Name: Linia do charakteryzowania strukturalnych wad serca u płodu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj zaawansowane metody diagnostyczne wad serca u płodów myszy przy użyciu echokardiografii, nekropsji i mikroskopii konfokalnej. Techniki te umożliwiają szczegółową analizę anatomiczną i rekonstrukcję 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Użycie myszy do tych badań jest konieczne, ponieważ myszy mają czterokomorowe serca, które mogą naśladować ludzkie choroby wieńcowe. Myszom zapewniono opiekę weterynaryjną i umieszczono w akredytowanym przez instytucję Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)-akredytowanym ośrodku opieki nad zwierzętami. Przestrzegano ścisłych protokołów, aby zminimalizować dyskomfort, stres, ból i obrażenia myszy. Myszy zostały poddane eutanazji przy użyciu gazu CO2, który jest dopuszczalny dla małych gryzoni zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych dotyczącymi eutanazji. Badania na myszach w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone przy użyciu zatwierdzonego protokołu IACUC na Uniwersytecie w Pittsburghu.
1. Echokardiogram płodu
UWAGA: Echokardiogram jest potężnym narzędziem do identyfikacji wad rozwojowych układu krążenia i wad pozasercowych u myszy. Ze względu na mały rozmiar zarodków myszy (około 1-2 mm w połowie ciąży, 3,5 mm po urodzeniu) wymagany jest sprzęt echokardiograficzny ultrawysokiej częstotliwości z biomikroskopią ultradźwiękową (UBM). UBM dostarcza różne sondy o wysokiej częstotliwości (30-50 MHz) z małym okienkiem obrazowania (15 mm x 14 mm), które zapewnia rozdzielczość (30 μm osiowe x 68 μm boczne) do wizualizacji jednego płodu myszy na raz. Przetwornik o częstotliwości 40 MHz zapewnia obrazy o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji fenotypów sercowo-naczyniowych7.
<ol>
	<li>Włączyć echokardiogram i wybrać program Cardiology. 
	UWAGA: Poniższy protokół może być stosowany dla dowolnego tła myszy od dnia embrionalnego (E) 14.5 do 19.5.</li>
	<li>Znieczulij żądaną mysz w anestezjologicznej komorze indukcyjnej. Wywołaj znieczulenie za pomocą stężenia 4% izofluranu i tlenu medycznego o natężeniu przepływu 1 l/min i zmniejsz je do 2%-3% w celu konserwacji.</li>
	<li>Szybko umieść mysz na platformie obrazowania. Platforma obrazowania ma podgrzewaną stal, która utrzymuje mysz w cieple podczas zabiegu. Włóż usta i nos myszy do znieczulającego stożka nosowego. Zabezpiecz kończyny taśmą, aby uniknąć ruchu. Monitoruj tętno, aby upewnić się, że utrzymuje się w przedziale 400-450 uderzeń na minutę.</li>
	<li>Monitoruj temperaturę za pomocą sondy termometru doodbytniczego i upewnij się, że spoczywa na 37 °C ± 0,5 °C. Monitoruj oddech, aby uniknąć niedotlenienia. Utrzymuj delikatną siłę na sondzie, aby zapobiec uszkodzeniom. 
	UWAGA: Nad myszą można ustawić lampę grzewczą, aby zapobiec hipotermii podczas znieczulenia i odzyskać siły po znieczuleniu. Maść okulistyczna Petrolatum może być stosowana jako lubrykant, aby uniknąć suchości oczu.</li>
	<li>Usuń sierść z klatki piersiowej i brzucha za pomocą kremu do depilacji. Nałóż krem i odczekaj 3 minuty przed usunięciem. Oczyść obszar 70% etanolem. Etanol działa lepiej niż woda jako smar do golenia.</li>
	<li>Rozgrzej żel do ultradźwięków do normalnej temperatury ciała. Nałóż obficie żel ultradźwiękowy i umieść głowicę na brzuchu, aby ustawić ją w płaszczyźnie poziomej i zidentyfikować pęcherz na ekranie. Po zidentyfikowaniu pęcherza przeskanuj czaszkę z pęcherza i poszukaj płodu. Zmierz długość od korony do zadu, aby określić wiek ciążowy10 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 i Tabela 1). 
	UWAGA: Zmień pozycje przetwornika, aby uwidocznić różne płaszczyzny, w tym poprzeczne czterokomorowe, strzałkowe i frontalne/koronalne płaszczyzny obrazowania7 (Rysunek 1).</li>
	<li>Użyj kolorowego Dopplera, aby przeanalizować przepływ krwi z serca.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce, jeśli zarodki nie osiągnęły zamierzonego etapu. W przeciwnym razie przygotuj mysz do zbioru. 
	UWAGA: Upewnij się, że mysz jest już przytomna i dobrze dochodzi do siebie po znieczuleniu przed włożeniem jej z powrotem do klatki.</li>
	<li>Wyłącz izofluran i tlen, oczyść obszar roboczy i wyłącz maszynę. 
	UWAGA: Ważne jest, aby usunąć żel z przetwornika.</li>
</ol>
2. Sekcja zwłok
UWAGA: Gdy podejrzewa się nieprawidłowe fenotypy serca za pomocą echokardiografii płodu, płody są zbierane i utrwalane poprzez zanurzenie całego ciała w roztworze utrwalającym: albo 10% buforowanego fosforanu formaliny, albo 4% paraformaldehydu (PFA). Sprawdź zewnętrzną i wewnętrzną morfologię próbki, szukając makroskopowych nieprawidłowości anatomicznych lub wad rozwojowych.
<ol>
	<li>Przygotuj mysz.
	<ol>
		<li>Jeśli mysz jest dorosła, poddaj ją eutanazji przy użyciu standardowego protokołu CO2 . Za pomocą kleszczy lub nożyczek preparacyjnych należy wykonać nacięcia (około 3 cm) w bocznej części klatki piersiowej i brzucha, aby umożliwić penetrację utrwalacza do narządów wewnętrznych. 
		UWAGA: Próbka powinna być utrwalona przez co najmniej 24 godziny przed sekcją zwłok, jeśli zarodek jest starszy niż E14.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj zewnętrzną część ciała.
	<ol>
		<li>Skonfiguruj oprogramowanie, aby zapisywać zdjęcia z nazwą, w tym identyfikacją próbki, powiększeniem mikroskopu i zawartością obrazu. 
		UWAGA: Powiększenie od 1,0x do 3,2x powinno być wystarczające do obrazowania większości struktur u myszy E14,5 lub starszych.</li>
		<li>Umieść mysz na płytce pod soczewką mikroskopu stereoskopowego. Napełnij płytkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby całkowicie pokryć próbkę, aby zapobiec odwodnieniu i odbiciom na zdjęciach. Dostosuj powiększenie tak, aby ekran obejmował cały zarodek, a następnie zrób zdjęcie zarówno lewej, jak i prawej strony zarodka. 
		UWAGA: Spód płytki powinien być pokryty parafiną, silikonem lub innym tego typu podłożem, aby ułatwić przypinanie.</li>
		<li>Przypnij próbkę przez gardło, skierowaną do góry, i zrób kolejne zdjęcie. 
		UWAGA: Ustaw szpilkę lekko do góry, aby upewnić się, że żadne ważne struktury jamy klatki piersiowej nie zostały przebite.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj klatkę piersiową.
	<ol>
		<li>Unosząc skórę na środku szyi za pomocą kleszczy, przetnij skórę w kierunku obu pach nożyczkami, a następnie przetnij skórę wzdłuż osi środkowej w kierunku ogona. Następnie odetnij skórę od pępka do nóg. Przypnij próbkę przez nadgarstki i kostki. 
		UWAGA: Uważaj, aby przeciąć tylko skórę. Zaleca się trzymanie ostrzy nożyczek poziomo lub pod kątem do góry.</li>
		<li>Aby oderwać tkankę łączną, podnieś skórę jedną parą kleszczy, jednocześnie przytrzymując leżącą poniżej tkankę na miejscu drugą parą. Przypnij próbkę przez skórę, aby odsłonić klatkę piersiową i brzuch (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
		UWAGA: Zbyt duże rozciąganie podczas przypinania, cięcia lub skrobania może spowodować uszkodzenie tkanki.</li>
		<li>Zrób zdjęcie odsłoniętych mięśni, a następnie delikatnie zeskrob mięśnie, aby odsłonić żebra.</li>
		<li>Zrób zdjęcie odsłoniętych żeber. Oddziel żebra od membrany i odetnij żebra po obu stronach tak daleko, jak to możliwe, na osi bocznej w kierunku szyi.</li>
		<li>Odsłoń serce, usuwając przecięte żebra. Zrób zdjęcie serca.</li>
		<li>Usuń grasicę, obierając ją jedną parą kleszczy. Użyj drugiej pary kleszczy, aby ustabilizować podstawę grasicy, aby uniknąć rozerwania naczyń znajdujących się pod spodem. Zrób zdjęcia serca i wielkich naczyń. 
		UWAGA: Użycie kołków do rozciągnięcia niektórych sąsiednich struktur może pomóc w uzyskaniu lepszych widoków obrazowania. Dodatkowo zrób osobne zdjęcia skupiające się na wielkich tętnicach, sercu i innych interesujących strukturach, ponieważ mogą one nie być razem ostre.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj brzuch.
	<ol>
		<li>Pociągnij membranę, aby ją wyjąć i odsłonić wątrobę. Zrób zdjęcie.</li>
		<li>Przypnij wątrobę, aby odsłonić żołądek i trzustkę. Zrób zdjęcie.</li>
		<li>Przetnij przełyk. Usuń okrężnicę i jelita, wyciągając je kleszczami. Przeciąć tuż nad wątrobą i usunąć ją, aby odsłonić nerki i nadnercza. Zrób zdjęcie. 
		UWAGA: Usunięte narządy należy przechowywać w roztworze utrwalającym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odizolować klatkę piersiową do analizy ECM.
