Name: Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj ocenę toksyczności terapii CART19 w modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną. Ta metoda pozwala badać mechanizmy działania limfocytów T z receptorem chimericznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), Departament Obrony (CA201127), Mayo Clinic K2R pipeline (S.S.K.), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (S.S.K.) oraz Fundację Predolin (R.L.S.). Ponadto chcielibyśmy podziękować personelowi Mayo Clinic NMR Core Facility. Rysunek 1 został utworzony w BioRender.com

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) Kliniki Mayo, Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC A00001767) oraz Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC, Bios00000006.04).
UWAGA: Wszystkie materiały używane do pracy z myszami muszą być sterylne.
1. Wstrzyknięcie busulfanu myszom NSG
<ol>
	<li>Zdobądź samce, 8-12 tygodniowe, z obniżoną odpornością, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) myszy i zważ je przed wstrzyknięciem. 
	UWAGA: W celu uzyskania istotności statystycznej zaleca się użycie co najmniej pięciu myszy na grupę i powtórzenie tego eksperymentu co najmniej raz na samicach.</li>
	<li>Przygotować busulfan do wstrzyknięcia dootrzewnowego (i.p.). Używając strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml, powoli i ostrożnie napełnij strzykawkę dokładnie 30 mg/kg busulfanu, a następnie wstrzyknij i.p myszom i umieść je z powrotem w klatce.</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie WSZYSTKICH blastów pochodzących od pacjenta (CD19+) myszom NSG
UWAGA: Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Kliniki Mayo (IBC, Bios00000006.04).
<ol>
	<li>Zbierz pierwotne blasty białaczkowe z krwi obwodowej pacjentów z nawrotową i oporną na leczenie ALL.</li>
	<li>Przygotować komórki docelowe do wstrzyknięcia dożylnego (dożylnego).
	<ol>
		<li>Policz komórki docelowe CD19+ za pomocą hemocytometru i zapisz końcową objętość i stężenie komórek. 
		UWAGA: Aby określić żywotność komórek, zdecydowanie zaleca się użycie błękitu trypanowego podczas liczenia komórek.</li>
		<li>Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 50 × 106 komórek/ml w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i umieścić na lodzie.</li>
		<li>Ostrożnie przetrząsać palcem probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml zawierającą komórki docelowe, aż komórki zostaną całkowicie zhomogenizowane.</li>
		<li>Używając strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml, powoli i ostrożnie napełnij strzykawkę dokładnie 100 μl przygotowanych komórek docelowych i przesuń strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki. 
		UWAGA: Objętość 100 μL pozwoli na podanie 5 × 106 komórek do każdej myszy.</li>
		<li>Umieść myszy w ciepłym świetle na 5-10 minut. Gdy żyła ogonowa stanie się obrzęknięta i bardziej widoczna gołym okiem, umieść myszy w odpowiedniej komorze ograniczającej.</li>
		<li>Przetrzyj ogon myszy wacikiem nasączonym alkoholem. Wstrzyknij komórki docelowe bezpośrednio do żyły ogonowej (iv) i umieść mysz z powrotem w klatce. Po zaszczepieniu komórek docelowych należy monitorować myszy codziennie lub zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji etycznej ds. zwierząt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena wszczepienia guza
<ol>
	<li>Począwszy od 6 tygodni po wstrzyknięciu komórki docelowej, oceń wszczepienie guza za pomocą cytometrii przepływowej w celu zmierzenia ekspresji komórek CD19 + we krwi obwodowej.</li>
	<li>Test krwi obwodowej w celu oceny ekspansji CD19 +
	<ol>
		<li>Pobrać krew od myszy 6-8 tygodni po wstrzyknięciu komórek CART19. 
