Name: Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj trójwymiarową hodowlę organoidów okrężnicy myszy do badania funkcji komórek macierzystych jelit ex vivo. Ta metoda pozwala analizować wpływ knockoutu claudin-7 na aktywność komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez NIH DK103166.

Wszystkie eksperymenty i procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wschodniej Karoliny (ECU) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i ECU dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Indukowane, specyficzne dla jelit myszy z nokautem klaudyny-7 zostały wygenerowane przez skrzyżowanie transgenicznych myszy C57BL6 klaudyna-7-flox z myszami Villin-CreERT219. W badaniu wykorzystano samce i samice myszy w wieku 3 miesięcy.
1. Przygotowanie odczynnika/sprzętu
<ol>
	<li>Schłodzić następujące odczynniki/sprzęt przed rozpoczęciem związanych z nimi eksperymentów: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) do przemywania tkanki jelita grubego podczas izolacji krypty; kołyska/rotator (umieścić w lodówce o temperaturze 4 °C) do inkubacji z pożywką dysocjacyjną nabłonka.
	<ol>
		<li>Usunąć matrycę żelową (patrz tabela materiałów) z temperatury -20 °C i rozmrozić na lodzie przed posiewem.</li>
		<li>Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C przed odwirowaniem krypt do posiewu.</li>
		<li>Schłodzić 0,1% bufor cytrynianu sodu (patrz tabela materiałów) i przechowywać na lodzie przed wykryciem śmierci komórki in situ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogrzej następujące odczynniki przed rozpoczęciem związanych z nimi eksperymentów: 96-dołkową płytkę hodowlaną przez 24 godziny przed posiewem; Nośniki L-WRN (patrz Spis Materiałów) przed dodaniem do platerowanych krypt i przed każdą wymianą nośnika.
	<ol>
		<li>Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 94 °C przed barwieniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja krypty mysiej okrężnicy
<ol>
	<li>Przygotuj niezbędne nośniki, wykonując poniższe czynności. 
	UWAGA: Objętości pożywki są tutaj obliczane dla tkanki okrężnicy dwóch myszy.
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę do dysocjacji nabłonka: 30 ml 1x PBS + 400 μL 0,5 M EDTA + 50 μL 10 mM dichlorowodorku Y-27632 (patrz tabela materiałów). Trzymaj na lodzie do czasu użycia.</li>
		<li>Przygotować pożywkę do dysocjacji krypt: 10 ml 1x PBS + 10 μL 10 mM dichlorowodorku Y-27632. Trzymaj na lodzie do czasu użycia.</li>
		<li>Suplement pożywki L-WRN: 50 ml pożywki L-WRN + 47,5 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy z L-glutaminą + 500 μL L-glutaminy + 500 μl penniciliny/streptomycyny + 1 000 μl suplementu B-27 (50x) + 500 μl suplementu N2 (100x) + 50 μL roztworu buforowego HEPES (1 M) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przefiltrować kompletne (uzupełnione) pożywki L-WRN i podwielokrotność do przechowywania w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy. 
		UWAGA: Rozmrożone podłoże jest stabilne w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj izolację krypty.
	<ol>
		<li>W przypadku znieczulenia ogólnego dodaj 1 ml izofluranu do bawełny i umieść go w plastikowej kasecie w komorze anestezjologicznej o pojemności 0,09 stopy sześciennej (patrz Tabela materiałów). Umieść mysz w komorze anestezjologicznej, aż oddech ustanie (około 3-5 minut), a następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy20.</li>
		<li>Wykonaj około 2 nacięcia wzdłuż linii środkowej myszy, przypinając tylną skórę, aby odsłonić brzuch. Odizoluj okrężnicę, przecinając ją tuż pod jelitem ślepym od strony bliższej i powyżej odbytnicy od strony dystalnej21.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy usuń tkankę tłuszczową przyczepioną do jelita grubego. Delikatnie wypchnij kał za pomocą płaskiego końca kleszczy i rozetnij tkankę wzdłużnie.</li>
		<li>Umyj chusteczkę 10-15 razy zimnym 1x PBS za pomocą kleszczy, aby "zawirować" chusteczkę w PBS między praniami.</li>
