytów do dalszych zastosowań jednokomórkowych jest wyzwaniem. U myszy obserwuje się wyraźne nagromadzenie lipidów w regenerujących się hepatocytach w ciągu pierwszych 2 dni normalnej regeneracji wątroby. Ta tak zwana przejściowa stłuszczenie związane z regeneracją (TRAS) jest tymczasowe, ale częściowo pokrywa się z główną fazą proliferacyjną. Oczyszczanie w gradiencie gęstości jest podstawą większości istniejących protokołów izolacji pierwotnych hepatocytów. Ponieważ oczyszczanie gradientowe zależy od gęstości i wielkości komórek, oddziela populacje hepatocytów niestłuszczonych od stłuszczeniowych. Dlatego hepatocyty tłuszczowe często są tracone, dając niereprezentatywne frakcje hepatocytów. 
Prezentowany protokół opisuje łatwą i niezawodną metodę izolacji in vivo regenerujących się hepatocytów, niezależnie od ich zawartości lipidów. Hepatocyty od samców myszy C57BL / 6 izoluje się 24-48 godzin po hepatektomii za pomocą klasycznego dwuetapowego podejścia perfuzji kolagenazy. Standardowa pompa perystaltyczna napędza podgrzane roztwory przez cewnikowaną żyłę główną dolną do pozostałości, stosując technikę perfuzji wstecznej z odpływem przez żyłę wrotną. Hepatocyty są dysocjowane przez kolagenazę w celu ich uwolnienia z kapsułki Glissona. Po umyciu i dokładnym odwirowaniu hepatocyty mogą być wykorzystane do dalszych analiz. Podsumowując, w artykule opisano prostą i powtarzalną technikę izolacji reprezentatywnej populacji regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy. Metoda może również pomóc w badaniu stłuszczeniowej choroby wątroby.

Poziom TRAS osiąga szczyt w 16 h po hepatektomii i stopniowo zanika w czasie od 32 do 48 h po standardowej hepatektomii, natomiast utrzymuje się powyżej 48 h po hepatektomii rozszerzonej. Makroskopowo TRAS jest łatwo widoczny jako blady kolor pozostałości wątroby (Rysunek 1F) i można go zaobserwować u myszy po hepatektomii między 16 a 48 h po zabiegu.
Przewidywana końcowa wydajność wynosi 10-15 × 106 hepatocyty po hepatektomii 70% i 4-9 × 106...

