Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Ogólnym celem tego protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej metody izolacji hepatocytów u myszy po częściowej hepatektomii bez konieczności wirowania w gradiacji gęstości. Zwykle obserwujemy duży odsetek hepatocytów obciążonych lipidami podczas wczesnej regeneracji. Te stłuszczeniowe hepatocyty, zwykle tracone po wirowaniu w gradiencie gęstości z powodu niskiej gęstości, są zachowywane w tym protokole.

Aby przygotować sprzęt do perfuzji, podłącz kaniulę IUI w rozmiarze 26 do końca wylotowego rurki za pomocą złącza Luer lock. Następnie przepłukać rurkę i włożyć końcówkę wlotową rurki do wstępnie podgrzanej rurki buforowej perfuzyjnej w łaźni wodnej. Zalać go ciepłym buforem perfuzyjnym z prędkością pompy wynoszącą trzy mililitry na minutę.

Przed przystąpieniem do zabiegu upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona. Następnie oczyść brzuch roztworem do szorowania chirurgicznego i 70% etanolem. Następnie przeciąć szwy, aby ponownie otworzyć nacięcie w linii środkowej wykonane wcześniej do częściowej hepatektomii i delikatnie rozsunąć krawędzie rany.

Jeśli hepatektomia jest starsza niż 24 do 48 godzin, usuń szew i przetnij skórę nożyczkami lub skalpelem. Użyj retraktora lub prostych klipsów, aby utrzymać brzuch otwarty. Jama brzuszna powinna być jak najbardziej odsłonięta, aby zoptymalizować dostęp i wizualizację.

Przymocuj szew polipropylenowy 5-0 do mostka. Pociągnij go za czaszkę i zamocuj w tej pozycji. Przesuń jelita w prawo za pomocą sterylnych wacików, aby odsłonić żyłę wrotną i żyłę główną.

Użyj mokrej szmatki, aby zatrzymać jelita. Umieść ciężki przedmiot o wysokości około dwóch centymetrów, taki jak metalowy obciążnik, przylegający do tylnych nóg myszy. Następnie umieść rurkę z podłączoną kaniulą IUI w rozmiarze 26 na przedmiocie i ostrożnie umieść igłę na żyle głównej.

Dostosuj długość rurki zgodnie z wymaganiami. Przenieść roztwór podstawowy kolagenazy do wstępnie podgrzanej probówki buforowej do wytrawiania. Przygotuj od 10 do 20 mililitrów buforu wytrawiającego na zwierzę.

Włącz pompę po ustawieniu prędkości pompy na trzy mililitry na minutę. Wyrzuć pierwsze dwa do trzech mililitrów wstępnie podgrzanego buforu perfuzyjnego, gdy bufor dotrze do igły. Aby wykonać kaniulację żyły głównej dolnej, za pomocą sterylnego wacika bawełnianego delikatnie pociągnij żyłę główną doogonowo poniżej nakłucia, tak aby zapewnione napięcie ułatwiało wprowadzenie kaniuli do żyły.

Wprowadzić kaniulę IUI o rozmiarze 26 pod płytkim kątem do żyły głównej dolnej poniżej nerki, podczas gdy bufor przechodzi przez igłę. Upewnij się, że skos igły jest skierowany do góry. Poszukaj krwi w komorze błyskowej cewnika, gdy igła wejdzie w światło.

Przesuń igłę o dodatkowe dwa do trzech milimetrów, aby upewnić się, że końcówka cewnika wejdzie do żyły. Wsuń plastikowy cewnik przez igłę i do żyły głównej o kolejne pięć milimetrów. Wyjmować igłę powoli i bardzo ostrożnie.

Po dwóch do trzech sekundach poszukaj białych plam tworzących się w wątrobie lub obrzęku żyły wrotnej, co wskazuje, że bufor perfuzyjny przepływa przez wątrobę i wchodzi do zrazików wątroby z żyły centralnej. Poczekaj, aż żyła wrotna widocznie spuchnie w ciągu jednej do dwóch sekund od powstania białych plam na powierzchni wątroby. Przeciąć żyłę wrotną nożyczkami jak najdystalniej od wnęki wątroby.

Zwiększ natężenie przepływu do czterech do siedmiu mililitrów na minutę w zależności od wagi zwierzęcia, wielkości wątroby i zakresu początkowej hepatektomii. Zaciśnij żyłę wrotną za pomocą pęsety lub zacisku naczyniowego na siedem do 10 sekund. Upewnij się, że nie przepływa przez niego żaden płyn.