		UWAGA: Do pobrania krwi można zastosować kilka metod. W przypadku tego protokołu preferowaną metodą jest pobieranie krwi podżuchwowej.</li>
		<li>Znieczulić mysz izofluranem w komorze indukcyjnej z 5% izofluranem. Po uzyskaniu znieczulenia należy utrzymać poziom 1-3% izofluranu wdychanego przez stożek nosowy. 
		UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie maści okulistycznej, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
		<li>Wyjmij mysz z komory i przytrzymaj mysz ręką niedominującą, chwytając luźną skórę nad szyją. Nakłuć żyłę lancetem nieco za żuchwą. 
		UWAGA: Do wejścia do żyły potrzebna jest tylko końcówka igły (1-2 mm).</li>
		<li>Ponieważ krew kapie, zbierz co najmniej 50 μl do probówki pokrytej heparyną i dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę w górę iw dół. Przenieść 30 μl krwi do probówki z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. 
		UWAGA: Aby uzyskać pozostałą krew, odwirować probówkę w temperaturze 17 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść surowicę (warstwę supernatantu) do czystej i znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C (do użycia w teście cytokin).</li>
		<li>Dodać 2 ml buforu do lizy (10x bufor lizacyjny na bazie chlorku amonu rozcieńczony do 1x przy użyciu wody wolnej od nukleaz) do 5 ml probówki okrągłodennej zawierającej krew. Bardzo dobrze wymieszaj, wirując rurkę. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby zapewnić prawidłową lizę czerwonych krwinek.</li>
		<li>Dodać 2 ml buforu przepływowego (PBS, 0,2 g/l chlorku potasu, 0,2 g/l jednozasadowego fosforanu potasu, 8 g/l chlorku sodu i 1,15 g/l dwuzasadowego fosforanu sodu zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej i 1% azydku sodu).</li>
		<li>Odwirować probówkę o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i dodać 2 ml buforu przepływowego. Powtórz ten krok prania 2 razy.</li>
		<li>Ostrożnie zdekantować zawartość probówki. Zwróć uwagę na niewielką ilość płynu z osadem pozostałym w probówce. Dodać 100 μl buforu przepływowego i bardzo dobrze zawiesić.</li>
		<li>Przenieść cały pozostały płyn z probówki przepływowej o pojemności 5 ml do płytki 96-dołkowej. Upewnij się, że każda próbka jest odpowiednio oznakowana. Dodać 100 μl buforu przepływowego do odpowiednich studzienek i odwirować 96-dołkową płytkę o masie 650 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń ekspansję komórek docelowych CD19 + za pomocą cytometrii przepływowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).
	<ol>
		<li>Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą 0,3 μl żywej/martwej barwie, 0,13 μg (2,5 μl) przeciwciała anty-ludzkiego CD19, 0,06 μg (2,5 μl) przeciwciała anty-ludzkiego CD45, 5 μg (2,5 μl) anty-mysiego CD45 i 42,2 μl buforu przepływowego, co daje łącznie 50 μl na próbkę. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Przemyć 150 μl buforu przepływowego, a następnie odwirować w stężeniu 650 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 195 μl buforu przepływowego i 5 μl kulek do liczenia.</li>
		<li>Zdobądź na cytometrze przepływowym, aby określić poziom ekspresji komórek CD19 +. Do celów bramkowania i analizy najpierw bramkuje się badaną populację (CD19+) na podstawie charakterystyki rozproszenia do przodu i bocznego, a następnie pojedynczą populację bramkowania, a następnie żywe komórki. Po bramkowaniu żywych komórek oceń ludzką populację CD45 w porównaniu z mysią populacją CD45, a z populacji ludzkiej bramkować populację docelową CD19 +.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określić ilościowo, aby określić ilość obecną w 70 μl, a następnie wyrazić w komórkach/μl za pomocą równania (1): 
	Bezwzględna liczba komórek CD19+ = ([Komórki CD19+/koraliki zliczające] × liczba kulek zliczających w granicach 5 μl)/70 