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Ogólnym celem tego protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej metody izolacji hepatocytów u myszy po częściowej hepatektomii bez konieczności wirowania w gradiacji gęstości. Zwykle obserwujemy duży odsetek hepatocytów obciążonych lipidami podczas wczesnej regeneracji. Te stłuszczeniowe hepatocyty, zwykle tracone po wirowaniu w gradiencie gęstości z powodu niskiej gęstości, są zachowywane w tym protokole.Aby przygotować sprzęt do perfuzji, podłącz kaniulę IUI w rozmiarze 26 do końca wylotowego rurki za pomocą złącza Luer lock. Następnie przepłukać rurkę i włożyć końcówkę wlotową rurki do wstępnie podgrzanej rurki buforowej perfuzyjnej w łaźni wodnej. Zalać go ciepłym buforem perfuzyjnym z prędkością pompy wynoszącą trzy mililitry na minutę.Przed przystąpieniem do zabiegu upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona. Następnie oczyść brzuch roztworem do szorowania chirurgicznego i 70% etanolem. Następnie przeciąć szwy, aby ponownie otworzyć nacięcie w linii środkowej wykonane wcześniej do częściowej hepatektomii i delikatnie rozsunąć krawędzie rany.Jeśli hepatektomia jest starsza niż 24 do 48 godzin, usuń szew i przetnij skórę nożyczkami lub skalpelem. Użyj retraktora lub prostych klipsów, aby utrzymać brzuch otwarty. Jama brzuszna powinna być jak najbardziej odsłonięta, aby zoptymalizować dostęp i wizualizację.Przymocuj szew polipropylenowy 5-0 do mostka. Pociągnij go za czaszkę i zamocuj w tej pozycji. Przesuń jelita w prawo za pomocą sterylnych wacików, aby odsłonić żyłę wrotną i żyłę główną.Użyj mokrej szmatki, aby zatrzymać jelita. Umieść ciężki przedmiot o wysokości około dwóch centymetrów, taki jak metalowy obciążnik, przylegający do tylnych nóg myszy. Następnie umieść rurkę z podłączoną kaniulą IUI w rozmiarze 26 na przedmiocie i ostrożnie umieść igłę na żyle głównej.Dostosuj długość rurki zgodnie z wymaganiami. Przenieść roztwór podstawowy kolagenazy do wstępnie podgrzanej probówki buforowej do wytrawiania. Przygotuj od 10 do 20 mililitrów buforu wytrawiającego na zwierzę.Włącz pompę po ustawieniu prędkości pompy na trzy mililitry na minutę. Wyrzuć pierwsze dwa do trzech mililitrów wstępnie podgrzanego buforu perfuzyjnego, gdy bufor dotrze do igły. Aby wykonać kaniulację żyły głównej dolnej, za pomocą sterylnego wacika bawełnianego delikatnie pociągnij żyłę główną doogonowo poniżej nakłucia, tak aby zapewnione napięcie ułatwiało wprowadzenie kaniuli do żyły.Wprowadzić kaniulę IUI o rozmiarze 26 pod płytkim kątem do żyły głównej dolnej poniżej nerki, podczas gdy bufor przechodzi przez igłę. Upewnij się, że skos igły jest skierowany do góry. Poszukaj krwi w komorze błyskowej cewnika, gdy igła wejdzie w światło.Przesuń igłę o dodatkowe dwa do trzech milimetrów, aby upewnić się, że końcówka cewnika wejdzie do żyły. Wsuń plastikowy cewnik przez igłę i do żyły głównej o kolejne pięć milimetrów. Wyjmować igłę powoli i bardzo ostrożnie.Po dwóch do trzech sekundach poszukaj białych plam tworzących się w wątrobie lub obrzęku żyły wrotnej, co wskazuje, że bufor perfuzyjny przepływa przez wątrobę i wchodzi do zrazików wątroby z żyły centralnej. Poczekaj, aż żyła wrotna widocznie spuchnie w ciągu jednej do dwóch sekund od powstania białych plam na powierzchni wątroby. Przeciąć żyłę wrotną nożyczkami jak najdystalniej od wnęki wątroby.Zwiększ natężenie przepływu do czterech do siedmiu mililitrów na minutę w zależności od wagi zwierzęcia, wielkości wątroby i zakresu początkowej hepatektomii. Zaciśnij żyłę wrotną za pomocą pęsety lub zacisku naczyniowego na siedem do 10 sekund. Upewnij się, że nie przepływa przez niego żaden płyn.Wykonaj drugi zacisk po około 30 sekundach i upewnij się, że wątroba puchnie i