Wykonaj drugi zacisk po około 30 sekundach i upewnij się, że wątroba puchnie i rozluźnia się. Kontynuuj płukanie zwierzęcia przez trzy do czterech minut i obserwuj przezroczysty bufor wypływający z żyły wrotnej. Zacisnąć żyłę wrotną na trzy do czterech sekund, zanim bufor trawienny dotrze do wątroby.

Upewnij się, że wątroba rozluźnia się po zwolnieniu zacisku i że płyn perfuzyjny pozostaje czysty. Gdy bufor trawienny dotrze do wątroby, ponownie zaciśnij żyłę wrotną. Wątroba nie powinna się rozluźniać po zwolnieniu zacisku.

Trawić przez około cztery minuty przy natężeniu przepływu pięciu mililitrów na minutę. W miarę postępu trawienia szukaj oznak tego, że wątroba zaczyna puchnąć i małych przezroczystych odcinków na powierzchni wątroby. Zauważ, że wątroba nabiera tekstury mokrego kawałka materiału i wydaje się prawie rozmoczona.

Zbadaj konsystencję, ostrożnie dotykając jej wilgotnym, sterylnym wacikiem. Kontynuuj perfuzję, aż będzie można zauważyć wyraźną różnicę w teksturze powierzchni wątroby. Zauważ, że wątroba przybiera bardzo jasny kolor i bąbelkowy wygląd, co wskazuje na oddzielenie torebki Glissona od miąższu.

Przerwij trawienie, gdy tylko wątroba uzyska te właściwości. Usuń igłę, zanim powietrze dostanie się do wątroby. Chwyć centralną tkankę łączną między płatami za pomocą kleszczy i lekko unieś ją do góry, używając jej jako punktu zaczepienia.

Przetnij wszystkie połączenia wątroby z innymi narządami i usuń woreczek żółciowy. Delikatnie usuń wątrobę z jamy brzusznej. Bądź ostrożny, ponieważ na tym etapie będzie cienki i delikatny.

Umieść wątrobę w lodowatym buforze konserwującym. Przenieś wątrobę na 10-centymetrową szalkę Petriego i dodaj 10 mililitrów lodowatego środka Williams'Medium E.Rozerwij kapsułkę Glissona za pomocą pęsety z cienką końcówką w kilku miejscach wzdłuż powierzchni wątroby. Chwyć środkową część za pomocą dwóch par pęset.

Powoli rozsuń je, pozwalając kapsułce rozerwać się bez uszkadzania hepatocytów i uwolnić komórki, delikatnie potrząsając kapsułką. Przefiltruj pięć mililitrów miazgi wątrobowej przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do probówki o pojemności 50 mililitrów. Przepłucz filtr 10 mililitrami świeżego, lodowatego podłoża i przefiltruj pozostałe pięć mililitrów miazgi przez sitko komórkowe.

Wirować ekstrakt w temperaturze 50 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać większość supernatantu, pozostawiając jeden mililitr do ponownego zawieszenia komórek poprzez delikatne obracanie probówki. Dodaj 40 mililitrów zimnego Williams'E Medium i powtórz krok trzy razy.

Kontynuuj izolację hepatocytów zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Po 70% hepatektomii u myszy ostateczna wydajność hepatocytów wynosiła około 10 do 15 x 10 do 6. przy średniej końcowej żywotności 78%. Podczas gdy po przedłużonej 86% hepatektomii wydajność hepatocytów wynosiła od czterech do dziewięciu x 10 do 6. przy średniej żywotności 65%.

Po częściowej hepatektomii hepatocyty wykazują zwiększoną wielkość komórek w porównaniu z normalną wątrobą, co odpowiada zwiększonej zawartości lipidów. Zwiększoną zawartość lipidów obserwowano w mysich hepatocytach 24 godziny po częściowej hepatektomii, co było obserwowane jako wzrost ziarnistości lub bezpośrednio obserwowane przez obecność pęcherzyków lipidowych wewnątrz powiększonych hepatocytów. Podczas stosowania klasycznej metody oczyszczania w gradionym gradiencie gęstości duże hepatocyty tłuszczowe zostały utracone w supernatancie i tylko mniejsze chude hepatocyty są gromadzone w osadzie komórkowym.

Dzięki ulepszonemu protokołowi hepatocyty wypełnione lipidami nie zostały utracone, a wszystkie hepatocyty zostały granulowane. Powtarzalne mocowanie ułatwia proces spłukiwania. Dzięki temu wątroba jest optymalnie oczyszczana z pozostałych składników krwi, które mogłyby hamować enzymy trawienne.