Name: Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Protokół zapewnia wysokie wydajności komórek nieaktywowanych, kluczowych dla badań w immunologii i biologii komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), przez Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) i Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16), oraz Brazylijskiej Narodowej Rady Rozwoju Naukowego i Technologicznego (CNPq).

Ten protokół został przeprowadzony zgodnie z Krajową Radą Kontroli Doświadczeń na Zwierzętach (Concea) i za zgodą Komitetu ds. Etyki i Wykorzystywania Zwierząt (CEUA). Myszy C57BL/6 zakupiono w Biotério Central z Federal University of Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brazylia. Środki ochrony indywidualnej (PPE), takie jak fartuchy laboratoryjne, rękawice i okulary ochronne, powinny być używane na wszystkich etapach opisanych w niniejszym protokole.
1. Przygotowanie supernatantu linii fibroblastów L-929 jako źródła M-CSF
<ol>
	<li>Rozmrozić komórki linii fibroblastów L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) i natychmiast rozpocząć proces hodowli, aby zachować żywotność.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, przenieś komórki linii fibroblastów L-929 z fiolki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej dodać 50 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), wolnego od wapnia i magnezu.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 300 x g, 4 °C przez 10 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 20 ml zmodyfikowanego Dulbecco Eagle′s medium-F12 uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1 ml penicyliny/streptomycyny (P/S) (DMEM/F12-10) za pomocą pipety serologicznej.</li>
	<li>Przenieść zawieszone komórki do kolby do hodowli komórek T75.</li>
	<li>Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5%CO2 aż do pełnego zbiegu. 
	UWAGA: Podczas manipulowania kolbą należy uważać, aby nie zwilżyć pokrywy roztworem, ponieważ może to być źródłem zanieczyszczenia. Aby uzyskać odpowiednią ilość supernatantu, konieczne jest odtworzenie komórek po pokryciu przez nie całej powierzchni kolby do hodowli komórkowych. Komórki L-929 są hamowane przez kontakt. Ciepły roztwór trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), DMEM/F12-10 i sterylny PBS do 37 °C, aby rozpocząć ekspansję hodowli komórkowej, zgodnie z opisem w poniższych krokach.</li>
	<li>Po osiągnięciu pełnej konfluencji wyrzucić supernatant z kolby do hodowli komórkowej do komory bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Przemyć kolbę do hodowli komórkowych 20 ml sterylnego PBS za pomocą pipety serologicznej i wyrzucić roztwór.</li>
	<li>Dodać 10 ml trypsyny/EDTA (0,05% roztwór) do kolby do hodowli komórkowej zawierającej przylegające komórki.</li>
	<li>Przenieść kolbę kultur komórkowych z przepływu laminarnego do inkubatora o temperaturze 37°C, 5% CO2 i inkubować przez 3 minuty.</li>
	<li>Potrząśnij kolbą do hodowli komórkowej, aby oddzielić komórki od powierzchni kolby hodowlanej i użyj mikroskopu, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zdysocjowane.</li>
	<li>Inaktywuj trypsynę/EDTA (0,05% roztwór) za pomocą 10 ml pożywki DMEM/F12-10.</li>
	<li>Przenieść roztwór za pomocą pipety serologicznej do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml podłoża DMEM/F12-10.</li>
	<li>Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do kolby do hodowli komórek T175 (kultura w stosunku 1:10).</li>
	<li>Powtórzyć procedurę, aby uzyskać dziesięć kolb do hodowli komórkowych T175.</li>
	<li>Dodać 50 ml DMEM/F12-10 do każdej kolby do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5%CO2 aż do pełnego zbiegu. 
	UWAGA: Te kroki gwarantują 500 ml supernatantu komórkowego L-929. W 5 dniu, po tym jak komórki pokryją powierzchnię kolby do hodowli komórkowej T175, supernatant zostanie wzbogacony o M-CSF i musi zostać zebrany14.</li>
	<li>Wyjąć kolbę do hodowli komórkowych z inkubatora w 5. dniu po zahamowaniu kontaktu.</li>
	<li>Przenieś pożywkę do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wirować przy 3 200 x g, w temperaturze 4 °C przez 10 min.</li>
	<li>Zebrać supernatant wzbogacony M-CSF i przenieść roztwór do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Wirowanie jest niezwykle ważne w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń z supernatantów.</li>
	<li>Supernatant L-929 jest wygodnym i niedrogim źródłem czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i zazwyczaj zawiera od 5 do 10 ng/ml M-CSF8. Supernatanty te zawierają również śladowe ilości innych cytokin i czynników wzrostu, ale nie wywierają głębokiego wpływu na fizjologię makrofagów15. Jednak oczyszczony M-CSF można zakupić i stosować jako alternatywę dla supernatantów L-929 w stężeniach od 1 do 2 ng/mL8.</li>
</ol>
2. Usunięcie kości udowej i piszczelowej
<ol>
	<li>Kontynuuj eutanazję 8-tygodniowego samca myszy typu dzikiego C57BL-6 przez zwichnięcie szyjki macicy po uduszeniu dwutlenkiem węgla, zgodnie z rezolucją normatywną nr 18 Krajowej Rady Doświadczeń na Zwierzętach (Concea) i za zgodą Komitetu ds. Etyki i Wykorzystywania Zwierząt (CEUA).</li>
	<li>Namocz mysz w 70% roztworze etanolu i sterylnymi nożyczkami wykonaj 1 cm nacięcie wzdłuż brzucha.</li>
	<li>Zdejmij skórę, aż mięsień tylnych nóg zostanie całkowicie odsłonięty.</li>
	<li>Usuń tylne nogi na wysokości bioder, uważając, aby nie złamać kości udowej i piszczelowej.</li>
