Name: Wzbogacanie kultur neuronów zwojów zwojów korzenia grzbietowego dorosłych myszy za pomocą immunopanningu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj metodę immunopanningu do wzbogacania kultur neuronów zwojów korzenia grzbietowego dorosłych myszy. Protokół selektywnie eliminuje komórki pozaneuronalne, zwiększając zawartość neuronów do ponad 70%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Project Grant z Canadian Institutes of Health Research (FRN-162434) oraz Discovery Grant z MS Society of Canada (EGID-3761). Autorzy pragną podziękować dr Sunowi i Cross Cancer Institute za szkolenie i korzystanie z systemu ImageXpress.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Alberty (protokół 0000274).
1. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Na dzień 1 należy przygotować następujące odczynniki: woda klasy do hodowli komórkowych; poli-D-lizyna – przygotować bulion, rozpuszczając całą butelkę w 50 ml wody klasy hodowlanej do stężenia podstawowego 100 μg/ml, przechowywać w temperaturze 4 °C i rozcieńczyć podstawowy stosunek 1:10 w wodzie o czystości hodowlanej do końcowego stężenia 10 μg/ml; tris-HCl – przygotować bulion przez rozpuszczenie sproszkowanego chlorowodorku tris w wodzie o jakości hodowlanej do stężenia podstawowego 500 mM (3,94 g w 50 ml), pH 9,5, sterylizować filtrem (0,22 μm), przechowywać w temperaturze 4 °C i rozcieńczyć wywar w stosunku 1:10 w wodzie o jakości hodowlanej do końcowego stężenia 50 mM; przeciwciała drugorzędowe (koza anty-szczur, -królik i -mysz).</li>
	<li>Na dzień 2 przygotuj następujące odczynniki.
	<ol>
		<li>Przygotować zbilansowany roztwór soli Hanka o klasie Ca2+, Mg2+ wolny od kultur komórkowych (HBSS; HBSS-/-) oraz sól fizjologiczna buforowana D-fosforanem klasy hodowli komórkowej (PBS) z Ca2+ i Mg2+. Przygotować porcję wywaru z lamininą i przechowywać w temperaturze -80 °C natychmiast po otrzymaniu; rozcieńczyć materiał w sterylnym HBSS-/- do końcowego stężenia 10 μg/ml dla materiału roboczego.</li>
		<li>Przygotować 4% bulion z albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczając 400 mg BSA w 7,5 ml D-PBS (pH 7,4), doprowadzić objętość do 10 ml, wysterylizować filtrem (0,22 μm), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować 0,2% BSA, rozcieńczając 750 μl 4% BSA w 14,25 ml D-PBS.</li>
		<li>Przygotować 0,4% wywaru DNAzy, dodając 1 ml zbilansowanego roztworu soli Earle'a (EBSS) na 12 500 jednostek DNAse, wysterylizować filtrem (0,22 μm), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować bufor do płukania (0,02% BSA), dodając 3 ml 0,2% BSA i 100 μl 0,4% DNAzy w 27 ml D-PBS. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe (CD45, PDGRFβ, O4). 
		UWAGA: Ten protokół wykorzystuje hybrydomę O4 8,9, jednak 10 μg komercyjnie dostępnego przeciwciała O4 byłoby również odpowiednie.</li>
		<li>Przygotować wywar z kolagenazy złożonej, rozpuszczając butelkę kolagenazy złożonej (50 mg) w 5 ml HBSS-/-, podwielokrotności, i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować zapas roboczy na dwie myszy, dodając 500 μl podgrzanej kolagenazy złożonej i 50 μl podgrzanej 0,4% DNazy do 4,5 ml HBSS-/-.</li>
		<li>Przygotować low ovomukoid, dodając 3 g BSA do 150 ml D-PBS, następnie dodać 3 g inhibitora trypsyny i wymieszać do rozpuszczenia. Dostosuj pH do 7,4 i zwiększ objętość do 200 ml za pomocą D-PBS. Przefiltrować, wysterylizować, przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. W dniu rozbioru połączyć 1 ml nisko umieszczonego owomukoidu w 9 ml D-PBS w roztworze roboczym.</li>
		<li>Przygotować 15% BSA, rozpuszczając 7,5 g BSA w 50 ml HBSS-/- (umieścić na shakerze do całkowitego rozpuszczenia), przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować 50 ml pożywki neuronalnej, dodając 23,2 ml DMEM, 23,2 ml pożywki neurobazalnej, 500 μl glutamaxu, 500 μl pirogronianu sodu, 500 μl penicyliny/streptomycyny (podwielokrotność natychmiast po przybyciu i przechowywać w temperaturze -20 °C), 500 μl insuliny (5 μg/ml ostatecznie), 500 μl SATO, 50 μl N-acetylo-L-cysteiny (NAC; 5 μg/ml final) i 1 000 μl witaminy B27+ (natychmiast podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C po otrzymaniu).
