Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną
10 lutego 2023
Tutaj opisujemy protokół, w którym model ksenoprzeszczepu uzyskany od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną jest używany jako strategia oceny i monitorowania toksyczności związanej z receptorem chimerycznego antygenu T ukierunkowanym na CD19.
Protokół ten wykorzystuje ludzki CAR-T i komórki nowotworowe i dokładnie pokazuje toksyczność związaną z podawaniem CART19. Dlatego podsumowując to, co zaobserwowano w klinice. Główną zaletą korzystania z tej platformy jest to, że zapewnia ona translowalny i klinicznie istotny model, w którym wykorzystywane są ludzkie limfocyty T i komórki nowotworowe.
Model ten nie tylko pozwala na skuteczną ocenę toksyczności związanej z CART19, ale także pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób możemy przezwyciężyć te toksyczności poprzez ulepszone strategie leczenia. Na początek monitoruj myszy podawane CART19 dwa razy dziennie, aby ocenić wszelkie zmiany w ich samopoczuciu, takie jak osłabienie motoryczne, zgarbione ciało i utrata masy ciała. Gdy u myszy rozwinie się osłabienie motoryczne i redukcja masy ciała, zbierz ich krew obwodową, aby przeanalizować obciążenie guza.
I przeprowadzić izolację surowicy pod kątem cytokin, jak opisano w manuskrypcie. Po izolacji przechowuj probówki do mikrowirówek surowicy w temperaturze 80 stopni Celsjusza i użyj cera do analizy chemokin i cytokin za pomocą testu multipleksowego. W przypadku obrazowania MRI wymieszaj 120 mikrolitrów gadolinu z 880 mikrolitrami roztworu soli fizjologicznej i załaduj do jednomililitrowej strzykawki insulinowej.
Wstrzyknąć 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu dootrzewnowo każdej myszy. Znieczul mysz i umieść ją na sondzie kołyskowej kompatybilnej z gryzoniami. Następnie zaczep zęby o belkę gryzową.
Wciągnij główkę myszy do 25-milimetrowej cewki objętościowej i wyreguluj stożek nosowy podłączony do systemu znieczulenia izofluranem. Dokręć pokrętło belki gryzowej, aby utrzymać pozycję przez cały czas skanowania. W celu oceny oddechu przymocuj sondę urządzenia do monitorowania oddychania blisko przepony i zabezpiecz ją taśmą chirurgiczną.
Utrzymuj częstość oddechów między 20 a 60 oddechów na minutę, aby stan myszy pozostał stabilny. Włóż sondę zwierzęcą do małego otworu w systemie MRI dla małych zwierząt z otworem pionowym i wyreguluj głowę zwierzęcia w środku cewki. Za pomocą zamka zabezpiecz urządzenie w pozycji pionowej i podłącz przyrząd do komputera.
Następnie otwórz oprogramowanie ParaVision, aby skonfigurować pozycje skanowania i typy skanowania. Określ optymalne pozycje strzałkowe i osiowe, zachowując ich spójność dla wszystkich grup eksperymentalnych. Aby zebrać dane MRI zależne od T1, użyj wielowarstwowej sekwencji wielowarstwowej T1 z czasem powtarzania 300 milisekund, czasem echa 9,5 milisekundy, polem widzenia 4,00 X 2,00 X 2,00 centymetra i matrycą 192 X 96 X 96
.W przypadku obrazów MRI zależnych od T2 należy użyć sekwencji wielowarstwowej i wieloechowej o podobnych parametrach. Po zakończeniu skanowania wyjmij sondę z otworu i delikatnie wyjmij mysz, usuwając zęby z paska gryzowego. Po wyodrębnieniu danych z oprogramowania, użyj oprogramowania analitycznego do kwantyfikacji i renderowania objętości 3D regionów hiperintensywności populacji komórek nowotworowych CD19 + porównano między myszami leczonymi CART19 a myszami nieleczonymi za pomocą cytometrii przepływowej.
Znaczne zmniejszenie masy ciała zaobserwowano u myszy leczonych komórkami CART19. Utrata masy ciała jest uważana za objaw pojawienia się CRS, który jest związany z toksycznością związaną z komórkami CART. Test multipleksowy ujawnił ekspresję cytokin i chemokin w surowicy myszy NSG przed i po podaniu CART19.
Obrazy T2-zależne ujawniły dowody obrzęku i możliwego nacieku zapalnego podczas zapalenia nerwów u myszy leczonych CART19. Podczas gdy rezonans magnetyczny T1 wykazał poprawę kontrastu w miąższu mózgu, co wskazuje na zwiększoną przepuszczalność naczyń. Trójwymiarowe rekonstrukcje mózgu gryzonia zostały zestawione w oparciu o obszary hiperintensywności T1 odpowiadające przepuszczalności naczyń krwionośnych, która oddaje objętość wycieku gadolinu w mózgu.