rozluźnia się. Kontynuuj płukanie zwierzęcia przez trzy do czterech minut i obserwuj przezroczysty bufor wypływający z żyły wrotnej. Zacisnąć żyłę wrotną na trzy do czterech sekund, zanim bufor trawienny dotrze do wątroby.Upewnij się, że wątroba rozluźnia się po zwolnieniu zacisku i że płyn perfuzyjny pozostaje czysty. Gdy bufor trawienny dotrze do wątroby, ponownie zaciśnij żyłę wrotną. Wątroba nie powinna się rozluźniać po zwolnieniu zacisku.Trawić przez około cztery minuty przy natężeniu przepływu pięciu mililitrów na minutę. W miarę postępu trawienia szukaj oznak tego, że wątroba zaczyna puchnąć i małych przezroczystych odcinków na powierzchni wątroby. Zauważ, że wątroba nabiera tekstury mokrego kawałka materiału i wydaje się prawie rozmoczona.Zbadaj konsystencję, ostrożnie dotykając jej wilgotnym, sterylnym wacikiem. Kontynuuj perfuzję, aż będzie można zauważyć wyraźną różnicę w teksturze powierzchni wątroby. Zauważ, że wątroba przybiera bardzo jasny kolor i bąbelkowy wygląd, co wskazuje na oddzielenie torebki Glissona od miąższu.Przerwij trawienie, gdy tylko wątroba uzyska te właściwości. Usuń igłę, zanim powietrze dostanie się do wątroby. Chwyć centralną tkankę łączną między płatami za pomocą kleszczy i lekko unieś ją do góry, używając jej jako punktu zaczepienia.Przetnij wszystkie połączenia wątroby z innymi narządami i usuń woreczek żółciowy. Delikatnie usuń wątrobę z jamy brzusznej. Bądź ostrożny, ponieważ na tym etapie będzie cienki i delikatny.Umieść wątrobę w lodowatym buforze konserwującym. Przenieś wątrobę na 10-centymetrową szalkę Petriego i dodaj 10 mililitrów lodowatego środka Williams'Medium E.Rozerwij kapsułkę Glissona za pomocą pęsety z cienką końcówką w kilku miejscach wzdłuż powierzchni wątroby. Chwyć środkową część za pomocą dwóch par pęset.Powoli rozsuń je, pozwalając kapsułce rozerwać się bez uszkadzania hepatocytów i uwolnić komórki, delikatnie potrząsając kapsułką. Przefiltruj pięć mililitrów miazgi wątrobowej przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do probówki o pojemności 50 mililitrów. Przepłucz filtr 10 mililitrami świeżego, lodowatego podłoża i przefiltruj pozostałe pięć mililitrów miazgi przez sitko komórkowe.Wirować ekstrakt w temperaturze 50 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać większość supernatantu, pozostawiając jeden mililitr do ponownego zawieszenia komórek poprzez delikatne obracanie probówki. Dodaj 40 mililitrów zimnego Williams'E Medium i powtórz krok trzy razy.Kontynuuj izolację hepatocytów zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Po 70% hepatektomii u myszy ostateczna wydajność hepatocytów wynosiła około 10 do 15 x 10 do 6. przy średniej końcowej żywotności 78%. Podczas gdy po przedłużonej 86% hepatektomii wydajność hepatocytów wynosiła od czterech do dziewięciu x 10 do 6. przy średniej żywotności 65%.Po częściowej hepatektomii hepatocyty wykazują zwiększoną wielkość komórek w porównaniu z normalną wątrobą, co odpowiada zwiększonej zawartości lipidów. Zwiększoną zawartość lipidów obserwowano w mysich hepatocytach 24 godziny po częściowej hepatektomii, co było obserwowane jako wzrost ziarnistości lub bezpośrednio obserwowane przez obecność pęcherzyków lipidowych wewnątrz powiększonych hepatocytów. Podczas stosowania klasycznej metody oczyszczania w gradionym gradiencie gęstości duże hepatocyty tłuszczowe zostały utracone w supernatancie i tylko mniejsze chude hepatocyty są gromadzone w osadzie komórkowym.Dzięki ulepszonemu protokołowi hepatocyty wypełnione lipidami nie zostały utracone, a wszystkie hepatocyty zostały granulowane. Powtarzalne mocowanie ułatwia proces spłukiwania. Dzięki temu wątroba jest optymalnie oczyszczana z pozostałych składników krwi, które mogłyby hamować enzymy trawienne.