		<li>Za pomocą czystych, ostrych nożyczek pokrój tkankę na małe kawałki o wielkości około 3-5 mm.</li>
		<li>Powtórz ten proces dla drugiej myszy i połącz fragmenty tkanki w probówce o pojemności 50 ml zawierającej zimny środek dysocjacyjny nabłonka (krok 2.1.1).</li>
		<li>Inkubować fragmenty tkanki jelita grubego w pożywce do dysocjacji nabłonka przez 90 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.</li>
		<li>Pozwól, aby fragmenty tkanki opadły na dno probówki, a następnie ostrożnie wyrzuć pożywkę dysocjacyjną nabłonka, nie naruszając tkanki. Powtórz ten proces, myjąc chusteczkę 10-15 razy zimnym 1x PBS. Wyrzuć jak najwięcej PBS podczas końcowego prania.</li>
		<li>Dodać pożywkę do dysocjacji krypt (krok 2.1.2) do probówki o pojemności 50 ml zawierającej fragmenty tkanki jelita grubego i wstrząsać ręcznie przez 5-10 minut. 
		UWAGA: Nośnik musi stać się mętny od oddzielonych krypt.</li>
		<li>Pod kapturem do hodowli komórkowej przefiltrować tkankę i pożywkę za pomocą nylonowego sitka komórkowego o wielkości 70 μm (patrz tabela materiałów) do świeżej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu zawierającego kryptę. 
		UWAGA: W zależności od sprzętu można przenieść odcedzoną pożywkę do probówki o pojemności 15 ml w celu odwirowania.</li>
		<li>Zawiesić granulat w ~ 3-4 ml zimnego 1x PBS.</li>
		<li>Odpipetować 10 μl wyizolowanych krypt w linii na szkiełku mikroskopowym. Pod mikroskopem policz liczbę pełnych, długich krypt, aby oszacować stężenie krypt na 10 μl.</li>
		<li>Oblicz odpowiednią objętość krypt do odwirowania, aby umieścić 10 krypt/μl w 96-dołkowej płytce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Poszycie krypty
<ol>
	<li>Odwirować odpowiednią objętość wyizolowanych krypt w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, nie naruszając przy tym granulowanych krypt.</li>
	<li>Dodać 100 μl matrycy żelowej (wystarczającej na dziewięć studzienek) do granulowanych krypt i ostrożnie pipetować, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza. 
	UWAGA: Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać szczegółowy opis sposobu mieszania matrycy żelowej i krypt. Zazwyczaj 100 μl wystarcza na dziewięć dołków.</li>
	<li>Pozostawić matrycę żelową do częściowego zestalenia się (~1-2 min).</li>
	<li>Płytka 10 μl matrycy żelowej zmieszana z kryptami w każdym dołku wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytki hodowlanej w celu utworzenia kształtu kopuły. 
	UWAGA: Umieść kopułę na środku studni. Uważaj, aby matryca żelowa nie rozprzestrzeniła się na boki studzienki. Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać szczegółowy opis krzepnięcia i powlekania.</li>
	<li>Pozostawić matrycę żelową do całkowitego związania przez 10-20 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .</li>
	<li>Przygotować końcowy roztwór roboczy pożywki L-WRN.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl pennicyliny/streptomycyny do 10 ml podwielokrotności pożywki L-WRN (patrz krok 2.1.3) (stabilnej przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Dodaj suplementy do 900 μl pożywki L-WRN z pennycyną/streptomycyną: 0,9 μl z 1 mg/ml EGF + 0,9 μl 10 mM dichlorowodorku Y-27632. 
		UWAGA: Tomy są oparte na dziewięciu odwiertach. Dichlorowodorek Y-27632 dodaje się dopiero w dniu 0 (w czasie posiewu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 100 μl pożywki do każdego dołka. Uważaj, aby nie zakłócić pracy kopuły.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
</ol>
4. Tworzenie nokautu claudin-7 w kulturze
<ol>
	<li>Pozwól kryptom normalnie rosnąć w kulturze przez 24 godziny po poszyciu.</li>
	<li>W probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodać 2,7 μl 4-hydroksytamoksyfenu (4OH-tamoksyfenu) o stężeniu 1 mmol/l do 900 μl pożywki L-WRN (stężenie końcowe 3 μmol/l) + 0,9 μl 1 mg/ml EGF. 