	<ol>
		<li>Przetnij dolną część klatki piersiowej wzdłuż linii prostej między wątrobą a płucami. Odetnij głowę na tyle wysoko, aby nie przecinać rozgałęzień tętnic szyjnych.</li>
		<li>Delikatnie usuń boczne żebra, zachowując żebra grzbietowe i kręgosłup. Obierz i zeskrob tłuszcz grzbietowy.</li>
		<li>Odłącz klatkę piersiową od reszty ciała i umieść ją w 10% buforowanym roztworze fosforanu formaliny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Osadzanie
<ol>
	<li>Przelać utrwalacz do odpowiedniej butelki na odpady niebezpieczne. Przemyć próbki trzykrotnie 1x PBS przez 15 minut.</li>
	<li>Do odwodnienia próbek należy stosować zwiększające się stężenia etanolu i ksylenu. Czas trwania wszystkich kolejnych etapów zależy od stadium zarodków. Szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli 2. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas wymiany roztworów, aby uniknąć uszkodzenia próbek. Optymalne parametry przetwarzania próbki można dostosować empirycznie. Ksylen rozpuści niektóre tworzywa sztuczne; Należy używać szklanych narzędzi i pojemników.</li>
	<li>Zastąp ksylen parafiną na żądany czas. Pozostawić butelki w inkubatorze w temperaturze 65 °C na odpowiedni czas (tabela 2).</li>
	<li>Użyj świeżej parafiny, aby osadzić próbki w żądanej pozycji. 
	UWAGA: Zaleca się zorientowanie próbki w środku bloku parafinowego, tak aby jej grzbietowa strona była skierowana do góry, a tylna strona skierowana do przodu bloku. Podczas orientowania próbki należy pamiętać, że próbka jest osadzona z blokiem skierowanym do góry nogami.</li>
</ol>
4. Episkopowa mikroskopia konfokalna (ECM)
UWAGA: Po odpowiednim osadzeniu, zarodki są poddawane seryjnemu zbieraniu obrazów za pomocą ECM do analizy histopatologicznej. Poszczególne preparaty można pobrać z mikrotomu w celu przeprowadzenia dalszych badań.
<ol>
	<li>Wyjmij blok parafiny z zamrażarki -20 °C i wyjmij metalowe formy.</li>
	<li>Użyj żyletki, aby przyciąć wosk na krawędziach i z tyłu kasety. Przetnij wosk otaczający próbkę, aż zostanie zamknięty w małym kwadracie wosku przymocowanym do kasety. 
	UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z ostrzami.</li>
	<li>Użyj metalowej dźwigni, aby zacisnąć blok parafiny na etapie krojenia mikrotomu. Wybierz funkcję MAN (ręczną) w trybie pracy, podnieś powierzchnię parafiny blisko ostrza i uruchom kilka suwaków, aby upewnić się, że ostrze styka się z blokiem parafiny.</li>
	<li>Otwórz aplikację LAS AF i wybierz opcję MatrixScreener. Wybierz opcję Pojedyncza regularna macierz i załaduj odpowiedni, wcześniej zapisany szablon. Kliknij przycisk Szybki LUT, aby przełączyć się na białe i pomarańczowe ombre.</li>
	<li>Wybierz opcję Set Up Jobs (Konfiguruj zadania) i przeciągnij widoczny laser o długości fali 405 nm do maksimum. Dopasuj lewą krawędź bloku widma do linii 405 nm i przeciągnij prawą krawędź do linii 800 nm. Zaznacz opcję Otworek i uruchom podgląd na żywo.</li>
	<li>Dostosuj położenie projekcji laserowej, aby wyśrodkować próbkę na ekranie i ustaw pokrętło Zoom na ~20x. Aby zoptymalizować rozdzielczość, ustaw wzmocnienie na 1,250 V i zmaksymalizuj niebieski obszar za pomocą pokrętła ostrości; następnie zresetuj wzmocnienie do około 750 V dla obrazowania. 
	UWAGA: Konkretne wartości mogą się różnić w zależności od stanu zarodka.</li>
	<li>Przełącz metodę cięcia na Auto, ustaw grubość na około 50 μm i uruchom suwaki. Przerwij cięcie, gdy płuca i drogi oddechowe są w zasięgu wzroku.</li>
	<li>Wybierz grubość cięcia w zakresie 8-10 μm i zatrzymaj podgląd na żywo. Otwórz program Microtome Communicator, aby rozpocząć obrazowanie. Upewnij się, że folder pamięci tymczasowej jest pusty przed pobraniem obrazów.</li>
	<li>Przerwij cięcie, gdy nie zostanie uwidoczniona żadna dodatkowa struktura serca. Zamknij aplikację Microtome Communicator i wyeksportuj plik tymczasowy do jednej serii obrazów .tiff za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu w celu późniejszej rekonstrukcji 3D.</li>
</ol>
5. Rekonstrukcja trójwymiarowa (3D)
UWAGA: Celem rekonstrukcji 3D jest przetworzenie stosu obrazów 2D z obrazowania ECM na filmy 3D w orientacji czołowej, strzałkowej i poprzecznej oraz wykorzystanie filmów 3D do diagnozy nieprawidłowości strukturalnych i anatomicznych w próbkach.
<ol>
	<li>Otwórz stos obrazów ECM w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
	<ol>
		<li>Przeciągnij i upuść obraz files do oprogramowania do przetwarzania obrazu. Odwróć obrazy ECM w poziomie, wybierając opcje Image > Transform > Flip Horizontal (Odwróć w poziomie) na pasku menu.</li>
		<li>Zapisz odwrócony obraz i zamknij oprogramowanie do przetwarzania obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaimportuj stos obrazów ECM w oprogramowaniu do przeglądania DICOM.
	<ol>
		<li>Przeciągnij i upuść odwrócone w poziomie obrazy ECM do oprogramowania do przeglądania DICOM. Upewnij się, że wokół listy próbek znajduje się jasnoniebieska ramka lub obrazy mogą zostać dodane do istniejącego folderu przykładów.</li>
		<li>Wybierz łącza lub pliki, które chcesz skopiować do bazy danych, gdy pojawi się wyskakujące okienko. Na liście próbek pojawi się nowy przykład o tej samej nazwie, co plik skopiowany do oprogramowania do przeglądania DICOM.</li>
		<li>Kliknij nowo dodany plik, aby go otworzyć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj rekonstrukcję 3D.
	<ol>
		<li>Po otwarciu pliku kliknij menu Narzędzia do rekonstrukcji 2D/3D na pasku narzędzi i wybierz 3D MPR.</li>
		<li>W przypadku rozdzielczości Pixel X i Pixel Y Resolution (Rozdzielczość piksela X) wprowadź rozdzielczość obrazu, podając powiększenie używane podczas obrazowania ECM. W polu Interwał przekroju wprowadź grubość przekroju używaną do cięcia podczas obrazowania ECM. 
		UWAGA: Rozdzielczość aparatu zmienia się w zależności od zoomu aparatu i może się różnić w zależności od aparatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj różnych narzędzi z karty Narzędzia po lewej stronie, aby dostosować stosy obrazów zgodnie z potrzebami.
	<ol>
		<li>Użyj narzędzia WW/WL, aby dostosować szerokość okna i poziom okna. Kliknij i przeciągnij narzędzie na obrazie w górę, aby zmniejszyć jasność obrazu, lub w dół, aby ją zwiększyć. Kliknij i przeciągnij narzędzie na obrazie w prawo, aby zmniejszyć kontrast obrazu, lub w lewo, aby go zwiększyć. 
		UWAGA: Optymalne ustawienia WW/WL dla jednej konstrukcji mogą być nieoptymalne dla innej. Z tego powodu zaleca się tworzenie oddzielnych filmów w celu oglądania różnych struktur.</li>
		<li>Użyj narzędzia Przesuń, aby przeciągnąć obrazy w żądane pozycje. Użyj narzędzia Lupka, aby powiększyć lub pomniejszyć obraz zgodnie z potrzebami, a narzędzia Obróć, aby obrócić obraz zgodnie z potrzebami. 
		UWAGA: Powiększanie obrazów może spowodować obniżenie jakości obrazu. Zachowaj ostrożność podczas obracania obrazów, ponieważ może to spowodować odwrócenie osi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij i przeciągnij kolorową oś pierwszego panelu. Zwróć uwagę, jak obracanie tej osi zmienia orientację pozostałych dwóch paneli. Obracaj osie trzech paneli, aż trzy panele będą reprezentować widoki koronalne, strzałkowe i poprzeczne próbki. 
	UWAGA: Podczas zmiany orientacji próbek należy zachować prawidłową orientację przednią/tylną.</li>
	<li>Generuj filmy.
	<ol>
		<li>Gdy wszystkie trzy panele zostaną prawidłowo ustawione, zorientowane i rozjaśnione, kliknij panel reprezentujący widok koronalny.</li>
		<li>Kliknij Eksport filmu po prawej stronie paska menu. Kliknij opcję Partia i przeciągnij suwaki Od i Do, aby objąć cały obszar zainteresowania. W polu Interwał wybierz opcję Taka sama jak grubość. Zapisz wideo wskazujące orientację widoku.</li>
		<li>Obejrzyj film, aby sprawdzić, czy można odpowiednio zidentyfikować interesujące Cię struktury. Jeśli nie, użyj narzędzi (krok 5.4), aby ponownie dostosować filmy zgodnie z potrzebami i ponownie zapisać wideo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz krok 5.6 dla widoków poprzecznych i strzałkowych. Zdiagnozuj próbki za pomocą zrekonstruowanych filmów. 
	UWAGA: Uważnie obejrzyj filmy w każdej orientacji, aby dokonać pełnej oceny, czy próbka wykazuje jakiekolwiek nieprawidłowości anatomiczne lub fenotypy choroby (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>