	<li>Umieść tylne nogi w stożkowej probówce wirówkowej z 70% roztworem etanolu. 
	UWAGA: Zawsze używaj myszy wolnych od patogenów. Pamiętaj, aby zebrać obie nogi, aby uzyskać większą liczbę komórek. Krok 2 jest wykonywany w niesterylnym środowisku (stołowym). Dlatego ważne jest, aby ostrożnie usunąć kość udową i piszczelową, aby pozostały nienaruszone, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego. Pozostałe etapy tej procedury przeprowadza się w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym. Czas ekspozycji nóg na 70% roztwór etanolu powinien być ograniczony do 10 minut. Jeśli czas jest dłuższy, może to mieć wpływ na komórki progenitorowe szpiku kostnego.</li>
</ol>
3. Uzyskaj progenitory szpiku kostnego ze światła kości piszczelowej i udowej
<ol>
	<li>Wyjmij nogi z 70% roztworu etanolu i przenieś je do sterylnego PBS.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy i chusteczek dezynfekujących usuń wszystkie mięśnie i powięź. Po tym kroku kość powinna być czysta.</li>
	<li>Użyj sterylnego ostrza skalpela chirurgicznego, aby przeciąć nasadę kości na obu końcach, aby odsłonić szpik kostny.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 20 ml 10 ml sterylnego PBS uzupełnionego 2% roztworem penicyliny/streptomycyny i podłącz igłę 26 G.</li>
	<li>Jedną ręką przytrzymaj kość za pomocą anatomicznych kleszczy preparacyjnych, a drugą użyj do wprowadzenia igły do jamy kostnej. Uważaj, aby nie zmiażdżyć kości kleszczami.</li>
	<li>Umyj wnętrze kości za pomocą PBS i zbierz szpik kostny do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej. Po tym kroku jama kostna powinna wydawać się biała.</li>
	<li>Odwirować zebrane komórki przez 10 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml DMEM/F12-10.</li>
	<li>Homogenizuj i dodaj kolejne 9 ml pożywki DMEM/F12-10, aby uzyskać komórki do całkowitej objętości 10 ml.</li>
</ol>
4. Kultura makrofagów
<ol>
	<li>Dodać 1 ml komórek progenitorowych do każdej z okrągłych plastikowych szalek Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm (w sumie 10 szalek), rozprowadzając komórki na płytkach za pomocą pipety, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie. Nie używaj naczyń poddanych działaniu kultur tkankowych.</li>
	<li>Do każdej płytki dodać 9 ml DMEM/F12-10 uzupełnionego 20% supernatantu komórkowego L-929.</li>
	<li>Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Trzeciego dnia dodaj 10 ml pożywki DMEM/F12-10 uzupełnionej 20% supernatantu komórek L-929 do każdej potrawy. W ten sposób szalki hodowlane mają teraz łącznie 20 ml pożywki hodowlanej, wystarczającej do wzrostu komórek do końca ich dojrzewania. 
	UWAGA: Nie wolno używać naczyń poddanych kulturom tkankowym, ponieważ makrofagi, jako naturalne przylegające komórki charakteryzujące się silnymi interakcjami z powierzchniami, nie będą później łatwo oddzielić się od naczynia. Zwykle komórki progenitorowe jednej myszy (dwie kości udowe) można wysiać na 10 szalkach hodowlanych. Komórki progenitorowe przekształcą się w makrofagi, które można stosować od 7 do 10 dnia inkubacji. Potwierdzenie dojrzewania identyfikuje się na podstawie zmian w morfologii makrofagów. Dojrzałe makrofagi są przylegające i wykazują niejednorodną morfologię, co tłumaczy się emisją pseudopodiów w różnych kierunkach. Przykłady tych dojrzałych komórek przedstawiono w reprezentatywnych wynikach.</li>
</ol>
5. Zbieranie makrofagów
<ol>
	<li>Odrzuć supernatanty ze wszystkich naczyń hodowlanych.</li>
	<li>Umyj każde naczynie hodowlane 10 ml ciepłego (37 °C) sterylnego PBS wolnego od Mg2+ i Ca2+</li>.
	<li>Wyrzuć roztwór z każdego naczynia.</li>
	<li>Podgrzej wstępnie nieenzymatyczny roztwór do dysocjacji komórek do 37 °C i dodaj 3 ml do każdego naczynia. Inkubować przez 10 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Użyj odwróconego mikroskopu, aby zobaczyć, czy makrofagi dysocjują od szalek hodowlanych. 
	UWAGA: Użycie plastikowych płytek niepoddanych hodowli tkankowej powinno umożliwić łatwą dysocjację komórek i uniknąć konieczności zeskrobywania komórek z płytki.</li>
	<li>Umyj naczynia za pomocą pipety serologicznej z nieenzymatycznym roztworem do dysocjacji komórek, wykonując ruchy okrężne, aby potwierdzić, że wszystkie makrofagi zostały oddzielone od naczynia.</li>
	<li>Zebrać roztwór wszystkich szalek hodowlanych do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 10 ml sterylnego, wstępnie ogrzanego PBS do pustych szalek hodowlanych i postępować jak w kroku 5.4. Procedura ta jest powtórzeniem kroku 5.4 i ma na celu zagwarantowanie, że wszystkie makrofagi zostaną zebrane.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g, 4 °C przez 10 min.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z 1 ml DMEM/F12-10. Homogenizuj powoli i ostrożnie w górę iw dół za pomocą pipety, aby uniknąć uszkodzenia komórek.</li>
	<li>Przygotować podwielokrotność 10 μl roztworu makrofagów rozcieńczonego 10 μl błękitu trypanowego, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: W dniu 7 każde danie wyprodukuje około 2 x 106 makrofagów. Oznacza to, że jedna mysz może wyprodukować około 2 x 107 pierwszorzędowych makrofagów po zebraniu na dziesięciu płytkach. Ponieważ M-CSF napędza tylko dojrzewanie makrofagów, procedura gwarantuje populację komórek, która jest zasadniczo tylko makrofagami i wolna od innych zanieczyszczających leukocytów16.</li>
</ol>