	UWAGA: Powtarzaj test krwi obwodowej co 5 dni, aby ocenić ekspansję komórek CD19 +. Pobieraj nie więcej niż 200 μl krwi łącznie co 2 tygodnie, zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji etyki zwierząt. Gdy myszy osiągną obciążenie chorobą ≥10 komórek/μl, losowo przydziel je do komórek CART19 lub grup kontrolnych (sekcja 4).</li>
</ol>
4. Podawanie komórek CART19 in vivo
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek CART19 (~Dzień 80): 
	UWAGA: Generowanie komórek CART19 zostało wcześniej opublikowane27,30,31. Procedura ta musi być przeprowadzana w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2+ przy użyciu techniki aseptycznej i środków ochrony osobistej.
	<ol>
		<li>Rozmrozić komórki CART19 w pojemniku do kąpieli wodnej (37 °C). Następnie umyj komórki w ciepłym podłożu z limfocytów T (TCM), aby usunąć dimetylosulfotlenek. 
		UWAGA: TCM składa się z 10% ludzkiej surowicy AB (v / v), 1% penicyliny-streptomycyny-glutaminy (v / v) i pożywki dla komórek krwiotwórczych bez surowicy 27,30.</li>
		<li>Odwirować komórki CART19 w temperaturze 300 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w ciepłym TCM do końcowego stężenia 2 × 106 komórek/ml. Pozostawić komórki koszyka w inkubatorze (37 °C, 5 % CO2 ) na noc, ale nie dłużej niż 16 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podawanie komórek CART19 przez wstrzyknięcie dożylne (dzień ~80)
	<ol>
		<li>Policz komórki CART19 i wiruj z prędkością 300 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki CART19 w 10 ml PBS i wirować w temperaturze 300 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić komórki CART19 do końcowego stężenia 40 × 106 komórek/ml za pomocą PBS, przenieść komórki do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i umieścić je na lodzie.</li>
		<li>Wykonaj iniekcję żyły ogonowej komórki CART19 (jak opisano powyżej), wstrzykując 100 μl zawieszonych komórek i.v. 
		UWAGA: Objętość 100 μL pozwoli na podanie 4 × 106 komórek do każdej myszy. Włączenie grupy nieleczonych myszy jako kontroli negatywnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ocena toksyczności komórek CART19
<ol>
	<li>Po podaniu komórek CART19 monitoruj myszy 2 razy dziennie, aby ocenić wszelkie zmiany w ich samopoczuciu, takie jak osłabienie motoryczne, zgarbione ciało i utrata masy ciała. 
	UWAGA: Wszystkie te zmiany fizyczne korelują z objawami CRS w tym modelu28.</li>
	<li>Gdy u myszy zacznie rozwijać się osłabienie motoryczne i redukcja masy ciała (redukcja o 10-20% w stosunku do wartości wyjściowej), należy pobrać krew obwodową, aby przeanalizować obciążenie guzem i przeprowadzić izolację surowicy pod kątem cytokin zgodnie z metodologią opisaną w sekcji 3 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Przechowywać probówki do mikrowirówek surowicy w temperaturze -80 °C i użyć surowicy do analizy chemokin i cytokin za pomocą testu Multiplex (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4). 
	UWAGA: Jeśli myszy wykazują oznaki paraliżu kończyn tylnych, wydają się być w stanie agonalnym lub ospałym, a utrata masy ciała wynosi > 20% ich masy ciała do punktu, który ogranicza ich zdolność do dotarcia do pożywienia i/lub wody, zostaną poddane eutanazji.</li>
</ol>
6. Obrazowanie MRI
UWAGA: Przedkliniczny (dla małych zwierząt) skaner MRI z pionowym magnesem otworowym został użyty do rezonansu magnetycznego in vivo i akwizycji obrazu32,33.
<ol>
	<li>Wymieszaj 120 μl gadolinu + 880 μl roztworu soli fizjologicznej i załaduj do strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml. Wstrzyknąć 100 μl każdej myszy (i.p.). 
	UWAGA: Gadolin należy wstrzyknąć 15-20 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