	UWAGA: Roztwór podstawowy 4OH-Tamoksyfenu przygotowuje się przez zmieszanie sproszkowanego 4OH-Tamoksyfenu (patrz Tabela Materiałów) z 1x PBS do stężenia 1 mmol/L.</li>
	<li>Usuń stare media ze studzienek za pomocą odsysania próżniowego.</li>
	<li>Dodać 100 μl pożywki zawierającej 4OH-tamoksyfen do każdej studzienki i oznaczyć je jako claudin-7 cKO/4OH-TAM. 
	UWAGA: DMSO należy dodać do studzienek kontrolnych. Świeże pożywki zawierające 4OH-tamoksyfen należy dodawać co 2 dni.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C do następnej zmiany pożywki (~2-3 dni).</li>
</ol>
5. Utrzymanie organoidów okrężnicy
UWAGA: Media muszą być wymieniane co 2-3 dni. Kultura do 12 dni.
<ol>
	<li>Przygotować świeży końcowy roztwór roboczy pożywki L-WRN: 900 μl pożywki L-WRN + 0,9 μl 1 mg/ml EGF.</li>
	<li>Usuń stare media ze studzienek za pomocą odsysania próżniowego. Dodaj świeże podłoże do studzienek. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie zakłócić pracy kopuły.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C do następnej zmiany podłoża. 
	UWAGA: Kultury mogą być utrzymywane i pasażowane przez czas pożądany w eksperymencie. Kultury do niniejszego badania były zazwyczaj utrzymywane przez 9-12 dni, ale można chcieć kontynuować dalej, przez 15 lub 20 dni.</li>
</ol>
6. Zbieranie i osadzanie organoidów okrężnicy
<ol>
	<li>Usuń stare media ze studzienek za pomocą odsysania próżniowego.</li>
	<li>Utrwalić organoidy za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: PFA jest materiałem toksycznym. Zachowaj ostrożność podczas korzystania z tego odczynnika.</li>
	<li>Usunąć 4% PFA ze studzienek poprzez odsysanie próżniowe i dodawać 30% sacharozy przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oznacz plastikową formę i napełnij ją do 90% związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Usuń 30% sacharozy ze studzienek poprzez odsysanie próżniowe. Dodaj 10 μl 1x PBS do każdej studzienki.</li>
	<li>Końcówką pipety delikatnie podrapaj dno studzienki, aby oddzielić kopułę zawierającą organoidy.</li>
	<li>Za pomocą pipety usunąć PBS zawierający zdysocjowane organoidy i załadować ciecz do formy zawierającej OCT. 
	UWAGA: Unikaj wprowadzania pęcherzyków do związku OCT.</li>
	<li>Kontynuuj ten proces, aż wszystkie organoidy zostaną usunięte ze wszystkich studzienek.</li>
	<li>W kolbie Dewara ze stali nierdzewnej dodać granulki suchego lodu i 2-metylobutan (tyle, aby pokryć granulki suchego lodu) (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Stabilnie trzymaj blok OCT zawierający organoidy powyżej 2-metylobutanu do błyskawicznego zamrożenia.</li>
	<li>Przechowywać blok OCT zawierający organoidy w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do sekcji (może być przechowywany przez okres do 1 roku).</li>
</ol>
7. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Blok OCT zawierający organoidy należy podzielić na części o grubości 5 μm za pomocą kriostatu (patrz tabela materiałów) w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Dla każdej sekcji sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że został uchwycony organoid. Po zakończeniu cięcia szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do barwienia (można je przechowywać do 6 miesięcy).</li>
	<li>Podgrzewać szkiełka w 10 mM buforze cytrynianu sodu przez 10 minut w temperaturze 94 °C. 
	UWAGA: Bufor wytwarza się przez rozpuszczenie cytrynianu sodu w wodzie dejonizowanej. Dostosuj pH do 6 za pomocą kwasu solnego.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do ostygnięcia na blacie przez 20 minut. Płucz wodą destylowaną przez 5 minut.</li>
	<li>Zmontuj szkiełka w stojaku do barwienia (patrz tabela materiałów) z 0,2% Triton X-100 i inkubuj z 100 mM glicyną przez 15 minut.</li>