<ol><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global%2C+regional%2C+and+national+level%2C+1990-2017%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine%22%5BJournal%5D)">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).</li>
<li>vander Linde, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+prevalence+of+congenital+heart+disease+worldwide%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis).</a> Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial+differences+in+infant+mortality+attributable+to+birth+defects+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research.+Part+A%2C+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States.</a> Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).</li>
<li>Patel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+noncardiac+and+genetic+abnormalities+in+neonates+undergoing+cardiac+operations%3A+Analysis+of+the+society+of+thoracic+surgeons+congenital+heart+surgery+database%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).</li>
<li>Pierpont, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+congenital+heart+disease%3A+Revisited%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).</li>
<li>Krishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+comparison+of+mouse+and+human+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">A detailed comparison of mouse and human cardiac development.</a> Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+congenital+heart+defects+with+noninvasive+fetal+echocardiography+in+a+mouse+forward+genetic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen.</a> Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).</li>
<li>Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+visualizing+and+phenotyping+congenital+heart+defects+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research.+Part+C%2C+Embryo+Today%3A+Review%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).</li>
<li>Tsuchiya, M., Yamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+histological+3D-imaging%3A+episcopic+fluorescence+image+capture+is+widely+applied+for+experimental+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies+%28Kyoto%22%5BJournal%5D)">High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals.</a> Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).</li>
<li>Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+assessment+of+fetal+mice+by+in+utero+echocardiography%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography).</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).</li>
<li>Rosenthal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+high+resolution+three-dimensional+reconstruction+of+embryos+with+episcopic+fluorescence+image+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research.+Part+C%2C+Embryo+Today%3A+Review%22%5BJournal%5D)">Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).</li>
<li>Weninger, W. J., Mohun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+transgenic+embryos%3A+a+rapid+3-D+screening+method+based+on+episcopic+fluorescence+image+capturing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing.</a> Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z niniejszym manuskryptem.