	<li>Znieczulić mysz za pomocą izofluranu (2-3%) w komorze indukcyjnej przez 10-15 min. 
	UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie maści okulistycznej, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
	<li>Umieść grzbiet myszy na sondzie kołyskowej kompatybilnej z gryzoniami. Następnie przystąp do ustawiania myszy, zaczepiając jej zębami o pasek gryzowy.</li>
	<li>Wciągnij głowę myszy do cewki głośności 25 mm i wyreguluj stożek nosowy podłączony do systemu znieczulenia izofluranem. Dokręć pokrętło belki gryzowej, aby utrzymać pozycję przez cały czas skanowania. 
	UWAGA: Jeśli przeprowadzasz badanie MRI ze wzmocnieniem kontrastowym, upewnij się, że gadolin (w tym przypadku) lub środek kontrastowy został wstrzyknięty co najmniej 10 minut przed umieszczeniem aparatu w magnesie otworowym. Przez cały czas obrazowania myszy będą znieczulone przez wdychanie 2-3% izofluranu w powietrzu przez stożek nosowy, a ich częstość oddechów będzie jednocześnie monitorowana.</li>
	<li>Do oceny oddechu należy użyć urządzenia do monitorowania oddychania/oddechu. 
	UWAGA: Ważne jest również, aby ocenić temperaturę ciała, aby zapobiec możliwej hipotermii spowodowanej długotrwałym narażeniem na znieczulenie. Zaleca się stosowanie poduszek grzewczych do kontrolowania temperatury ciała.
	<ol>
		<li>Przymocuj sondę monitora oddechu blisko membrany i zabezpiecz ją taśmą chirurgiczną. Utrzymuj częstość oddechów między 20-60 oddechami na minutę, aby stan myszy był stabilny. 
		UWAGA: Ta szybkość zapewnia bardziej stabilne obrazy MRI i zapobiega artefaktom ruchu na uzyskanym obrazie. Jeśli częstość oddechów jest wyższa niż 20-60 oddechów na minutę, należy zwiększyć stężenie izofluranu. Jeśli częstość oddechów jest mniejsza niż 20 oddechów na minutę, znieczulenie jest zbyt głębokie; Dlatego należy zmniejszyć koncentrację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włóż sondę zwierzęcą do małego otworu w systemie MRI dla małych zwierząt z otworem pionowym. Wyreguluj głowę zwierzęcia na środku cewki. Zabezpiecz urządzenie zamkiem, aby mogło stać pionowo, i podłącz instrument do komputera.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie (np. Paravision) i użyj go, aby skonfigurować pozycje skanowania i typy skanowania. Określ optymalne pozycje osiowe i strzałkowe, zachowując ich spójność dla wszystkich grup eksperymentalnych. 
	UWAGA: Zaleca się wykorzystanie skanu próbnego jako odniesienia przed właściwymi pełnowymiarowymi skanami MRI.</li>
	<li>Kontynuuj zbieranie danych MRI (zgodnie z wcześniejszym opisem32,34,35,36). Uzyskaj zarówno obrazy MRI T1-zależne, jak i T2-zależne, korzystając z sugerowanej konfiguracji wymienionej poniżej.
	<ol>
		<li>W przypadku obrazów MRI zależnych T1 należy użyć wielopunktowej sekwencji wielopunktowej wielorzędowej wieloechowej (MSME) T1 z czasem powtarzania (TR) 300 ms, czasem echa (TE) 9,5 ms, polem widzenia (FOV) 4 cm x 2 cm x 2 cm i matrycą 192 x 96 x 96.</li>
		<li>W przypadku obrazów MRI T2-zależnych należy użyć sekwencji Multislice Multiecho (MSME) o TR 300 ms, TE 9,5 ms, FOV 4 cm x 2 cm x 2 cm i matrycy 192 x 96 x 96</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania wyjmij sondę z otworu. Delikatnie wyjmij mysz, usuwając zęby z paska zgryzowego. Monitoruj zwierzę w oddzielnej klatce, dopóki nie będzie w pełni przytomne i nie odzyska odpowiednich funkcji motorycznych.</li>
	<li>Po ekstrakcji danych z oprogramowania użyj oprogramowania analitycznego do kwantyfikacji i renderowania objętości 3D (<silna klasa="xfig">Rysunek 4) obszarów hiperintensywności. 
	UWAGA: Jeśli to możliwe, zdecydowanie zaleca się posiadanie dwóch oddzielnych zaślepionych obserwatorów do analizy danych.</li>
</ol>

