Linia do charakteryzowania strukturalnych wad serca u płodu myszy
16 grudnia 2022
Ten artykuł szczegółowo opisuje metody diagnostyki mysiej wrodzonej wady serca (CHD) za pomocą echokardiografii płodu, sekcji zwłok i episkopowego przechwytywania obrazu fluorescencyjnego (EFIC) za pomocą episkopowej mikroskopii konfokalnej (ECM), a następnie trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji.
Protokół ten przedstawia najnowocześniejsze metody generowania danych obrazowych o wysokiej rozdzielczości w celu diagnozowania wrodzonych wad serca. Przeprowadzamy oceny funkcjonalne za pomocą nieinwazyjnej echokardiografii płodu połączonej z sekcją zwłok, a następnie histopatologią w mikroskopii konfokalnej w celu wygenerowania seryjnych stosów obrazów 2D i rekonstrukcji 3D w celu kompleksowej diagnostyki choroby niedokrwiennej serca. Metoda ta może wyjaśnić szczegółowe zmiany anatomiczne nie tylko w wrodzonych wadach serca, ale może być również wykorzystana do badania strukturalnych wad wrodzonych w innych narządach, w tym wad czaszki twarzy, anomalii kończyn i szkieletu, a także wad mózgu i innych narządów trzewnych.
Procedury te zademonstrują Meghan Holbrook, Carla Guzman, Peizhao Zhang i Benjamin Glennon, wszyscy badacze z naszego laboratorium. Po przygotowaniu myszki do zabiegu należy rozgrzać żel ultradźwiękowy do temperatury ciała i obficie nałożyć go na obszar obrazowania. Następnie umieść przetwornik na brzuchu zorientowanym w płaszczyźnie poziomej i zidentyfikuj pęcherz na ekranie.
Po zidentyfikowaniu pęcherza moczowego przeskanuj czaszkę z pęcherza, poszukaj płodu i określ wiek ciążowy, mierząc długość korony do zadu. Następnie użyj kolorowego dopplera, aby przeanalizować przepływ krwi z serca. Aby umożliwić utrwalającą penetrację do narządów wewnętrznych, wykonaj nacięcia w bocznej części klatki piersiowej i brzuchu za pomocą kleszczy lub nożyczek preparacyjnych i pozwól próbce utrwalić się przez co najmniej 24 godziny w chłodnym pomieszczeniu.
Następnie skonfiguruj oprogramowanie, aby zapisywać obrazy z nazwą, w tym identyfikacją próbki, powiększeniem mikroskopu i zawartością obrazu. Przypnij próbkę przez nadgarstki i kostki. Przed przecięciem skóry wzdłuż osi środkowej w kierunku ogona podnieś skórę na środku szyi za pomocą kleszczy i przetnij skórę nożyczkami w kierunku obu pach
.Następnie przetnij skórę od pępka do nóg. Po osadzeniu próbek dostosuj pozycję projekcji laserowej do środka próbki na ekranie i ustaw pokrętło zoomu na 20x. Aby zoptymalizować rozdzielczość, ustaw wzmocnienie na 1,250V.
Zmaksymalizuj niebieski obszar za pomocą pokrętła ostrości, a następnie zresetuj wzmocnienie do około 750 V w celu obrazowania. Następnie zmień metodę cięcia na automatyczną. Ustaw grubość na około 50 mikrometrów i uruchom szkiełka.
Przerwij cięcie, gdy płuca i drogi oddechowe są w zasięgu wzroku. Wybierz grubość cięcia od ośmiu do 10 mikrometrów i zatrzymaj otwarty podgląd na żywo. Otwórz program Microtome Communicator, aby rozpocząć obrazowanie.
Upewnij się, że folder pamięci tymczasowej jest pusty przed pobraniem obrazów. Zatrzymaj zbieranie obrazów, gdy nie jest widoczna żadna sztywna struktura. Wyślij pliki przechowywane tymczasowo do jednej serii obrazów TIFF.