Genetycznie zmodyfikowane myszy zostały wykorzystane do zrozumienia patomechanizmów wrodzonych wad serca. Protokoły, które przedstawiamy w tym badaniu, mają na celu usprawnienie i standaryzację procesu oceny wad serca u myszy płodu. Istnieją jednak krytyczne kroki, na które należy zwrócić uwagę podczas protokołu. Zarodki myszy rosną znacznie w każdym dniu ciąży, a właściwy czas na pobranie myszy można określić, wykonując dokładnie echokardiogram płodu. Echokardiogram płodu może być wykorzystany do badań przesiewowych pat...

Wrodzone choroby serca (CHD) są najczęstszą wadą wrodzoną noworodków1,2, dotykające około 0,8%-1,7% noworodków i powodujące znaczną śmiertelność i zachorowalność noworodków3. Etiologia genetyczna jest silnie wskazywana w przypadku CHDs4,5. Genetycznie zmodyfikowane modele myszy były szeroko stosowane w celu zrozumienia złożoności choroby wieńcowej i mechanizmów, które je powodują, ponieważ myszy mają czterokomorowe serca i porównywalne sekwencje DNA rozwoju serca u płodów myszy i ludzi6. Identyfikacja fenotypu mutantów myszy jest podstawowym pierwszym krokiem w scharakteryzowaniu funkcji docelowego genu. Mysie modele wyrażające efekty dawkowania genów, w których pojedyncza mutacja genetyczna może powodować spektrum wad serca, które naśladują ludzkie choroby niedokrwienne serca, są ważne dla zrozumienia złożoności choroby wieńcowej i mechanizmów, które je powodują.
Ten artykuł przedstawia proces charakteryzowania fenotypów serca w modelach mysich. Zastosowane metody wykorzystują echokardiogram płodu7, a następnie sekcję zwłok i histopatologię ECM7,8, które mogą wyświetlać szczegółową anatomię rozwijających się fenotypów serca myszy. Echokardiogram płodu jest nieinwazyjną metodą, która umożliwia bezpośrednią wizualizację wielu zarodków z rozsądną rozdzielczością obrazowania. Ponadto echokardiogram płodu umożliwia szybkie określenie całkowitej liczby zarodków w miocie, ich etapów rozwoju oraz względnej orientacji i lokalizacji w rogu macicy. Za pomocą spektralnego przepływu Dopplera/koloru można zidentyfikować nieprawidłowe zarodki na podstawie struktury, zaburzenia hemodynamicznego, ograniczenia wzrostu lub rozwoju wodniaka. Ponieważ badanie echokardiogramu płodu jest techniką nieinwazyjną, może być używane do skanowania przez wiele dni i obserwowania zmian w hemodynamice lub morfologii serca. Uzyskanie wysokiej jakości obrazowania echokardiogramu płodu wymaga praktyki i umiejętności, ponieważ określone wady serca mogą zostać pominięte z powodu braku doświadczenia i wiedzy. Z tego powodu bardziej szczegółową analizę morfologii serca można uzyskać poprzez połączenie sekcji zwłok i histopatologii ECM. Sekcja zwłok zapewnia bezpośrednią wizualizację struktury łuku, względnych relacji aorty i tętnicy płucnej, wielkości komór i przedsionków, położenia serca względem klatki piersiowej oraz struktur oskrzelowo-płucnych. Jednak cechy wewnętrzne, takie jak zastawki serca i grubość ścianki, mogą być trudne do oceny za pomocą samej sekcji zwłok. W związku z tym histopatologia ECM jest zalecana w celu uzyskania jednoznacznej diagnozy. Histopatologia ECM to technika wizualizacji o wysokiej rozdzielczości, która pozwala na rekonstrukcję obrazu zarówno 2D, jak i 3D stosu9. Obrazy te uzyskuje się poprzez seryjne episkopowe obrazowanie fluorescencyjne próbki zanurzonej w parafinie, która jest cienko cięta w stałych odstępach czasu przez automatyczny mikrotom. W przeciwieństwie do klasycznej histologii, obrazy są rejestrowane jako przekrój przed wycięciem z bloku, tak aby wszystkie obrazy były rejestrowane w tym samym układzie odniesienia. Z tego powodu stos obrazów 2D wytworzony za pomocą histopatologii ECM może być łatwo i niezawodnie zrekonstruowany w trzech wymiarach. Odbywa się to za pomocą przeglądarki DICOM, która umożliwia wizualizację 3D obrazów w trzech płaszczyznach anatomicznych: czołowej, strzałkowej i poprzecznej. Na podstawie tych rekonstrukcji 3D w wysokiej rozdzielczości można postawić ostateczną diagnozę kardiologiczną. Zastosowanie tych trzech różnych modalności wizualizacji, zarówno indywidualnie, jak i w połączeniu, może zapewnić dokładną charakterystykę strukturalnych wad serca w zarodkach myszy.