S.S.K. jest wynalazcą patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, na które udziela licencji Novartis (na mocy umowy między Mayo Clinic, University of Pennsylvania i Novartis) oraz Mettaforge (poprzez Mayo Clinic). R.L.S. i S.S.K. są wynalazcami patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Humanigen. S.S.K. otrzymuje fundusze na badania od Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs i Lentigen.

W niniejszym raporcie opisano metodologię oceny toksyczności związanej z komórkami CART przy użyciu modelu ALL PDX. Mówiąc dokładniej, model ten ma na celu naśladowanie dwóch zagrażających życiu toksyn, CRS i NI, których pacjenci często doświadczają po infuzji komórek CART. Podsumowuje wiele cech charakterystycznych toksyczności CART obserwowanych w klinice: utratę masy ciała, dysfunkcję motoryczną, zapalenie nerwów, produkcję cytokin zapalnych i chemokiny oraz infiltrację różnych komórek efektorowych do ośrodkowego ukła...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated from:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
to:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Brooke L. Kimball1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model

Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CART) zrewolucjonizowała dziedzinę immunoterapii nowotworów. Okazał się skuteczny w leczeniu nawrotowej/opornej na leczenie ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL), chłoniaka z dużych komórek B, chłoniaka z komórek płaszcza, chłoniaka grudkowego i szpiczaka mnogiego1,2,3,4,5,6,7, co doprowadziło do niedawnych zatwierdzeń FDA. Pomimo początkowych sukcesów w badaniach klinicznych, leczenie terapią komórkową CART powoduje toksyczność, która często jest poważna, a czasami śmiertelna. Najczęstsze objawy toksyczności po terapii komórkami CART obejmują rozwój CRS i NI, określany również jako zespół neurotoksyczności związanej z komórkami efektorowymi układu odpornościowego (ICANS)8,9. CRS jest spowodowany nadmierną aktywacją i masywną ekspansją komórek CART in vivo, co prowadzi do późniejszego wydzielania wielu cytokin zapalnych, w tym interferonu-γ, czynnika martwicy nowotworu-α, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) i interleukiny-6 (IL-6). Powoduje to niedociśnienie, wysoką gorączkę, zespół przesiąkania włośniczek, niewydolność oddechową, niewydolność wielonarządową, a w niektórych przypadkach śmierć10,11. CRS rozwija się w 50-100% przypadków po terapii komórkowej CART1911,12,13. ICANS to kolejne wyjątkowe zdarzenie niepożądane związane z terapią komórkową CART, które charakteryzuje się uogólnionym obrzękiem mózgu, splątaniem, otępieniem, afazją, osłabieniem motorycznym, a czasami drgawkami9,14. Każdy stopień ICANS występuje u maksymalnie 70% pacjentów, a stopnie 3-4 są zgłaszane u 20-30% pacjentów5,10,15,16. Ogólnie rzecz biorąc, CRS i ICANS są powszechne i mogą być śmiertelne.
Zarządzanie ICANS po terapii komórkowej CART jest wyzwaniem. Większość pacjentów z ICANS doświadcza również CRS17, który często może być leczony antagonistą receptora IL-6 tocilizumabem lub sterydami18. Poprzedni raport ujawnił, że wczesna interwencja tocilizumabu zmniejszała częstość występowania ciężkiego CRS, ale nie wpływała na częstość występowania ani nasilenie ICANS19. Obecnie nie ma skutecznego leczenia ani środka profilaktycznego dla ICANS, dlatego kluczowe jest zbadanie strategii prewencyjnych20.
Komórki mieloidalne i związane z nimi cytokiny/chemokiny są uważane za główne czynniki rozwoju CRS i ICANS21. Podczas gdy CRS jest bezpośrednio związany z ekstremalnym wzrostem cytokin i ekspansją limfocytów T, patofizjologia ICANS jest w dużej mierze nieznana22,23. Dlatego konieczne jest stworzenie modelu mysiego, który podsumowuje te toksyczne objawy po terapii komórkami CART, aby zbadać mechanizmy i opracować strategie zapobiegawcze.
Obecnie istnieje wiele przedklinicznych modeli zwierzęcych wykorzystywanych do badania, optymalizacji i walidacji skuteczności komórek CART, a także do monitorowania związanych z nimi toksyczności. Należą do nich myszy syngeniczne, ksenoprzeszczepowe, immunokompetentne transgeniczne, humanizowane transgeniczne i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów, a także modele naczelnych. Jednak każdy z tych modeli ma wady, a niektóre z nich nie odzwierciedlają prawdziwej skuteczności lub obaw dotyczących bezpieczeństwa komórek CART24,25. Dlatego konieczne jest staranne wybranie najlepszego modelu dla zamierzonych celów badania.