		<ol>
			<li>Przygotować wywar insuliny, rozpuszczając się w wodzie o czystości hodowlanej do stężenia 0,5 mg/ml (50 mg w 100 ml), dostosować pH do 7,4, wysterylizować filtrem (0,22 μm), przygotować 500 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
			<li>Przygotuj wywar SATO, łącząc 20 μl progesteronu (2,5 mg w 100 μl etanolu), 800 μl seleninu sodu (4 mg w 10 ml podłoża neurobazalnego + 10 μl 1 N NaOH), 800 mg BSA, 800 mg transferyny, 128 mg dichlorowodorku putrescyny i 80 ml neurobazalu. Filtrować sterylizować (0,22 μm), przygotować 500 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Niezbędne jest przygotowanie świeżych roztworów progesteronu i seleninu sodu.</li>
			<li>Przygotować 50 μl wywaru N-acetylo-L-cysteiny (NAC), rozpuszczając w podłożu neurobazalnym do stężenia podstawowego 5 mg/ml (50 mg w 10 ml), wysterylizować filtrem (0,22 μm), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na dzień 4 i 5 przygotuj następujące odczynniki.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,2 M bufor fosforanowy (PB) rozpuszczając 21,8 g dwuzasadowego fosforanu sodu (Na2HPO4) i 8,34 g jednozasadowego fosforanu sodu dwuwodnego (NaH2PO4) w 1 000 ml wody. Dostosuj pH do 7,4 i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować 8% paraformaldehyd (PFA) w następujący sposób: w dygestorium podgrzać 50 ml wody do 55 °C, wyłączyć ogień i dodać 8 g granulek PFA, ciągle mieszając. Dodawać kroplami 1 N NaOH, aż roztwór zacznie klarować się, następnie dodać 40 ml 0,2 M PB i kontynuować mieszanie, aż będzie klarowny. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej, dostosować pH do 7,4 i zwiększyć objętość do 100 ml za pomocą 0,2 M PB. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
		<li>Przygotować D-PBS + Triton X-100 (PBSTX), dodając 0,2% Triton X-100 do klasy hodowlanej D-PBS (1 ml Triton + 500 ml D-PBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotować roztwór blokujący, który stanowi 1% normalnej surowicy osła (NDS) w PBSTX. Z wyprzedzeniem można przygotować i przechowywać 1 ml NDS + 9 ml PBSTX w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach po 10 ml.</li>
		<li>Przygotować roztwór przeciwciał o stężeniu 0,2% NDS/0,2% BSA w PBSTX: 200 μl NDS + 200 mg BSA + 9,6 ml PBSTX; może być przygotowany z wyprzedzeniem i przechowywany w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach 10 ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konfiguracja sprzętu
<ol>
	<li>Przygotuj następujący sprzęt: sterylną szafkę bezpieczeństwa biologicznego do hodowli komórkowych, zestaw mikropipet, pipety serologiczne i pistolet do pipet, 10 cm szalki Petriego, pożądane szalki do hodowli komórkowych do posiewu (w tym przypadku do obrazowania użyto 24-dołkowych czarnych płytek ze szklanym dnem), stożkowe probówki o pojemności 15 ml i 50 ml, narzędzia do preparowania (mianowicie: cienkie nożyczki sprężynowe do laminektomii i przycinania nerwów, cienkie kleszcze, i żyletka), łaźnia wodna ustawiona na 37 °C, sitko do komórek 70 μm, wirówka (10 min przy 300 x g) z adapterami do probówek stożkowych 15 ml, błękit trypanowy i hemocytometr, wyciąg i magnetyczna płyta grzejna do mieszania.</li>
</ol>
3. Metoda eksperymentalna
<ol>
	<li>Dzień 1: przygotowanie potraw
	<ol>
		<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego pokryj żądaną powierzchnię hodowli wystarczającą ilością poli-D-lizyny, aby pokryć dno studzienki. Przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. W tym przypadku do obrazowania użyto 24-dołkowych płytek ze szklanym dnem, a więc użyto 300 μl poli-D-lizyny.</li>
		<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotuj naczynia do garnkowania: na szalkę CD45 dodaj 10 ml roboczego roztworu tris-HCl i 30 μl koziej antyszczurzej IgG na 10 cm szalkę Petriego; na szalkę PDGFRβ dodaj 10 ml roboczego roztworu tris-HCl i 30 μl koziej anty-króliczej IgG na 10 cm szalkę Petriego; na szalkę O4 hybridoma, dodać 10 ml roboczego roztworu tris-HCl i 30 μl koziej anty-mysiej IgG na 10 cm szalkę Petriego. Upewnij się, że roztwór pokrywa całą powierzchnię naczynia i pozostaw na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2: rozwarstwienie, rozwarstwienie i immunopaning