<table><tbody><tr><td>1x buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS), PH7.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki Eppendorfa (lub preferowana fiolka do przechowywania tkanek)</td><td>SealRite</td><td>1615-5599</td><td></td></tr><tr><td>10% buforowany roztwór fosforanu formaliny</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd (PFA) utrwalacz&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>28908</td><td>4% stężenie robocze świeżo przygotowane w 1x PBS w 4 & stopniach; C</td></tr><tr><td>50 ml probówki</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6&ndash; Płytka 12-dołkowa lub fiolka 20 ml&nbsp; do przechowywania zarodków</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny&nbsp;</td>Szpilki preparacyjne <td>Leica</td><td>MDG36</td><td></td></tr><tr><td>(klasa A1 lub A2)</td><td>FST</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Płytka preparacyjna&nbsp;</td><td>FST</td><td>FB0875713</td><td>szalka Petriego z bazą parafinową</td></tr><tr><td>Formy do zatapiania</td><td>Sakura</td><td>4133</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo wąskie nożyczki (10,5 cm)</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td>1&ndash; 2 pary&nbsp;</td></tr><tr><td>Aplikacja Fidżi/Zdjęcie J</td><td>NIH</td><td></td><td>Fiji.sc</td></tr><tr><td>Drobna końcówka (0,05 mm x 0,01 mm) Kleszcze preparacyjne (11 cm)</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>2 pary</td></tr><tr><td>gorących kleszczy&nbsp;</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Do orientacji zarodków</td></tr><tr><td>Przemysłowy marker do bloków woskowych&nbsp;</td><td>Sharpie</td><td>2003898</td><td>Sformatowany do użytku laboratoryjnego</td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa Jenoptik ProgRes C14plus&nbsp;</td><td>Jenoptik</td><td>017953-650-26</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie akwizycyjne Jenoptik ProgRess CapturePro</td><td>Jenoptik</td><td></td><td>jenoptik.com</td></tr><tr><td>Duża szklana zlewka&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S111053</td><td>Do topienia parafiny</td></tr><tr><td>Mikroskop lornetkowy Leica M165 FC (optyka 16.5:1)</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>OsiriX MD wersja 12.0</td><td>OsiriX</td><td></td><td>osirix-viewer.com&nbsp;</td></tr><tr><td>Wosk parafinowy do zatapiania Paraplast</td><td>Millipore Sigma</td><td>1003230215</td><td></td></tr><tr><td>Mała szklana zlewka</td><td>Fisher Scientific</td><td>S111045</td><td></td></tr><tr><td>Mała, perforowana łyżka (14,5 cm)</td><td>FST</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki proste Vannas (4&ndash; 8 mm)</td><td>FST</td><td>15018-10</td><td>Para</td></tr><tr><td>biomikroskopów ultradźwiękowych Vevo2100 o ultrawysokiej częstotliwości</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc.</td><td>Vevo2100</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher Chemiczny</td><td>UN1307</td><td></td></tr></tbody></table>