	<li>Spłucz trzy razy 1x PBS przez 5 minut każdy. Blok z 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciw mysim królikom klaudyną-722 (rozcieńczony w 1% BSA) przez noc w temperaturze 4 °C. Płukać trzy razy 1x PBS przez 10 minut każdy.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym anty-królika Cy323 (rozcieńczony w 1% BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Spłucz trzy razy 1x PBS przez 10 minut każdy.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka za pomocą odpowiedniego medium montażowego (patrz Tabela materiałów) za pomocą DAPI i dodaj szkiełko nakrywkowe.</li>
</ol>
8. Wykrywanie śmierci komórki
<ol>
	<li>Utrwalić organoidy wewnątrz studzienek za pomocą 4% paraformaldehydu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płukać 1x PBS przez 5 min.</li>
	<li>Inkubować płytkę hodowlaną na lodzie z 0,1% Triton X-100 w zimnym 0,1% buforze cytrynianu sodu przez 2 minuty. Płukać dwukrotnie 1x PBS przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Przygotuj TUNEL reaction24,25 za pomocą TMR Red, zestawu do wykrywania śmierci komórki in situ(patrz Tabela Materiałów). Dodać 50 μl odczynników reakcyjnych TUNEL do każdego dołka.</li>
	<li>Inkubować w wilgotnej atmosferze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w ciemności. 
	UWAGA: Wszystkie pozostałe kroki należy wykonać w ciemności.</li>
	<li>Spłucz trzy razy 1x PBS przez 5 minut każdy. Inkubować z 1:2,500 Hoechst (rozcieńczonym w 1x PBS, patrz Tabela Materiałów) przez 3 minuty.</li>
	<li>Spłucz trzy razy 1x PBS przez 5 minut każdy. Użyj filtra TRITC do wizualizacji obrazów pod mikroskopem fluorescencyjnym (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids%3A+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li>
<li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+development+and+application+of+human+organoids%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257(2021).</li>
<li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334(2020).</li>
<li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li>
<li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+3D+cell+culture+models%3A+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li>
<li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intesitnal+enteroids%2Forganoids%3A+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li>
<li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li>
<li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li>
<li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudins+in+intestines%3A+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978(2013).</li>
<li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy%3A+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Management+and+Research%22%5BJournal%5D)">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li>
<li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+%28MET%29+to+inhibit+colon+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120(2015).</li>
<li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Management+and+Research%22%5BJournal%5D)">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383(2013).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li>
<li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611(2013).</li>
<li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li>
<li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038(2013).</li>
<li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice%3A+relationship+with+thiol+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-%CE%B2-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188(2017).</li>
<li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+organoids%3A+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Hodowla organoidów jest doskonałym modelem do badania funkcji komórek macierzystych, fizjologii jelit, odkrywania leków, chorób jelit człowieka oraz regeneracji i naprawy tkanek 7,8,9,10,11,26. Chociaż ma wiele zalet, może być trudny do ustalenia. Należy zachować ostrożność na wszystkich etapach całego protokołu, ale przede w...