<ol><li>Gomez Perdiguero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li>
<li>van Furth, R., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+kinetics+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The origin and kinetics of mononuclear phagocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 128 (3), 415-435 (1968).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).</li>
<li>Shapouri-Moghaddam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity%2C+polarization%2C+and+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6425-6440 (2018).</li>
<li>Davies, J. Q., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 290, 91-103 (2005).</li>
<li>Jin, X., Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+macrophage+colony-stimulating+factor+differentiated+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54244(2016).</li>
<li>Gonçalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-16 (2015).</li>
<li>Varol, C., Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+development+and+tissue+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages: development and tissue specialization.</a> Annual Review of Immunology. 33, 643-675 (2015).</li>
<li>Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+proliferation+and+apoptosis+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).</li>
<li>Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+polarization+of+murine+bone+marrow-derived+and+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).</li>
<li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li>
<li>Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+macrophage+phagocytosis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro macrophage phagocytosis assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).</li>
<li>Hosoe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tumoricidal+macrophages+from+bone+marrow+cells+of+normal+mice+or+mice+bearing+a+colony-stimulating-factor-producing+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).</li>
<li>Rice, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rM-CSF+efficiently+replaces+L929+in+generating+mouse+and+rat+bone+marrow-derived+macrophages+for+in+vitro+functional+studies+of+immunity+to+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria.</a> Journal of Immunological Methods. 477, 112693(2020).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophages+%28BMM%29%3A+isolation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).</li>
<li>Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li>
<li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1).</a> Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).</li>
<li>Bou Ghosn, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+physically%2C+functionally%2C+and+developmentally+distinct+peritoneal+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Wytwarzanie populacji makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego jest podstawowym krokiem w wielu eksperymentalnych modelach biologii komórki, zwłaszcza gdy ważne jest uzyskanie jednorodnej populacji komórek pierwotnych. Jak wspomniano, komórki progenitorowe mogą przekształcać się w makrofagi tylko w obecności M-CSF. Supernatanty komórkowe L-929 mogą być stosowane jako główne źródło M-CSF. Poza kosztami, nie ma problemu z użyciem samego rekombinowanego M-CSF 8,17...