linia do charakteryzowania strukturalnych wad serca u płodu myszy

A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse

Wrodzone choroby serca (CHD) są głównymi przyczynami zgonów niemowląt w Stanach Zjednoczonych. W latach osiemdziesiątych XX wieku i wcześniej większość pacjentów z umiarkowaną lub ciężką chorobą niedokrwienną serca umierała przed osiągnięciem dorosłości, przy maksymalnej śmiertelności w pierwszym tygodniu życia. Niezwykły postęp w technikach chirurgicznych, podejściach diagnostycznych i postępowaniu medycznym doprowadził do znacznej poprawy wyników. Aby sprostać krytycznym potrzebom badawczym w zakresie zrozumienia wrodzonych wad serca, modele mysie stanowią idealną platformę badawczą, ponieważ mają bardzo podobną anatomię serca do ludzi i krótki wskaźnik ciąży. Połączenie inżynierii genetycznej z wysokowydajnymi narzędziami do fenotypowania pozwoliło na replikację i diagnostykę strukturalnych wad serca w celu dalszego wyjaśnienia szlaków molekularnych stojących za chorobą wieńcową. Zastosowanie nieinwazyjnej echokardiografii płodu do badań przesiewowych fenotypów serca w modelach mysich w połączeniu z wysoką wiernością episkopowego przechwytywania obrazu fluorescencyjnego (EFIC) przy użyciu histopatologii episkopowej mikroskopii konfokalnej (ECM) z trójwymiarowymi rekonstrukcjami (3D) umożliwia szczegółowy wgląd w anatomię różnych wrodzonych wad serca. Protokół ten przedstawia kompletny przebieg pracy tych metod w celu uzyskania dokładnej diagnozy mysich wrodzonych wad serca. Zastosowanie tego protokołu fenotypowania do organizmów modelowych pozwoli na dokładną diagnozę choroby niedokrwiennej serca, dostarczając informacji na temat mechanizmów choroby wieńcowej. Identyfikacja mechanizmów leżących u podstaw choroby niedokrwiennej serca stwarza możliwości potencjalnych terapii i interwencji.

Zauważono, że zarodki myszy z istotnymi wadami hemodynamicznymi wykazują letalność embrionalną. Szeroką gamę wad wrodzonych serca (CHD) można zidentyfikować za pomocą wysokowydajnego, nieinwazyjnego echokardiograficznego badania płodów, wykorzystując różne projekcje (Rysunek 1).
Wady przegrody: Najczęstszymi wrodzonymi wadami serca (CHD) są wady przegrody, takie jak ubytek w przegrodzie międzykomorowej (VSD), ubytek w przegrodzie przedsionkowo-kom...