Aby zrekonstruować obraz 3D, przeciągnij i upuść pliki obrazów do oprogramowania do przetwarzania obrazu. Gdy pojawi się wyskakujące okienko, wybierz linki lub pliki, które chcesz skopiować do bazy danych. Po otwarciu pliku kliknij menu Narzędzia do rekonstrukcji 2D 3D na pasku narzędzi i wybierz 3D MPR.
W przypadku rozdzielczości piksela X i rozdzielczości piksela Y wprowadź rozdzielczość obrazu, podając powiększenie używane podczas obrazowania ECM. Jako interwał przekroju wprowadź grubość warstwy używaną do cięcia podczas obrazowania ECM. Następnie użyj narzędzia WWWL, aby dostosować szerokość okna i poziom okna.
Kliknij i przeciągnij narzędzie na obrazie w górę, aby zmniejszyć jasność obrazu, lub w dół, aby ją zwiększyć. Kliknij i przeciągnij narzędzie na obrazie w prawo, aby zmniejszyć kontrast obrazu i w lewo, aby go zwiększyć. Przeciągnij obrazy w żądane pozycje za pomocą narzędzia do przesuwania.
Użyj narzędzia do powiększania, aby powiększyć lub pomniejszyć obraz, a narzędzia do obracania, aby obrócić obraz zgodnie z potrzebami. Teraz kliknij i przeciągnij kolorową oś pierwszego panelu. Zwróć uwagę, jak obracanie tej osi zmienia orientację pozostałych dwóch paneli.
Obróć osie trzech paneli, aż trzy panele będą reprezentować widoki koronalne, strzałkowe i poprzeczne próbki. Gdy wszystkie trzy panele zostaną odpowiednio ustawione, zorientowane i rozjaśnione, kliknij panel reprezentujący widok koronalny. Następnie kliknij Eksport filmu po prawej stronie paska menu.
Kliknij partię i przeciągnij suwaki od i do, aby objąć cały obszar zainteresowania. W polu interwał wybierz opcję taką samą jak grubość i zapisz wideo wskazujące orientację widoków. Echo pokazuje nienaruszoną przegrodę komorową bez zastawki wewnątrzkomorowej i normalnie powiązane wielkie tętnice w prawidłowej kontroli, co zostało potwierdzone przez ECM.
Widok czołowy pokazuje komunikację między LA, RA, LV i RV zarówno w echu, jak i ECM, co sugeruje ubytek przegrody przedsionkowo-komorowej. Przepływ koloru pokazuje przepływ przez LV i RV, wskazując na ubytek przegrody międzykomorowej. Echo i ECM wykazały podwójne ujście prawej komory z ubytkiem przegrody międzykomorowej między LV i RV z sąsiadującymi wielkimi tętnicami.
Diagnostyka ultrasonograficzna przetrwałego truncus arteriosus wykazuje komunikację między LV i RV z pojedynczą drogą odpływową obejmującą obie komory, co zostało również potwierdzone przez ECM na etapie E14.5. Skrawki pobrane z histologii ECM mogą być dalej przetwarzane w celu barwienia immunologicznego, barwienia hematoksyliną i eozyną, a nawet ekstrakcji kwasów nukleinowych w celu genotypowania i profilowania transkrypcji lub ekstrakcji białek do analizy proteomicznej. Obrazy z rekonstrukcji trójwymiarowej mogą być dalej przetwarzane w celu oceny obwodów ilościowych, takich jak powierzchnia lub objętość.
Dokładne fenotypowanie w celu identyfikacji wad anatomii układu sercowo-naczyniowego jest niezbędne do ustalenia genetycznie zmodyfikowanych i zmutowanych mysich modeli wrodzonych wad serca w celu wyjaśnienia patomechanizmów wrodzonych wad serca. Może to prowadzić do potencjalnych możliwości, które pozwolą na opracowanie terapii i interwencji w celu poprawy wyników klinicznych u pacjentów z wrodzonymi wadami serca.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł szczegółowo opisuje zaawansowane metody diagnostyczne wrodzonych wad serca (CHD) u myszy za pomocą nieinwazyjnej echokardiografii płodowej, sekcji zwłok i episkopowej mikroskopii konfokalnej. Techniki te pozwalają na obrazowanie wysokiej rozdzielczości i rekonstrukcję 3D w celu oceny zmian anatomicznych związanych z CHD i innymi wadami wrodzonymi.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Kardiologia
- Techniki obrazowania
Tło
- Wrodzone wady serca (CHD) są istotnym problemem zdrowotnym w modelach mysich.