Hodowla organoidów jelitowych to trójwymiarowy (3D) system ex vivo, w którym komórki macierzyste są izolowane z krypt jelitowych tkanki pierwotnej i umieszczane w matrycy żelowej1,2. Te komórki macierzyste są zdolne do samoodnowy, samoorganizacji i funkcjonalności narządów2. Organoidy naśladują mikrośrodowisko tkanek i są bardziej podobne do modeli in vivo niż dwuwymiarowych (2D) modeli hodowli komórkowych in vitro, chociaż mniej podatne na manipulację niż komórki3,4. Model ten eliminuje przeszkody napotykane w modelach 2D, takie jak brak prawidłowych adhezji komórka-komórka, interakcje komórka-matryca i jednorodne populacje, a także zmniejsza ograniczenia modeli zwierzęcych, w tym wysokie koszty i długie okresy czasu5. Organoidy jelitowe - określane również jako kolonoidy dla tych wyhodowanych z komórek macierzystych pochodzących z krypty okrężnicy - są zasadniczo mini-narządami, które zawierają nabłonek zawierający wszystkie typy komórek, które byłyby obecne in vivo, a także światło. Model ten pozwala na manipulowanie systemem w celu badania wielu aspektów jelita, takich jak nisza komórek macierzystych, fizjologia jelit, patofizjologia i morfogeneza jelit3,5,6. Stanowi również doskonały model do odkrywania leków, badania zaburzeń jelitowych u ludzi, takich jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD) i rak jelita grubego, opracowywania spersonalizowanych terapii dostosowanych do potrzeb pacjenta oraz badania regeneracji tkanek4,7,8,9. Ponadto system organoidów może być również używany do badania komunikacji komórkowej, metabolizmu leków, żywotności, proliferacji i odpowiedzi na bodźce7,8. Chociaż modele zwierzęce mogą być wykorzystywane do testowania potencjalnych terapii stanów patologicznych jelit, są one dość ograniczone, ponieważ badanie wielu leków jednocześnie stanowi wyzwanie. W in vivo występuje więcej zmiennych zakłócających, a związane z nimi koszty i czas są odpowiednio wysokie i długie. Z drugiej strony, system hodowli organoidów pozwala na badanie przesiewowe wielu środków terapeutycznych jednocześnie w krótszym czasie, a także pozwala na spersonalizowane leczenie poprzez zastosowanie hodowli organoidów pochodzących od pacjenta4,8. Zdolność organoidów okrężnicy do naśladowania organizacji tkanek, mikrośrodowiska i funkcjonalności sprawia, że są one również doskonałym modelem do badania regeneracji i naprawy tkanek9. Nasze laboratorium stworzyło system hodowli organoidów w jelicie cienkim w celu zbadania wpływu klaudyny-7 na funkcje komórek macierzystych jelita cienkiego10. W tym badaniu ustanowiono system hodowli organoidów w jelicie grubym w celu zbadania zdolności lub braku zdolności komórek macierzystych do samoodnawiania, różnicowania i proliferacji w modelu warunkowego nokautu klaudyny-7 (cKO).
Claudin-7 jest bardzo ważnym białkiem o ścisłym połączeniu (TJ), które ulega silnej ekspresji w jelicie i jest niezbędne do utrzymania funkcji i integralności TJ11. myszy cKO cierpią na fenotyp podobny do IBD, wykazując ciężkie stany zapalne, owrzodzenia, złuszczanie się komórek nabłonkowych, gruczolaki i podwyższony poziom cytokin11,12. Chociaż powszechnie przyjmuje się, że klaudyny są niezbędne dla funkcji bariery nabłonkowej, pojawiają się nowe role klaudyny; Biorą udział w proliferacji, migracji, progresji raka i funkcjonowaniu komórek macierzystych10,12,13,14,15,16,17. Obecnie nie wiadomo, w jaki sposób klaudyna-7 wpływa na niszę komórek macierzystych i funkcję komórek macierzystych okrężnicy. Ponieważ jelito szybko się odnawia mniej więcej co 5-7 dni, utrzymanie niszy komórek macierzystych i prawidłowe funkcjonowanie aktywnych komórek macierzystych jest niezbędne18. W tym miejscu stworzono system do badania potencjalnego wpływu regulacyjnego klaudyny-7 na niszę komórek macierzystych okrężnicy.