Ten artykuł szczegółowo opisuje metody diagnostyki mysiej wrodzonej wady serca (CHD) za pomocą echokardiografii płodu, sekcji zwłok i episkopowego przechwytywania obrazu fluorescencyjnego (EFIC) za pomocą episkopowej mikroskopii konfokalnej (ECM), a następnie trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji.

Linia do charakteryzowania strukturalnych wad serca u płodu myszy

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe ...

Protokół ten przedstawia najnowocześniejsze metody generowania danych obrazowych o wysokiej rozdzielczości w celu diagnozowania wrodzonych wad serca. Przeprowadzamy oceny funkcjonalne za pomocą nieinwazyjnej echokardiografii płodu połączonej z sekcją zwłok, a następnie histopatologią w mikroskopii konfokalnej w celu wygenerowania seryjnych stosów obrazów 2D i rekonstrukcji 3D w celu kompleksowej diagnostyki choroby niedokrwiennej serca. Metoda ta może wyjaśnić szczegółowe zmiany anatomiczne nie tylko w wrodzonych wadach serca, ale może być również wykorzystana do badania strukturalnych wad wrodzonych w innych narządach, w tym wad czaszki twarzy, anomalii kończyn i szkieletu, a także wad mózgu i innych narządów trzewnych.Procedury te zademonstrują Meghan Holbrook, Carla Guzman, Peizhao Zhang i Benjamin Glennon, wszyscy badacze z naszego laboratorium. Po przygotowaniu myszki do zabiegu należy rozgrzać żel ultradźwiękowy do temperatury ciała i obficie nałożyć go na obszar obrazowania. Następnie umieść przetwornik na brzuchu zorientowanym w płaszczyźnie poziomej i zidentyfikuj pęcherz na ekranie.Po zidentyfikowaniu pęcherza moczowego przeskanuj czaszkę z pęcherza, poszukaj płodu i określ wiek ciążowy, mierząc długość korony do zadu. Następnie użyj kolorowego dopplera, aby przeanalizować przepływ krwi z serca. Aby umożliwić utrwalającą penetrację do narządów wewnętrznych, wykonaj nacięcia w bocznej części klatki piersiowej i brzuchu za pomocą kleszczy lub nożyczek preparacyjnych i pozwól próbce utrwalić się przez co najmniej 24 godziny w chłodnym pomieszczeniu.Następnie skonfiguruj oprogramowanie, aby zapisywać obrazy z nazwą, w tym identyfikacją próbki, powiększeniem mikroskopu i zawartością obrazu. Przypnij próbkę przez nadgarstki i kostki. Przed przecięciem skóry wzdłuż osi środkowej w kierunku ogona podnieś skórę na środku szyi za pomocą kleszczy i przetnij skórę nożyczkami w kierunku obu pach.Następnie przetnij skórę od pępka do nóg. Po osadzeniu próbek dostosuj pozycję projekcji laserowej do środka próbki na ekranie i ustaw pokrętło zoomu na 20x. Aby zoptymalizować rozdzielczość, ustaw wzmocnienie na 1,250V.Zmaksymalizuj niebieski obszar za pomocą pokrętła ostrości, a następnie zresetuj wzmocnienie do około 750 V w celu obrazowania. Następnie zmień metodę cięcia na automatyczną. Ustaw grubość na około 50 mikrometrów i uruchom szkiełka.Przerwij cięcie, gdy płuca i drogi oddechowe są w zasięgu wzroku. Wybierz grubość cięcia od ośmiu do 10 mikrometrów i zatrzymaj otwarty podgląd na żywo. Otwórz program Microtome Communicator, aby rozpocząć obrazowanie.Upewnij się, że folder pamięci tymczasowej jest pusty przed pobraniem obrazów. Zatrzymaj zbieranie obrazów, gdy nie jest widoczna żadna sztywna struktura. Wyślij pliki przechowywane tymczasowo do jednej serii obrazów TIFF.Aby zrekonstruować obraz 3D, przeciągnij i upuść pliki obrazów do oprogramowania do przetwarzania obrazu. Gdy pojawi się wyskakujące okienko, wybierz linki lub pliki, które chcesz skopiować do bazy danych. Po otwarciu pliku kliknij menu Narzędzia do rekonstrukcji 2D 3D na pasku narzędzi i wybierz 3D MPR.W przypadku rozdzielczości piksela X i rozdzielczości piksela Y wprowadź rozdzielczość obrazu, podając powiększenie używane podczas obrazowania ECM. Jako interwał przekroju wprowadź grubość warstwy używaną do cięcia podczas obrazowania ECM. Następnie użyj narzędzia WWWL, aby dostosować szerokość okna i poziom okna.Kliknij i przeciągnij narzędzie na obrazie w górę, aby zmniejszyć jasność obrazu, lub w dół, aby ją zwiększyć. Kliknij i przeciągnij narzędzie na obrazie w prawo, aby zmniejszyć kontrast obrazu i w lewo, aby go zwiększyć. Przeciągnij obrazy w żądane pozycje za pomocą narzędzia do przesuwania.Użyj narzędzia do powiększania, aby powiększyć lub pomniejszyć obraz, a narzędzia do obracania, aby obrócić obraz zgodnie z potrzebami. Teraz kliknij i przeciągnij kolorową oś pierwszego panelu. Zwróć uwagę, jak obracanie tej osi zmienia orientację pozostałych dwóch paneli.Obróć osie trzech paneli, aż trzy panele będą reprezentować widoki koronalne, strzałkowe i poprzeczne próbki. Gdy wszystkie trzy panele zostaną odpowiednio ustawione, zorientowane i rozjaśnione, kliknij panel reprezentujący widok koronalny. Następnie kliknij Eksport filmu po prawej stronie paska menu.Kliknij partię i przeciągnij suwaki od i do, aby objąć cały obszar zainteresowania. W polu interwał wybierz opcję taką samą jak grubość i zapisz wideo wskazujące orientację widoków. Echo pokazuje nienaruszoną przegrodę komorową bez zastawki wewnątrzkomorowej i normalnie powiązane wielkie tętnice w prawidłowej kontroli, co zostało potwierdzone przez ECM.Widok czołowy pokazuje komunikację między LA, RA, LV i RV zarówno w echu, jak i ECM, co sugeruje ubytek przegrody przedsionkowo-komorowej. Przepływ koloru pokazuje przepływ przez LV i RV, wskazując na ubytek przegrody międzykomorowej. Echo i ECM wykazały podwójne ujście prawej komory z ubytkiem przegrody międzykomorowej między LV i RV z sąsiadującymi wielkimi tętnicami.Diagnostyka ultrasonograficzna przetrwałego truncus arteriosus wykazuje komunikację między LV i RV z pojedynczą drogą odpływową obejmującą obie komory, co zostało również potwierdzone przez ECM na etapie E14.5. Skrawki pobrane z histologii ECM mogą być dalej przetwarzane w celu barwienia immunologicznego, barwienia hematoksyliną i eozyną, a nawet ekstrakcji kwasów nukleinowych w celu genotypowania i profilowania transkrypcji lub ekstrakcji białek do analizy proteomicznej. Obrazy z rekonstrukcji trójwymiarowej mogą być dalej przetwarzane w celu oceny obwodów ilościowych, takich jak powierzchnia lub objętość.Dokładne fenotypowanie w celu identyfikacji wad anatomii układu sercowo-naczyniowego jest niezbędne do ustalenia genetycznie zmodyfikowanych i zmutowanych mysich modeli wrodzonych wad serca w celu wyjaśnienia patomechanizmów wrodzonych wad serca. Może to prowadzić do potencjalnych możliwości, które pozwolą na opracowanie terapii i interwencji w celu poprawy wyników klinicznych u pacjentów z wrodzonymi wadami serca.