Monocyty i makrofagi to jednojądrzaste fagocyty, które mogą pochodzić od komórek progenitorowych w szpiku kostnym. Ostatnie badania wykazały, że makrofagi również pochodzą z erytro-mieloidalnych komórek progenitorowych pochodzących z woreczka żółtkowego1. Niezależnie od ich pochodzenia, leukocyty te pełnią ważne funkcje efektorowe w homeostazie i zapaleniu2,3. Monocyty to komórki z krwi obwodowej, które mogą dalej różnicować się w makrofagi w tissue2,4, podczas gdy makrofagi to heterogeniczne komórki, które wykazują fenotypy i funkcje regulowane przez lokalną ekspozycję na czynniki wzrostu i cytokiny5. Ponieważ makrofagi wykazują taką różnorodność funkcjonalną, zostały przebadane w wielu modelach chorobowych. W związku z tym hodowla makrofagów in vitro stała się ważnym narzędziem do zrozumienia ich fizjologii i roli w różnych chorobach. Szpik kostny jest ważnym źródłem komórek progenitorowych, w tym progenitorów makrofagów, które można izolować i namnażać, wykładniczo zwiększając liczbę uzyskanych makrofagów. Ponadto makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego są szczególnie ważne, aby uniknąć efektów generowanych przez mikrośrodowisko tkankowe, ponieważ makrofagi zmieniają swój fenotyp w odpowiedzi na różne bodźce w tkankach6,7. Progenitorzy szpiku kostnego przekształcają się w makrofagi po ekspozycji na czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF)8. Makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego nie można odróżnić od makrofagów pochodzących z monocytów na podstawie markerów biochemicznych w tkance. Komórki te reprezentują wysoce jednorodną populację komórek pierwotnych, która pod wieloma innymi względami jest porównywalna do makrofagów otrzewnowych6,9.
Ze względu na ich niejednorodny zestaw funkcji komórkowych, makrofagi od dawna są dokładnie badane przez badaczy. Komórki te mogą być wykorzystywane w różnych modelach eksperymentalnych, w tym w chorobach zakaźnych i zapalnych, ponieważ występują w tych procesach10,11. Mogą być również przydatne do badania polaryzacji makrofagów w odpowiedzi na różne bodźce mikrośrodowiskowe12,13. W związku z tym przedstawiono prosty i niezawodny protokół w celu uzyskania dużej liczby pierwotnych makrofagów ze szpiku kostnego myszy.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 20 cm³</td><td>DESCARPACK</td><td>SI100S4G</td><td>Sterylna strzykawka</td></tr><tr><td>Igły 26-G</td><td>BD</td><td>497AQDKT7</td><td>Sterylne igły</td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td>Plastikowe probówki stożkowe odpowiednie do wirowania</td></tr><tr><td>70% roztwór etanolu</td><td>EMFAL</td><td>490</td><td>Roztwór etanolu do esterylizacji</td></tr><tr><td>Rozwarstwienie anatomiczne kleszcze</td><td>3B SCIENTIFIC</td><td>W1670</td><td>Przechowywać w sterylnej zlewce zawierającej 70% roztwór etanolu</td></tr><tr><td>C57Bl/6 mysz typu dzikiego</td><td>Zakupiona od Biot&eacute; rio Central na Uniwersytecie Federalnym Minas Gerais</td><td>Nie dotyczy</td><td>Myszy muszą być wolne od specyficznych patogenów, w wieku od 6 do 10 tygodni. Myszy muszą zostać zakwaterowane co najmniej tydzień wcześniej, aby mogły dojść do siebie po stresie związanym z transportem</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T175</td><td>GREINER</td><td>C7481-50EA</td><td>Kolba T-175, z szyjką skośną, powierzchnia 75 cm2, z nasadką filtrającą, wolna od DNaz, bez RNaz</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T75</td><td>GREINER</td><td>C7231-120EA</td><td>Kolba T-75, z pochyloną szyjką, powierzchnia 75 cm2, z nasadką filtrującą, bez DNaz, </td></tr><tr><td>Chusteczki dezynfekujące bez RNaz czy chusteczki dla niemowląt?</td><td>CLOROX</td><td>Nie dotyczy</td><td>Pomaga w czyszczeniu kości</td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>GIBCO</td><td>15230</td><td>Sterylna woda destylowana</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie dotyczy Nie dotyczy</td> Dodaj <td>10 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1 ml penicyliny/streptomycyny (P/S) do DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10 + supernatant komórek L-929</td><td>Nie dotyczy</td> Nie <td>dotyczy</td><td>Dodać 20% supernatantu z hodowli komórek L929 na DMEM/F-12-10</td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Medium - F12 (DMEM/F12)</td><td>GIBCO</td><td>12500096</td><td>DMEM: F-12 Medium zawiera 2,5 mM L-glutaminy, 15 mM HEPES, 0,5 mM pirogronianu sodu i 1200 mg/L wodorowęglanu sodu. Zawiesić proszek w 1 litrze wody destylowanej i dodać 3,7 g wodorowęglanu sodu. Dostosować pH do 7,2 i przefiltrować za pomocą 0,22 &mikro;M. Przechowywanie w temperaturze 2 - 8 & stopni; C zamrażarka</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie, Stany Zjednoczone (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10082147</td><td>Wzbogacenie hemocytometru