Ważne jest, aby pamiętać, że codzienne fizyczne monitorowanie myszy po podaniu CART19, wraz z krwawieniem obwodowym, będzie najlepszym wskaźnikiem do przeprowadzenia MRI w celu pełnej oceny wszelkich zmian w mózgu wskazujących na CRS lub neurotoksyczność. Technologia ta ma szerokie zastosowanie w dodatkowych terapiach komórkami CAR-T i pozwoli naukowcom skutecznie testować potencjalne toksyczności wynikające z nowych komórek CAR-T. Zaproponowany model jest kamieniem milowym w zrozumieniu, w jaki sposób toksyczność związana z komórkami CAR-T może być monitorowana, leczona i wykorzystywana do walidacji nowych modeli komórek CAR-T.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół wykorzystuje model ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną do oceny toksyczności związanej z limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym skierowanym przeciwko CD19. Stanowi on klinicznie istotną platformę do oceny toksyczności CART19 i ulepszania strategii terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Immunoterapia
- Biologia komórki
Wstęp
- Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR-T) jest obiecującą metodą leczenia białaczki.
- Zrozumienie toksyczności związanej z terapią CAR-T jest kluczowe dla bezpieczeństwa pacjentów.
- Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów mogą dokładniej odwzorowywać przebieg choroby u ludzi.
- Celem niniejszego badania jest wypełnienie luki między modelami przedklinicznymi a obserwacjami klinicznymi.
Cel badania
- Ocena toksyczności związanej z podawaniem CART19.
- Przedstawienie sposobów przezwyciężania tych toksyczności.
- Zwiększenie możliwości przeniesienia wyników badań przedklinicznych do warunków klinicznych.
Zastosowane metody
- Monitorowanie wskaźników dobrostanu u myszy, którym podano CART19.
- Ocena osłabienia motorycznego i utraty masy ciała u myszy.
- Pobieranie krwi obwodowej do analizy obciążenia nowotworowego.
- Wykorzystanie ludzkich komórek CAR-T oraz komórek nowotworowych w modelu.
Główne wyniki
- Model dokładnie odzwierciedla toksyczność obserwowaną w warunkach klinicznych.
- Osiągnięto efektywną ocenę toksyczności związanej z CART19.
- Uzyskano wiedzę na temat potencjalnych strategii łagodzenia toksyczności.
- Wykazano zasadność stosowania ludzkich komórek w badaniach przedklinicznych.
Wnioski
- Model ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta jest cennym narzędziem do badania terapii CAR-T.
- Wyniki mogą pomóc w opracowaniu lepszych strategii leczenia pacjentów z białaczką.
- Dalsze badania są niezbędne w celu poprawy wyników leczenia pacjentów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przedkliniczna ocena toksyczności związanej z komórkami CAR-T jest kluczowa dla minimalizacji ryzyka w programach translacyjnych ukierunkowanych na nowotwory CD19+. Opisany model mysi ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) umożliwia klinicznie istotną ocenę zespołu uwalniania cytokin (CRS) oraz neurostanu zapalnego (NI), co zwiększa pewność prognostyczną przed przejściem do fazy badań klinicznych. Podejście to wspiera decyzje dotyczące portfela badań poprzez wyjaśnienie profili toksyczności i okien terapeutycznych dla nowych konstruktów CAR-T.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną konstruktów CAR-T w kontekście choroby istotnym dla ludzi.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie CRS i NI obserwowanych w warunkach klinicznych.
- Ułatwia wczesną identyfikację potencjalnej toksyczności w celu priorytetyzacji kandydatów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną platformę do ilościowej oceny punktów końcowych toksyczności.
- Umożliwia powtarzalny pomiar profili cytokin i chemokin po podaniu CAR-T.
- Wspiera opracowywanie testów do monitorowania neurotoksyczności i efektów systemowych in vivo.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia spójność między wynikami toksyczności przedklinicznej a obserwacjami klinicznymi w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia dostosowanie postępów w rozwoju kandydatów CAR-T do poziomu ryzyka w oparciu o predykcyjne dane toksykologiczne.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów do monitorowania CRS i NI w przyszłych badaniach klinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model PDX łączy etap wczesnego odkrywania z walidacją przedkliniczną, umożliwiając opartą na hipotezach ocenę toksyczności terapii CAR-T skierowanych przeciwko ostrej białaczce limfoblastycznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących toksyczności indukowanej przez komórki CAR-T oraz analizę szlaków mechanistycznych.
- Przesiew: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych odczytów dla punktów końcowych toksyczności, w tym utraty masy ciała, poziomu cytokin i neurostanu zapalnego.
- Analityka: Integruje multipleksowe testy cytokin, obrazowanie MRI oraz cytometrię przepływową w celu kompleksowego profilowania toksyczności.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od wyników przedklinicznych do strategii zarządzania ryzykiem klinicznym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do oceny toksyczności powstających konstruktów CAR-T w różnych programach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie ryzyka toksyczności i walidacji celu dla terapii CAR-T.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w ocenie toksyczności i umożliwia skalowalne badania in vivo.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz ogranicza odpady na późnych etapach ze względu na nieprzewidziane toksyczności.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów CAR-T.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza ekspercka w zakresie modelowania ksenoprzeszczepów oraz pracy z komórkami CAR-T.
- Niezbędny jest dostęp do obrazowania MRI, analizy multipleksowej cytokin oraz infrastruktury do cytometrii przepływowej.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów monitorowania i analizy pomiędzy zespołami.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody dla różnych celów CAR-T lub modeli chorobowych.
- Ograniczenia modelu obejmują niepełne odzwierciedlenie ludzkiego układu odpornościowego.