- Dokładna diagnoza jest kluczowa dla zrozumienia i leczenia CHD.
- Innowacyjne metody obrazowania mogą poprawić zdolności diagnostyczne.
- Echokardiografia płodowa zapewnia nieinwazyjną ocenę struktury serca.
Cel badania
- Aby wykazać skuteczne metody diagnostyczne CHD.
- Aby wykorzystać zaawansowane techniki obrazowania do szczegółowej analizy anatomicznej.
- Aby zbadać zastosowanie tych metod w innych wrodzonych wadach strukturalnych.
Stosowane metody
- Nieinwazyjna echokardiografia płodowa do oceny funkcjonalnej.
- Sekcja zwłok do analizy pośmiertnej.
- Episkopowa mikroskopia konfokalna do badania histopatologicznego.
- Rekonstrukcja 3D z serii 2D obrazów.
Główne wyniki
- Udało się wygenerować dane obrazowania wysokiej rozdzielczości.
- Wyjaśniono szczegółowe zmiany anatomiczne w CHD.
- Metody te mogą być stosowane do innych wad narządowych.
- Demonstrowane procedury poprawiają zrozumienie wrodzonych anomalii.
Wnioski
- Zaawansowane techniki obrazowania znacznie poprawiają diagnozę CHD.
- Te metody mogą być przystosowane do różnych wrodzonych wad strukturalnych.
- Przyszły badania mogą budować na tych odkryciach dla lepszych wyników klinicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution phenotyping of congenital heart defects in fetal mouse models enables precise target validation and mechanistic de-risking in cardiovascular research. Integrating noninvasive echocardiography with episcopic confocal microscopy and 3D reconstruction supports predictive confidence at the early discovery and preclinical inflection points. This pipeline enhances portfolio decision-making by providing robust anatomical and functional data for genetically engineered models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of cardiovascular developmental pathways in genetically engineered mouse models.
- Supports functional target validation by correlating genotype with detailed cardiac phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through high-fidelity anatomical and functional readouts.
- Improves predictive confidence for advancing candidate targets in congenital heart disease research.
Screening & Assay Development
- Provides validated imaging and histopathology workflows for reproducible phenotypic screening.
- Standardizes quantitative assessment of cardiac structure and function for assay development.
- Enables scalable, high-throughput phenotyping for genetic and pharmacological screens.
- Delivers robust data for reliable compound or genetic intervention evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns murine phenotypes with human congenital heart disease for translational biomarker development.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling detailed anatomical mapping.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative and reproducible phenotyping outputs.
- Facilitates downstream molecular and proteomic analyses for mechanistic insight.
Pipeline & Workflow Integration
This phenotyping pipeline bridges early discovery, target validation, and preclinical research by integrating functional imaging and 3D histopathology in murine models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through detailed anatomical and functional data.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and screening scalability.
- Analytics: Provides high-resolution measurements and 3D reconstructions for comparative analysis of cardiac phenotypes.
- Translational Research: Enables alignment of murine and human disease phenotypes for biomarker and therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable workflow for phenotyping across cardiovascular and other organ systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiovascular target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of phenotyping workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of genetically engineered models and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fetal echocardiography, episcopic confocal microscopy, and 3D image analysis.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and histopathology infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for data acquisition and analysis protocols.
- Adaptable to other organ systems with appropriate imaging and processing adjustments.
- Dependent on rigorous sample preparation and imaging parameter optimization for reproducibility.