a-pipeline-to-characterize-structural-heart-defects-in-the-fetal-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Śmierć płodowa i okołoporodowa jest częstym zjawiskiem podczas badania zmian genetycznych wpływających na rozwój serca. Obrazowanie za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości poprawiło rozdzielczość 2-D i może dostarczyć doskonałych informacji na temat wczesnego rozwoju serca, stanowiąc idealną metodę wykrywania wpływu na strukturę i funkcję serca przed śmiercią.

Echokardiografia płodowa myszy

Ultra-wysokiej częstotliwości ultrasonografia to potężne narzędzie do obrazowania na żywo do badania nieprawidłowości w pracy serca u małych zwierząt. Jego nieinwazyjność pozwala na utrzymanie stanu fizjologicznego zarodków. W tym artykule pokazujemy zastosowanie ultrasonografii w trybie M do pomiaru częstości akcji serca zarodków przy E18,5 w macicy.

W macicy Pomiar tętna u myszy za pomocą nieinwazyjnej echokardiografii w trybie m

Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.

Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Obrazowanie ultrasonograficzne o wysokiej częstotliwości u płodu myszy poprawiło rozdzielczość obrazowania i może zapewnić precyzyjną, nieinwazyjną charakterystykę rozwoju serca i wad strukturalnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół jest przeznaczony do wykonywania echokardiografii płodu u myszy w czasie rzeczywistym in vivo.

Obrazowanie układu sercowo-naczyniowego u płodu myszy za pomocą systemu ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości (30/45 MHZ)

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

W tym protokole opisujemy procedury jakościowej i ilościowej analizy fenotypów rozwojowych u myszy związanych z wrodzonymi wadami serca.

Analiza wrodzonych wad serca w zarodkach myszy z wykorzystaniem jakościowych i ilościowych metod histologicznych

Tutaj opisujemy korelacyjny przebieg pracy dla wycinania, zwiększania ciśnienia, utrwalania i obrazowania mysiej zastawki płucnej, aby określić konformację ogólną i lokalne struktury macierzy zewnątrzkomórkowej.

Chirurgia i przetwarzanie próbek do obrazowania korelacyjnego mysiej zastawki płucnej

Obecny protokół opisuje echokardiograficzną ocenę morfologii, funkcji i przepływu krwi w naczyniach wieńcowych lewej komory serca u 7-dniowych noworodków myszy.

Echokardiograficzna charakterystyka struktury, funkcji i przepływu wieńcowego lewej komory u nowonarodzonych myszy

Poznaj zaawansowane metody diagnostyczne wad serca u płodów myszy przy użyciu echokardiografii, nekropsji i mikroskopii konfokalnej. Techniki te umożliwiają szczegółową analizę anatomiczną i rekonstrukcję 3D.

Linia do charakteryzowania strukturalnych wad serca u płodu myszy

Przeglądaj więcej filmów