<table><tbody><tr><td>Eksykator próżniowy o pojemności 0,09 stopy sześciennej&nbsp;</td><td>Stany Zjednoczone Plastic Corp</td><td>78564</td><td>komora anestezjologiczna</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml mikroprobówki wirówkowe</td><td>ThermoFisher</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>2-metylobutan</td><td>Sigma</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>ThermoFisher</td><td>J61899. </td><td></td>AK</tr><tr><td>4-hydroksytamoksyfen (4OH-TAM)</td><td>Sigma</td><td>579002</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m nylonowe sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Claudin-7 przeciwciało przeciw mysiemu królikowi</td><td>Laboratoria immunobiologiczne&nbsp;</td><td>18875</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (24 x 50-1,5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>vwr</td><td>25608-916</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RCF BME, Typ 2</td><td>R& D Systems</td><td>3533-005-02</td><td>matryca żelowa</td></tr><tr><td>Cy3 przeciwciało anty-królicze</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Dewara</td><td>Thomas Scientific</td><td>1173F61</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Wysoka glukoza z L-glutaminą</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FLoid System obrazowania</td><td>ThermoFisher</td><td>4477136</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Gel II z DAPI</td><td>Electron Nauki mikroskopowe</td><td>17985-50</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>JT Baker</td><td>4059-02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M) Roztwór buforowy</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania śmierci komórek in situ, TMR Red</td><td>Roche</td><td>12156792910</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pivetal</td><td>07-893-8440</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Media</td><td>Harvard Medical School Pozyskiwanie i hodowla organoidów żołądkowo-jelitowych</td><td>Rdzeń N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw chirurgiczny myszy</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Optymalna temperatura skrawania (OCT) mieszanka&nbsp;</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sequenza Rack</td><td>vwr</td><td>10129-584</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-279</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Filtr próżniowy (0,22 &mikro; m; octan celulozy)</td><td>Corning</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Nabłonek jelitowy regeneruje się co 5-7 dni i jest kontrolowany przez populację komórek macierzystych nabłonka jelitowego (IESC) znajdującą się na dole regionu krypty. IESC obejmują aktywne komórki macierzyste, które samoodnawiają się i różnicują w różne typy komórek nabłonkowych, oraz spokojne komórki macierzyste, które służą jako rezerwowe komórki macierzyste w przypadku urazu. Regeneracja nabłonka jelitowego jest kontrolowana przez zdolności do samoodnawiania się i różnicowania tych aktywnych IESC. Ponadto równowaga populacji komórek macierzystych krypty i utrzymanie niszy komórek macierzystych są niezbędne do regeneracji jelit. Hodowla organoidów jest ważnym i atrakcyjnym podejściem do badania białek, cząsteczek sygnałowych i sygnałów środowiskowych, które regulują przeżycie i funkcje komórek macierzystych. Ten model jest tańszy, mniej czasochłonny i bardziej podatny na manipulację niż modele zwierzęce. Organoidy naśladują również mikrośrodowisko tkankowe, zapewniając znaczenie in vivo. Niniejszy protokół opisuje izolację krypt okrężnicy, osadzanie tych izolowanych komórek krypty w trójwymiarowym systemie matrycy żelowej i hodowlę komórek krypty w celu utworzenia organoidów okrężnicy zdolnych do samoorganizacji, proliferacji, samoodnawiania i różnicowania. Model ten pozwala manipulować środowiskiem - wybijając określone białka, takie jak klaudyna-7, aktywując/dezaktywując szlaki sygnałowe itp. - w celu zbadania, jak te efekty wpływają na funkcjonowanie komórek macierzystych okrężnicy. W szczególności zbadano rolę białka ścisłego połączenia klaudyny-7 w funkcji komórek macierzystych okrężnicy. Claudin-7 jest niezbędny do utrzymania homeostazy jelit oraz funkcji bariery i integralności. Nokaut klaudyny-7 u myszy wywołuje fenotyp podobny do choroby zapalnej jelit, wykazujący zapalenie jelit, przerost nabłonka, utratę masy ciała, owrzodzenia błony śluzowej, złuszczanie się komórek nabłonka i gruczolaki. Wcześniej informowano, że klaudyna-7 jest niezbędna do funkcjonowania komórek macierzystych nabłonka jelitowego w jelicie cienkim. W tym protokole ustanawia się system hodowli organoidów okrężnicy w celu zbadania roli klaudyny-7 w jelicie grubym.