Ten artykuł ma na celu opisanie metodologii, która jest używana do oceny toksyczności związanej z komórkami CART, CRS i NI, przy użyciu modelu ALL od pacjenta (PDX) in vivo (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W szczególności w opisanych tutaj metodach komórki CART19 wygenerowane w laboratorium autorów są wykorzystywane zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami. Krótko mówiąc, ludzkie limfocyty T są izolowane ze zdrowych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej dawcy (PBMC) za pomocą techniki gradientu gęstości, stymulowane kulkami CD3 / CD28 w dniu 0 i transdukowane lentiwirusowo w dniu 1 za pomocą CAR składających się z ukierunkowanego na CD19 fragmentu zmiennego pojedynczego łańcucha połączonego z domenami sygnałowymi 4-1BB i CD3ζ. Te komórki CART są następnie rozszerzane, usuwane z koralików w 6 dniu i kriokonserwowane w 8 dniu26,27,28,29,30. Jak opisano wcześniej, myszy są poddawane leczeniu limfodepletingowemu, a następnie podaje się im blasty białaczkowe pochodzące od pacjenta (ALL)28. Po pierwsze, wszczepienie guza jest weryfikowane poprzez pobranie krwi podżuchwowej. Po ustaleniu odpowiedniego obciążenia nowotworem myszom podaje się komórki CART19. Następnie myszy są codziennie ważone, aby ocenić samopoczucie. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) u małych zwierząt wykonuje się w celu oceny NI, wraz z krwawieniem z ogona w celu oceny ekspansji limfocytów T i produkcji cytokin/chemokin. Techniki opisane poniżej są zdecydowanie zalecane do stosowania jako model do badania toksyczności związanej z komórkami CART w modelu PDX.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Tablet APC Anti-Human CD19</td><td>Biolegend</td><td>302211</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Prep Pad Wecol</td><td></td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Analyze 14.0 Analyze 14.0</td><td>AnalyzeDirect Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>https://analyzedirect.com/analyze14/</td></tr> <tr><td>Sztuczne łzy (olej mineralny i wazelina)</td><td>Akorn</td><td>17478-062-35</td><td>Miejscowy żel okulistyczny zapobiegający suchości oczu</td></tr><tr><td>Roztwór lizujący BD FACS&nbsp;</td><td>BD</td><td>349202</td><td>Bufor lizujący czerwone krwinki</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe BD Micro-Fin IV</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Brillian Violet 421 Anti-Human CD45</td><td>Biolegend</td><td>304032</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance II 7 Tesla&nbsp;</td><td>Maszyna do rezonansu magnetycznego</td> <td>Bruker Biospin</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Busulfan (NSC-750)</td><td>Selleckchem</td><td>S1692</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolutne koraliki do liczenia</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2 Cytometr</td><td>przepływowy Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Moduł sterujący/bramkujący ERT&nbsp;</td><td>SA Instruments</td><td>Model 1030</td><td>Monitorowanie małych zwierząt Układ oddechowy i bramkowy</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Bright-Line</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica AB; Dawcy płci męskiej; typu AB; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (płyn)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw do mocowania barwników Aqua Dead Cell, do wzbudzenia 405 nm</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Microvette 500 Heparyna litowa</td><td>Sarstedt</td><td>20.1345.100</td><td>Probówka do pobierania krwi</td></tr><tr><td>MILLIPLEX Huma/Cytokina/Chemokine Panel kulek magnetycznych</td><td>Millipore Sigma</td><td>HCYTMAG-60K-PX38</td><td>Test immunologiczny Multiplex do identyfikacji cytokin i chemokin</td></tr><tr><td>Omniscan</td><td>Ge Healthcare, Inc.</td><td>0407-0690-10</td><td>Środek przeciwutleniający na bazie gadolinu</td></tr><tr><td>Pd Anti-Mouse CD45</td><td>Biolegend</td><td>103106</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100x), płyn</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Probówka z polistyrenu z okrągłym dnem</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Azek sodu, 5% (w/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>Stal nierdzewna chirurgiczna Blade</td><td>Bard-Parker</td><td>371215</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Bezemisyjne Medium Krwiotwórcze</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów t przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Terapia komórkami CART (Chimeric antigen receptor T (CART) stała się potężnym narzędziem do leczenia wielu typów nowotworów złośliwych CD19+, co doprowadziło do niedawnego zatwierdzenia przez FDA kilku terapii komórkowych CART (CART19) ukierunkowanych na CD19. Jednak terapia komórkowa CART wiąże się z unikalnym zestawem toksyczności, które niosą ze sobą własną zachorowalność i śmiertelność. Obejmuje to zespół uwalniania cytokin (CRS) i zapalenie nerwów (NI). Wykorzystanie przedklinicznych modeli mysich miało kluczowe znaczenie w badaniach i rozwoju technologii CART do oceny zarówno skuteczności, jak i toksyczności CART. Dostępne modele przedkliniczne do testowania tej adoptywnej immunoterapii komórkowej obejmują modele syngeniczne, ksenoprzeszczepowe, transgeniczne i humanizowane mysie. Nie ma jednego modelu, który płynnie odzwierciedlałby ludzki układ odpornościowy, a każdy model ma mocne i słabe strony. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta przy użyciu blastów białaczkowych od pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną jako strategii oceny toksyczności związanej z CART19, CRS i NI. Wykazano, że model ten podsumowuje toksyczność związaną z CART19, a także skuteczność terapeutyczną, którą zaobserwowano w klinice.