	<ol>
		<li>Odessać poli-D-lizynę, umyć płytki trzykrotnie wodą z hodowli tkankowych, uchylić pokrywę i pozostawić powierzchnię do całkowitego wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Nanieść wystarczającą ilość lamininy na płytki, aby pokryć dno każdej studzienki i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C. W przypadku płytek 24-dołkowych wystarczy 200 μl.</li>
		<li>Zakończ przygotowywanie potraw do smażenia. Umyj każde naczynie D-PBS i inkubuj z 10 μg przeciwciała pierwszorzędowego. Pozostawić w temperaturze pokojowej na co najmniej 2 godziny.</li>
		<li>W przypadku szalki CD45 dodaj 5 ml 0,2% BSA i 20 μl podstawowej płytki CD45; w przypadku szalki PDGFRβ dodaj 5 ml 0,2% BSA i 15,4 μl PDGFRβ; w przypadku szalki O4 dodaj 3 ml 0,2% BSA, 2 ml hybrydoma O4 i dodatkowe 100 μL 4% BSA (aby upewnić się, że końcowe stężenie BSA pozostanie na poziomie 0,2%).</li>
		<li>Poddaj eutanazji od jednej do czterech myszy za pomocą 0,1 ml/kg pentobarbitolu sodu (na 10 cm naczynie immunologiczne). Użyliśmy myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni. Obie płcie były używane i hodowane oddzielnie od siebie. Przelej zwierzę 30 ml zimnej 0,9% soli fizjologicznej.</li>
		<li>Przypnij przednie i tylne łapy do styropianu i użyj czystej żyletki, aby odsłonić kręgosłup od tyłu. Wykonaj laminektomię, wykonując nacięcia o głębokości około połowy po obu stronach grzbietowego kręgosłupa, usuwając grzbietową połowę kręgosłupa, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Albo delikatnie przetnij nerwy i usuń rdzeń kręgowy, albo delikatnie popchnij rdzeń na bok, zachowując integralność nerwu.</li>
		<li>Użyj korzeni nerwów rdzeniowych (odciętych lub przyczepionych do rdzenia kręgowego), aby znaleźć i usunąć wszystkie DRG po obu stronach kręgosłupa. Przycinaj resztki nerwowe z każdego DRG podczas jego usuwania (więcej resztek nerwowych w kulturze może prowadzić do słabej przeżywalności hodowli). Zebrać DRG w 15 ml HBSS-/- w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie. 
		UWAGA: Należy pamiętać, że tkanka jest preparowana na wolnym powietrzu, ale po dodaniu DRG do probówki należy je traktować jako sterylne i manipulować nimi tylko w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Umieść zamrożone zapasy stemxyme 1 i 0,4% DNAzy w łaźni wodnej, około 30 minut przed końcem sekcji (mniej więcej podczas uruchamiania ostatniej myszy). Pozwól im osiąść na dnie stożkowej rurki, a następnie kontynuuj protokół w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Odessać większość HBSS-/- z DRG. Użyj pipety zamiast ssania, aby uzyskać <1 ml płynu i pozostaw ~100 μl płynu, aby nie ryzykować utraty tkanki.</li>
		<li>Umyj trzy razy 1 ml HBSS-/-. Dodaj 5 ml roboczego roztworu stemxyme do tkanki. Przykryj pokrywkę przezroczystą folią i zanurz rurkę na boku w łaźni wodnej nastawionej na 37 °C na 1 godzinę.</li>
		<li>Po inkubacji w enzymie dodać do probówki 1 ml roztworu inhibitora o niskiej zawartości ovo. Delikatnie rozetrzeć komórki pipetą p1000 10-15 razy. Pozwól, aby kawałki tkanki opadły.</li>
		<li>Przenieść górne 2-3 ml roztworu (zawierającego zdysocjowane komórki) do świeżego roztworu o niskiej zawartości ovomukoidów. Powtarzaj, aż tkanka zostanie całkowicie zdysocjowana i nie pozostaną żadne widoczne kawałki.</li>
		<li>Wirować przez 10 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej. Ponownie odsysać supernatant, używając pipety zamiast odsysania przez ostatni 1 ml, pozostawiając ~100 μl, i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do płukania.</li>
		<li>Delikatnie odpipetować do wymieszania. Wstępnie zwilż sitko o pojemności 70 μm z 1 ml buforu do płukania na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przefiltrować roztwór komórkowy przez sitko do komórek.</li>
		<li>Przemyć probówkę 1 ml buforu do płukania, a następnie przepuścić przez sitko (3 ml filtratu). Delikatnie ułóż zawiesinę komórkową (1 ml na raz) na wierzchu 2 ml 15% poduszki BSA, aby usunąć resztki mieliny. Poduszka o pojemności 2 ml jest skuteczna dla dwóch myszy, a 3 ml jest skuteczna dla czterech myszy.
