Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Protokół ten zapewnia metodę badania funkcji komórek macierzystych jelita grubego w środowisku podatnym na manipulację przy niższych kosztach w czasie niż modele zwierzęce. Hodowla organoidów pozwala na badanie funkcji komórek macierzystych w środowisku wolnym od odporności. Pozwala to na określenie skutków konkretnej przyczyny, takiej jak nokaut klaudyny-7.

Zrozumienie mechanizmów funkcjonowania komórek macierzystych może rzucić światło na nowe cele terapeutyczne w chorobach wyniszczających, takich jak nieswoiste zapalenie jelit i rak jelita grubego. Aby rozpocząć izolację krypt okrężnicy od uśpionej myszy, wykonaj nacięcie o długości około dwóch cali wzdłuż linii środkowej myszy. Następnie przypnij skórę do tyłu, aby odsłonić brzuch.

Przetnij okrężnicę tuż poniżej kokum od strony bliższej i powyżej odbytnicy od strony dystalnej, aby odizolować okrężnicę. Następnie należy usunąć tkankę tłuszczową przyczepioną do jelita grubego za pomocą kleszczy. Po wypchnięciu kału z izolowanej okrężnicy płaskim końcem kleszczy, należy przeciąć tkankę wzdłużnie.

Umyj chusteczkę od 10 do 15 razy zimnym PBS, obracając chusteczkę w PBS między myciami kleszczami. Następnie za pomocą czystych, ostrych nożyczek pokrój tkankę na małe kawałki o wielkości od około trzech do pięciu milimetrów. Po wyizolowaniu okrężnicy od innej myszy poddanej eutanazji, połącz wszystkie fragmenty tkanek w 50-mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej zimne pożywki do dysocjacji nabłonka i inkubuj fragmenty tkanki okrężnicy w pożywce do dysocjacji nabłonka przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym kołysaniem.

Po inkubacji pozwól, aby fragmenty tkanki opadły na dno probówki. Po ustabilizowaniu się wyrzuć pożywkę dysocjacyjną nabłonka, nie naruszając fragmentów tkanki. Powtórz ten proces, myjąc chusteczkę 10 do 15 razy zimnym PBS.

Wyrzuć jak najwięcej PBS podczas końcowego prania. Następnie dodaj zimną pożywkę dysocjacyjną krypty do umytych kawałków tkanki okrężnicy w 50-mililitrowej probówce i potrząsaj ręcznie przez pięć do 10 minut. Pod kapturem do hodowli komórkowej przefiltruj pożywkę zawierającą tkankę za pomocą nylonowego sitka komórkowego o grubości 70 mikronów do świeżej 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

Po przefiltrowaniu odwirować probówkę o sile 200 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyrzucić supernatant bez naruszania granulowanych krypt. Ponownie zawiesić granulat w trzech do czterech mililitrach zimnego PBS. Odpipetować 10 mikrolitrów zawiesiny krypty w linii na szkiełku mikroskopowym.

Za pomocą mikroskopu policz liczbę pełnych, długich krypt, aby oszacować stężenie krypt i obliczyć odpowiednią objętość krypt wymaganą do umieszczenia 10 krypt na mikrolitr w 96-dołkowej płytce. Odwirować odpowiednią objętość izolowanych krypt w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej o stężeniu 200 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, nie naruszając granulowanych krypt.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów matrycy żelowej do granulowanych krypt bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Odczekaj jedną do dwóch minut, aż matryca żelu częściowo zestali się. Następnie rozłóż 10 mikrolitrów matrycy żelowej zmieszanej z kryptami w każdym dołku wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytki hodowlanej, aby utworzyć kształt kopuły.

Odczekaj od 10 do 20 minut, aż matryca żelowa zostanie w pełni zestalona, umieszczając płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla. Na koniec dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu roboczego pożywki L-WRN uzupełnionej antybiotykami do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Aby zebrać organoidy, usuń stare podłoża ze studzienek, stosując odsysanie próżniowe i utrwal organoidy za pomocą 4% paraformaldehydu na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń 4% paraformaldehydu ze studzienek przez odsysanie próżniowe i potraktuj organoidy 100 mikrolitrami 30% sacharozy na studzienkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 24 godzinach usuń 30% sacharozy ze studzienek przez odsysanie próżniowe, a następnie dodaj 10 mikrolitrów PBS do każdej studzienki. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie podrapać dno studzienki, aby oddzielić organoidy zawierające kopułę.

Następnie za pomocą pipety wyjmij PBS zawierający zdysocjowane organoidy ze studzienki i przenieś go do oznakowanej plastikowej formy wypełnionej w 90% optymalną temperaturą cięcia lub związkiem OCT. Kontynuuj proces, aż wszystkie organoidy zostaną usunięte ze wszystkich studzienek. Dodaj 2-metylobutan do kolby Dewara ze stali nierdzewnej zawierającej granulki suchego lodu, wystarczające do przykrycia granulek.

Błyskawiczne zamrożenie organoidu zawierającego blok OCT poprzez stałe trzymanie go powyżej 2-metylobutanu. Na koniec przechowuj blok OCT zawierający organoidy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do cięcia. Reprezentatywny obraz podkreśla pomyślny wzrost kolonoidów z normalnych krypt zawierających klaudynę-7.

Krypty zawierające klaudynę-7 zaczęły tworzyć sferoidy drugiego dnia, zaczęły pączkować piątego dnia i kontynuowały wzrost i pączkowanie, aż zostały zebrane w dziewiątym dniu. Natomiast krypty pozbawione klaudyny-7 nie tworzyły prawidłowych kolonoidów. Po leczeniu 4-hydroksytamoksyfenem przez dwa do trzech dni, krypty nokautujące klaudyny-7 pojawiły się jako okrągłe grudki komórek.

W przeciwieństwie do grupy kontrolnej, krypty nie wyrosły na zdrowe sferoidy. Barwienie immunofluorescencyjne dla klaudyny-7 w pobranych organoidach kontrolnych i warunkowym nokautem potwierdziło udany nokaut klaudyny-7 w hodowli. Koloidy kontrolne wykazywały bardzo mały sygnał apoptotyczny w dziewiątym dniu.

Jednak kolonoidy z nokautem klaudyny-7 wykazywały w tym samym czasie wysoką apoptozę. Zapewnić częściowe zestalenie przed poszyciem. Posiewanie przed częściowym zestaleniem spowoduje rozprzestrzenienie się matrycy żelowej i kopuła nie zostanie uformowana, co wpłynie na przetrwanie i wzrost krypt.

Protokół ten może być wykorzystany do odkrywania leków, badania komunikacji komórkowej, metabolizmu leków, żywotności, proliferacji i opracowywania spersonalizowanego leczenia dostosowanego do potrzeb pacjenta. Ustanowienie hodowli organoidów zrewolucjonizowało badanie chorób i medycynę spersonalizowaną.