Celem niniejszego protokołu jest ocena toksyczności związanej z komórkami CART z wykorzystaniem modelu mysiego PDX z komórek nowotworowych pacjentów z ALL (Rycina 1). W pierwszej kolejności myszy NSG otrzymały dożylne wstrzyknięcia busulfanu (30 mg/kg) w celu immunosupresji i ułatwienia przyjęcia komórek CART.28Następnego dnia otrzymali ~5 × 106 PBMC (dożylnie) pochodzące od pacjentów z ALL. Myszy monitorowano pod kątem przyjęcia przeszczepu przez ok. 13 ty...

Tutaj opisujemy protokół, w którym model ksenoprzeszczepu uzyskany od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną jest używany jako strategia oceny i monitorowania toksyczności związanej z receptorem chimerycznego antygenu T ukierunkowanym na CD19.

Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

Protokół ten wykorzystuje ludzki CAR-T i komórki nowotworowe i dokładnie pokazuje toksyczność związaną z podawaniem CART19. Dlatego podsumowując to, co zaobserwowano w klinice. Główną zaletą korzystania z tej platformy jest to, że zapewnia ona translowalny i klinicznie istotny model, w którym wykorzystywane są ludzkie limfocyty T i komórki nowotworowe.Model ten nie tylko pozwala na skuteczną ocenę toksyczności związanej z CART19, ale także pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób możemy przezwyciężyć te toksyczności poprzez ulepszone strategie leczenia. Na początek monitoruj myszy podawane CART19 dwa razy dziennie, aby ocenić wszelkie zmiany w ich samopoczuciu, takie jak osłabienie motoryczne, zgarbione ciało i utrata masy ciała. Gdy u myszy rozwinie się osłabienie motoryczne i redukcja masy ciała, zbierz ich krew obwodową, aby przeanalizować obciążenie guza.I przeprowadzić izolację surowicy pod kątem cytokin, jak opisano w manuskrypcie. Po izolacji przechowuj probówki do mikrowirówek surowicy w temperaturze 80 stopni Celsjusza i użyj cera do analizy chemokin i cytokin za pomocą testu multipleksowego. W przypadku obrazowania MRI wymieszaj 120 mikrolitrów gadolinu z 880 mikrolitrami roztworu soli fizjologicznej i załaduj do jednomililitrowej strzykawki insulinowej.Wstrzyknąć 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu dootrzewnowo każdej myszy. Znieczul mysz i umieść ją na sondzie kołyskowej kompatybilnej z gryzoniami. Następnie zaczep zęby o belkę gryzową.Wciągnij główkę myszy do 25-milimetrowej cewki objętościowej i wyreguluj stożek nosowy podłączony do systemu znieczulenia izofluranem. Dokręć pokrętło belki gryzowej, aby utrzymać pozycję przez cały czas skanowania. W celu oceny oddechu przymocuj sondę urządzenia do monitorowania oddychania blisko przepony i zabezpiecz ją taśmą chirurgiczną.Utrzymuj częstość oddechów między 20 a 60 oddechów na minutę, aby stan myszy pozostał stabilny. Włóż sondę zwierzęcą do małego otworu w systemie MRI dla małych zwierząt z otworem pionowym i wyreguluj głowę zwierzęcia w środku cewki. Za pomocą zamka zabezpiecz urządzenie w pozycji pionowej i podłącz przyrząd do komputera.Następnie otwórz oprogramowanie ParaVision, aby skonfigurować pozycje skanowania i typy skanowania. Określ optymalne pozycje strzałkowe i osiowe, zachowując ich spójność dla wszystkich grup eksperymentalnych. Aby zebrać dane MRI zależne od T1, użyj wielowarstwowej sekwencji wielowarstwowej T1 z czasem powtarzania 300 milisekund, czasem echa 9,5 milisekundy, polem widzenia 4,00 X 2,00 X 2,00 centymetra i matrycą 192 X 96 X 96.W przypadku obrazów MRI zależnych od T2 należy użyć sekwencji wielowarstwowej i wieloechowej o podobnych parametrach. Po zakończeniu skanowania wyjmij sondę z otworu i delikatnie wyjmij mysz, usuwając zęby z paska gryzowego. Po wyodrębnieniu danych z oprogramowania, użyj oprogramowania analitycznego do kwantyfikacji i renderowania objętości 3D regionów hiperintensywności populacji komórek nowotworowych CD19 + porównano między myszami leczonymi CART19 a myszami nieleczonymi za pomocą cytometrii przepływowej.Znaczne zmniejszenie masy ciała zaobserwowano u myszy leczonych komórkami CART19. Utrata masy ciała jest uważana za objaw pojawienia się CRS, który jest związany z toksycznością związaną z komórkami CART. Test multipleksowy ujawnił ekspresję cytokin i chemokin w surowicy myszy NSG przed i po podaniu CART19.Obrazy T2-zależne ujawniły dowody obrzęku i możliwego nacieku zapalnego podczas zapalenia nerwów u myszy leczonych CART19. Podczas gdy rezonans magnetyczny T1 wykazał poprawę kontrastu w miąższu mózgu, co wskazuje na zwiększoną przepuszczalność naczyń. Trójwymiarowe rekonstrukcje mózgu gryzonia zostały zestawione w oparciu o obszary hiperintensywności T1 odpowiadające przepuszczalności naczyń krwionośnych, która oddaje objętość wycieku gadolinu w mózgu.Ważne jest, aby pamiętać, że codzienne fizyczne monitorowanie myszy po podaniu CART19, wraz z krwawieniem obwodowym, będzie najlepszym wskaźnikiem do przeprowadzenia MRI w celu pełnej oceny wszelkich zmian w mózgu wskazujących na CRS lub neurotoksyczność. Technologia ta ma szerokie zastosowanie w dodatkowych terapiach komórkami CAR-T i pozwoli naukowcom skutecznie testować potencjalne toksyczności wynikające z nowych komórek CAR-T. Zaproponowany model jest kamieniem milowym w zrozumieniu, w jaki sposób toksyczność związana z komórkami CAR-T może być monitorowana, leczona i wykorzystywana do walidacji nowych modeli komórek CAR-T.