DMEM-F12</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z359629</td><td>Służy do liczenia makrofagów w mikroskopii</td></tr><tr><td>Komórki L-929</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>ATCC # CCL-1</td><td>L-929 to linia komórek fibroblastów myszy stosowanych jako źródło czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF)</td></tr><tr><td>Zaćmienie Nikon TI&nbsp;</td><td>NIKON&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nikon TI Eclipse to mikroskop fluorescencyjny i z kontrastem fazowym</td></tr><tr><td>Nieenzymatyczny roztwór do dysocjacji komórek</td><td>CELLSTRIPER (CORNING)</td><td>25-056-CI</td><td>Nieenzimatyczny roztwór do dysocjacji komórek usuwa makrofagi z płytki, nie uszkadzając ich</td></tr><tr><td>Niepoddane działaniu metody Okrągłe szalki hodowlane bez obróbki 100 & razy; 20&ndash; </td><td>mm CORNING CLS430591</td><td></td><td>Nie stosować szalek Petriego poddanych działaniu kultur tkankowych ani żadnej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych</td></tr><tr><td>P3199 Penicylina G Sól potasowa</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>113-98-4</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> penicyliny i streptomycyny (P/S) <td>Stosować 0,26 grama penicyliny i 0,40 grama streptomycyny. Wymieszać z 40 ml sterylnego PBS. Wewnątrz poziomej komory z przepływem laminarnym użyj 0,22 &mikro; M przefiltrować i przechowywać porcje 1,0 ml w probówkach do mikrofug o pojemności 1,5 ml w zamrażarce (-20&deg; C)</td></tr> <tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami wolna od wapnia i magnezu (PBS)</td><td>MEDIATECH</td><td>21-040-CM</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>siarczan streptomycyny S7975, 650-850U / mg</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki Pipety serologiczne 10 ml lub 25 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>861254001</td><td>Pipety serologiczne stosuje się objętości większe niż 1 ml</td></tr><tr><td>wodorowęglanu sodu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>144-55-8</td><td>Poprawka pH dla oprogramowania DMEM-F12</td></tr><tr><td>Nis Elements Viewer</td><td>NIKON</td><td>Nie dotyczy</td><td>NIS-Elements Viewer to bezpłatny, samodzielny program do przeglądania plików graficznych i zestawów danych</td></tr><tr><td>Sterylny PBS i 2% roztwór P/S</td><td>LABORCRIN</td><td>590338</td><td>Dodać 1 ml P/S do 40 ml sterylnego PBS</td></tr><tr><td>Nożyczki do prostych tęczówek</td><td>PBS KATENA</td><td>Nie dotyczy</td><td>Przechowywać w sterylnej zlewce zawierającej 70% roztwór etanolu</td></tr><tr><td>Supernatant komórek L-929</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie dotyczy</td><td>L-929 to linia mysich komórek fibroblastów wykorzystywanych jako źródło czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF). Supernatant L-929 uzyskano z protokołu</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela chirurgicznego nr 24 Stal nierdzewna</td><td>SWANN-MORTON</td><td>311</td><td>Służy do odsłaniania nasady kości</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>GIBCO</td><td>15250061</td><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%, jest rutynowo stosowany jako barwienie komórek do oceny żywotności komórek za pomocą testu wykluczenia barwnika</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny/EDTA 0,05%</td> <td>GIBCO</td><td>25300-062</td><td>Służy do dysocjacji komórek z butelki hodowlanej</td></tr><tr><td>Woda do wstrzykiwań (WFI) do hodowli komórkowych</td><td>GIBCO</td><td>A12873</td><td>Sterylna i wolna od endotoksyn woda</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Makrofagi pełnią ważne funkcje efektorowe w homeostazie i stanach zapalnych. Komórki te są obecne w każdej tkance w organizmie i mają ważną zdolność do zmiany swojego profilu w zależności od bodźców obecnych w mikrośrodowisku. Cytokiny mogą głęboko wpływać na fizjologię makrofagów, zwłaszcza IFN-γ i interleukiny 4, generując odpowiednio typy M1 i M2. Ze względu na wszechstronność tych komórek, produkcja populacji makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego może być podstawowym krokiem w wielu eksperymentalnych modelach biologii komórki. Celem tego protokołu jest pomoc naukowcom w izolacji i hodowli makrofagów pochodzących z komórek progenitorowych szpiku kostnego. Progenitorzy szpiku kostnego od myszy C57BL / 6 wolnych od patogenów są przekształcani w makrofagi po ekspozycji na czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), który w tym protokole jest uzyskiwany z supernatantu mysiej linii fibroblastów L-929. Po inkubacji dojrzałe makrofagi są dostępne do stosowania od7 do 10dnia. Pojedyncze zwierzę może być źródłem około 2 x 107 makrofagów. Dlatego jest to idealny protokół do pozyskiwania dużych ilości pierwotnych makrofagów przy użyciu podstawowych metod hodowli komórkowych.