Aby zbadać wpływ regulacyjny claudin-7 na komórki macierzyste jelita grubego, krypty jelitowe wyizolowano z tkanki okrężnicy myszy zgodnie z powyższym opisem, co przedstawiono na Rysunku 1A. Po wyizolowaniu krypt z tkanki pierwotnej, wysiano je w macierzy 3D na płytce 96-dołkowej i inkubowano przez 11 dni (Rysunek 1). Normalne, zdrowe krypty zamykają światło i przekształcają się w sferoidy do 2. dnia, a następnie około 5. dnia zaczynają pączkować i formować różn...

Obecny protokół opisuje ustanowienie systemu organoidów mysiego okrężnicy do badania aktywności i funkcjonowania komórek macierzystych okrężnicy w modelu nokautu klaudyny-7.

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Protokół ten zapewnia metodę badania funkcji komórek macierzystych jelita grubego w środowisku podatnym na manipulację przy niższych kosztach w czasie niż modele zwierzęce. Hodowla organoidów pozwala na badanie funkcji komórek macierzystych w środowisku wolnym od odporności. Pozwala to na określenie skutków konkretnej przyczyny, takiej jak nokaut klaudyny-7.Zrozumienie mechanizmów funkcjonowania komórek macierzystych może rzucić światło na nowe cele terapeutyczne w chorobach wyniszczających, takich jak nieswoiste zapalenie jelit i rak jelita grubego. Aby rozpocząć izolację krypt okrężnicy od uśpionej myszy, wykonaj nacięcie o długości około dwóch cali wzdłuż linii środkowej myszy. Następnie przypnij skórę do tyłu, aby odsłonić brzuch.Przetnij okrężnicę tuż poniżej kokum od strony bliższej i powyżej odbytnicy od strony dystalnej, aby odizolować okrężnicę. Następnie należy usunąć tkankę tłuszczową przyczepioną do jelita grubego za pomocą kleszczy. Po wypchnięciu kału z izolowanej okrężnicy płaskim końcem kleszczy, należy przeciąć tkankę wzdłużnie.Umyj chusteczkę od 10 do 15 razy zimnym PBS, obracając chusteczkę w PBS między myciami kleszczami. Następnie za pomocą czystych, ostrych no

three-dimensional-culture-murine-colonic-crypts-to-study-intestinal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie pokazujemy technikę izolowania całych krypt z jelita cienkiego myszy. Wyizolowane całe krypty mogą być wykorzystywane do rozmnażania długowiecznych i samoodnawiających się organoidów 3D in vitro.

Izolacja krypt jelitowych: metoda izolowania całych krypt z jelita cienkiego modelu myszy

Ulepszona technologia obrazowania pozwala na trójwymiarowe obrazowanie organów podczas rozwoju. W tym miejscu opisujemy cały system hodowli narządów, który umożliwia obrazowanie na żywo rozwijających się kosmków w jelicie płodu myszy.

System hodowli całego jelita moczowego u myszy płodu do manipulacji ex vivo szlakami sygnałowymi i trójwymiarowego obrazowania na żywo rozwoju kosmków

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Komórki macierzyste nabłonka jelitowego (ISC) są zmieszane z komórkami Panetha. Komórki te są zróżnicowanym potomstwem ISC, które wspiera ISC i zapewnia ochronę przeciwbakteryjną. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy transgeniczne warunkowe modele myszy, aby ustalić, że komórki Panetha odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu nabłonka jelitowego.

Protokoły analizy roli komórek Panetha w regeneracji jelita mysiego przy użyciu warunkowych modeli myszy Cre-lox

Opisujemy instrukcje krok po kroku, aby: 1) efektywnie konstruować organoidy jelitowe za pomocą nanocząsteczek magnetycznych do transdukcji soczewicowacej lub retrowirusowej, oraz 2) generować zamrożone skrawki z zmodyfikowanych organoidów. Podejście to zapewnia potężne narzędzie do efektywnej zmiany ekspresji genów w organoidach w celu zbadania dalszych efektów.

Inżynieria genetyczna pierwotnych organoidów jelitowych myszy z wykorzystaniem wektorów wirusowych transdukcji nanocząstek magnetycznych do zamrożonego cięcia

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

Procedura opisuje izolację kosmków od nabłonka jelitowego myszy poddawanego dedyferencjacji w celu określenia ich potencjału do tworzenia organoidów.

Hodowla 3D organoidów z nabłonka kosmków jelitowych poddawanego dedyferencjacji

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Opisujemy protokół szczegółowo opisujący izolację mysich krypt okrężnicy w celu opracowania 3-wymiarowych kolonoidów. Ustalone okokrody mogą być następnie ostatecznie różnicowane, aby odzwierciedlić skład komórkowy nabłonka gospodarza przed otrzymaniem prowokacji zapalnej lub skierowaniem do utworzenia monowarstwy nabłonka.

Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Poznaj trójwymiarową hodowlę organoidów okrężnicy myszy do badania funkcji komórek macierzystych jelit ex vivo. Ta metoda pozwala analizować wpływ knockoutu claudin-7 na aktywność komórek macierzystych.

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Przeglądaj więcej filmów