assessment-chimeric-antigen-receptor-t-cell-associated-toxicities

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Receptorowe kinazy tyrozynowe są ektopowo wyrażane w wielu nowotworach i zostały zidentyfikowane jako cele terapeutyczne w ostrej białaczce. W artykule opisano skuteczną strategię oceny przedklinicznej inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki.

Przedkliniczna ocena inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki

Chłoniak z komórek płaszcza (MCL) jest trudnym do leczenia zaburzeniem komórek B i równie trudno jest stworzyć mysi model ksenoprzeszczepu pierwotnego MCL w celu zbadania i opracowania terapii. W tym miejscu opisujemy udane wprowadzenie ksenoprzeszczepów MCL u myszy, aby pomóc zrozumieć ich biologię.

Wszczepienie guza w mysim modelu ksenoprzeszczepu chłoniaka z ludzkich komórek płaszcza

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i testów przedklinicznych mysich limfocytów T CD19 CAR metodą transdukcji retrowirusowej i wykorzystania jako terapii przeciwko ustalonemu syngenicznemu chłoniakowi B-komórkowemu A20 u myszy BALB/c z lub bez kondycjonowania wstępnego limfodepletingu.

Syngeniczny model chłoniaka z komórek B myszy do przedklinicznej oceny limfocytów T CD19 CAR

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Tutaj prezentujemy protokół do wywoływania i oceniania choroby w modelu xenoGVHD (xenoGVHD) ksenogenicznej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. xenoGVHD dostarcza model in vivo do badania immunosupresji ludzkich limfocytów T. Dodatkowo opisujemy, jak wykrywać ludzkie limfocyty T w tkankach za pomocą cyfrowego PCR jako narzędzia do ilościowego określania immunosupresji.

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Ten protokół opisuje generowanie myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS) do badań immunoonkologicznych. Przedstawiono instrukcje i rozważania dotyczące stosowania tego modelu do testowania ludzkich immunoterapeutyków na ludzkich nowotworach wszczepionych w tym modelu z naciskiem na scharakteryzowanie odpowiedzi ludzkiego układu odpornościowego na guz.

Testowanie immunoterapeutyków przeciwnowotworowych w humanizowanym modelu mysim z ludzkimi nowotworami

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Protokół ten opisuje ksenoprzeszczep in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjenta, który występuje 4 dni po wstrzyknięciu.

In Ovo Ksenografacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (PDX-ALL)

Protokół ma na celu opisanie mysiego modelu generującego nawroty ostrej białaczki limfoblastycznej, oparty na dynamice odpowiedzi na chemioterapię indukcyjną.

Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

Poznaj ocenę toksyczności terapii CART19 w modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną. Ta metoda pozwala badać mechanizmy działania limfocytów T z receptorem chimericznym.

Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną (Wideo) | JoVE Journal

Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną

Przeglądaj więcej filmów