Makrofagi są dużymi, przylegającymi komórkami o szczególnych właściwościach fizjologicznych. W kulturze wykazują one różnorodność prezentacji morfologicznych ze względu na zdolność do przylegania do szkła i plastiku, a ich typowa, rozprzestrzeniona morfologia wiąże się z emisją wypustek cytoplazmatycznych (Rycina 1). Gdy progenitorzy szpiku kostnego zostaną poddani działaniu M-CSF z supernatantu komórek L-929 i rozpoczną transformację w dojrzałe makrofagi, stają się oni przylegający do płytk...

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Protokół ten ma na celu uzyskanie dużych ilości niestymulowanych makrofagów, które pochodzą ze szpiku kostnego i nigdy nie były narażone na działanie czynników tkankowych lub cytokin. Główną zaletą tej techniki jest liczba komórek pozyskanych od jednego zwierzęcia. Przy odpowiedniej procedurze można uzyskać około 2 razy 10 do mocy 7 makrofagów.Ta metoda może pomóc naukowcom z różnych dziedzin badających makrofagi, takich jak biologia komórki, patologia, immunologia i parazytologia, Ponieważ komórki są zawsze podatne na zanieczyszczenie, ostrożność przy wszystkich sterylnych krokach i stosowanie komory bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym jest niezbędne do utrzymania żywotności komórek. Procedurę zademonstruje Izabela Aparecida de Souza. Studentka studiów magisterskich z naszego laboratorium.Aby rozpocząć procedurę na prawidłowo poddanym eutanazji ośmiotygodniowym samcu myszy typu dzikiego C57BL/6, należy namoczyć mysz w 70% roztworze etanolu. Za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj jednocentymetrowe nacięcie wzdłuż brzucha i usuń skórę, aż mięśnie tylnych nóg zostaną całkowicie odsłonięte. Następnie ostrożnie usuń tylne nogi na wysokości biodra, nie łamiąc kości udowe