isolation-regenerating-hepatocytes-after-partial-hepatectomy

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisana jest zmodyfikowana dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy do izolacji ludzkich hepatocytów. Metodę tę można również zastosować do wątroby innych ssaków. Wyizolowane hepatocyty są dostępne w wysokiej wydajności i żywotności, co czyni je odpowiednim modelem do badań naukowych w takich dziedzinach jak regeneracja wątroby, farmakokinetyka i toksykologia.

Izolacja ludzkich hepatocytów za pomocą dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy

Narzędzia używane do wizualizacji regeneracji naczyń krwionośnych wymagają metod kontrastowania drzew naczyniowych. Film ten zademonstrował delikatną technikę iniekcji zastosowaną w celu uzyskania optymalnego kontrastu drzew naczyniowych i zilustrował potencjalne korzyści wynikające ze szczegółowej analizy otrzymanej próbki za pomocą μCT i histologicznych odcinków seryjnych.

Wizualizacja regeneracji naczyń krwionośnych i miąższu po 70% częściowej hepatektomii u zdrowych myszy

Wysoka częstość nawrotów nowotworu po resekcji przerzutów do wątroby pozostaje nierozwiązanym problemem. Ilustrowany model myszy może być przydatny do zbadania przyczyn takich nawrotów. Po raz pierwszy łączy model resekcji wątroby z wstrzyknięciem komórek nowotworowych do wątroby.

Wpływ resekcji wątroby na wzrost guza wewnątrzwątrobowego

Tutaj prezentujemy nowy humanizowany model wątroby myszy wygenerowany u myszy z nokautem komórkowym za pośrednictwem receptora alb-toksyny (TRECK)/SCID po przeszczepie niedojrzałych i zdolnych do rozbudowy ludzkich komórek macierzystych wątroby.

Generowanie humanizowanej wątroby myszy przy użyciu ludzkich komórek macierzystych wątroby

Tutaj pokazujemy enzymatyczne podejście do izolacji pierwotnych hepatocytów od dorosłych myszy i opisujemy kwantyfikację odpowiedzi zapalnej za pomocą ELISA i PCR w czasie rzeczywistym.

Indukcja odpowiedzi zapalnej w pierwotnych kulturach hepatocytów od myszy

Opisaliśmy protokół wykonywania częściowej hepatektomii (PHx) i przeszczepu komórek przez śledzionę w NOD. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J) myszy. W tym protokole wykonuje się nacięcie w celu odsłonięcia i wycięcia lewego płata wątroby, a następnie kolejne nacięcie w celu dośledziony przeszczepu komórek.

Wewnątrzśledzionowe przeszczepienia hepatocytów po częściowej hepatektomii w NOD. Myszy SCID

Tutaj prezentujemy nową metodę częściowej resekcji lewego płata wątroby u noworodków (dzień 0) myszy. Ten nowy protokół jest odpowiedni do badania ostrego uszkodzenia wątroby i reakcji na uraz u noworodków.

Hepatektomia zrazikowa częściowa: chirurgiczny model morfologicznej regeneracji wątroby

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie specjalnego cewnika dożylnego, standaryzowanego sterylnego jednorazowego wężyka, kontroli temperatury uzupełnionej monitorowaniem w czasie rzeczywistym, oraz systemu alarmowego dla dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu poprawy spójności żywotności, wydajności i funkcjonalności izolowanych pierwotnych hepatocytów szczurów.

Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji

Wykazano, że powiązanie podziału wątroby i podwiązania żyły wrotnej w przypadku etapowej hepatektomii (ALPPS) powoduje niezwykłą regenerację wątroby po kilku tygodniach od operacji pierwszego etapu. Modele zwierzęce, które przeszły ALPPS, zostały opracowane w celu zbadania potencjalnej zdolności regeneracji wątroby i osiągnięcia korzystnych wyników klinicznych.

Mysi model skojarzonej partycji wątroby i podwiązania żyły wrotnej do etapowego zabiegu hepatektomii wspomaganego mikroskopią

Mysi model częściowej 2/3 (66%) hepatektomii jest dobrze opisany w literaturze, ale rzadko stosowano bardziej rozbudowane hepatektomie naśladujące zespół małego dla rozmiaru po przeszczepie wątroby. Opisujemy rozszerzoną 78% procedurę hepatektomii w modelu mysim, która powoduje około 50% śmiertelności pooperacyjnej u zdrowych myszy.

Rozszerzona 78% hepatektomia w mysim modelu chirurgicznym

Naucz się izolować hepatocyty regenerujące się po częściowej hepatektomii u myszy. Ta metoda zachowuje komórki obciążone lipidami, które zwykle giną podczas tradycyjnej wirówki gradientowej, umożliwiając dokładniejsze badanie biologii wątroby.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Przeglądaj więcej filmów