isolation-and-culture-of-bone-marrow-derived-macrophages-from-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Makrofagi odgrywają centralną rolę w homeostazie i patologii wielu tkanek. Przedstawiony tutaj protokół opisuje metody usuwania makrofagów in vivo, otrzymywania spolaryzowanych makrofagów z aspiratów szpiku kostnego oraz adoptywnego transferu makrofagów do myszy. Techniki te pozwalają na określenie roli, jaką spolaryzowane makrofagi odgrywają w zdrowiu i chorobie.

Wyczerpanie i rekonstytucja makrofagów u myszy

W tym filmie pokazujemy izolację i hodowlę komórek zrębu szpiku kostnego z długich kości myszy. Izolowane przylegające BMSC mogą być wykorzystane do dalszej analizy.

Izolacja i hodowla komórek zrębu szpiku kostnego z kości piszczelowej myszy

W tym filmie pokazujemy aktywację makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w odpowiedzi na bakteryjny lipopolisacharyd i dożylną immunoglobulinę.

Aktywacja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy w odpowiedzi na przeciwciała

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Makrofagi od dawna są uznawane za kluczowy składnik wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Niedawna eksplozja wiedzy dotyczącej ewolucyjnych, genetycznych i biochemicznych aspektów interakcji między makrofagami a mikroorganizmami ponownie zwróciła uwagę naukowców na makrofagi. W artykule opisano metodę różnicowania makrofagów od szpiku kostnego myszy.

Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Ten protokół został opracowany do hodowli tetrahydrobiopteryny (BH4) i indukowanej syntazy tlenku azotu (iNOS) z niedoborem pierwotnych mysich makrofagów do badania biologii NO-redoks. Badania koncentrują się na zmniejszeniu potencjalnego zanieczyszczenia BH4 i innych artefaktów znalezionych w tradycyjnych metodach izolacji i hodowli, które mogą zakłócić wyniki eksperymentów i interpretację wyników.

Izolacja i hodowla in vitro makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego do badania biologii NO-redoks

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Ten protokół opisuje nieenzymatyczną i prostą metodę izolowania 7-9-dniowych komórek szpiku kostnego myszy noworodków i generowania zróżnicowanych makrofagów przy użyciu supernatantu komórek L929 jako źródła czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (M-CSF). Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego poddano dalszej analizie pod kątem antygenów powierzchniowych F4/80, CD206, CD11b i kompetencji funkcjonalnych.

Izolacja szpiku kostnego noworodków myszy i przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Poznaj metodę izolacji i hodowli makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Protokół zapewnia wysokie wydajności komórek nieaktywowanych, kluczowych dla badań w immunologii i biologii komórki.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Przeglądaj więcej filmów