		<ol>
			<li>W celu nałożenia warstw umieść 2 ml BSA w probówce, zamknij i delikatnie pokryj boki probówki BSA. Następnie delikatnie nałożyć zawiesinę komórek na wierzchu, pipetując do boku probówki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wirować w temperaturze pokojowej przy 300 x g przez 10 minut (powolne przyspieszanie i zwalnianie). Użyj pipety P1000, aby usunąć przezroczysty płyn z wierzchu, fazę mielinową pomiędzy nimi i BSA, po 1 ml na raz (zmieniając końcówki między każdym ml). Pozostaw ~100 μL BSA, aby nie naruszyć pelletu.</li>
		<li>Dodać 5 ml buforu do płukania i inkubować probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i stężeniu 10% CO2 przez 30-45 minut. Pozwala to na pobranie antygenu. Pamiętaj, aby poluzować nakrętkę, aby umożliwić wymianę gazu.</li>
		<li>Umyj naczynie CD45 trzy razy za pomocą D-PBS. Odlej ostatnie płukanie. Przelać zawiesinę komórek do naczynia CD45.</li>
		<li>Inkubować komórki na szalce CD45 przez łącznie 20 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wirując w punkcie 10 minut, aby umożliwić komórkom równy dostęp do przeciwciała.</li>
		<li>Opłucz naczynie PDGFRβ trzykrotnie za pomocą D-PBS i odlej ostatnie płukanie. Przenieść niezwiązane komórki z szalki CD45 na szalkę PDGFRβ.</li>
		<li>Delikatnie potrząśnij naczyniem CD45 i podeprzyj je pod kątem. Delikatnie odpipetować 1 ml zawiesiny komórek na naczyniu, aby zebrać niezwiązane komórki. Przelać ją do naczynia PDGFRβ i odpipetować, aby przenieść pozostałą zawiesinę komórek na płytkę PDGFRβ.</li>
		<li>Inkubować płytkę PDGFRβ przez łącznie 20 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie obracając w punkcie 10 minut, aby umożliwić komórkom równy dostęp do przeciwciała.</li>
		<li>Opłucz naczynie O4 trzy razy za pomocą D-PBS i odlej ostatnie płukanie. Przenieść niezwiązane komórki z szalki PDGFRβ na szalkę O4, stosując tę samą metodę, co w kroku 3.2.19. Inkubować płytkę O4 przez łącznie 20 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie obracając w punkcie 10 minut, aby umożliwić komórkom równy dostęp do przeciwciała.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 10 minut przy 300 x g. Ponownie zawiesić komórki w żądanej objętości i rozcieńczyć 1:1 błękitem trypanowym, aby zapewnić żywotność komórek. Policz średnie i duże komórki za pomocą hemocytometru (pozwoli to na najlepsze odwzorowanie liczby neuronów w hodowli).</li>
		<li>Usuń lamininę i ułóż komórki w żądanej gęstości. Nie dopuścić do wyschnięcia płytki między usunięciem lamininy a posiewem i natychmiast dodaj komórki.</li>
		<li>Hodować ilościowo oznaczone komórki w celu wzbogacenia neuronów (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3) z 500 neuronami w 25 μl pożywki hodowlanej (opisanej w 1.2.7) na studzience na basenie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Zalać studzienki do końcowej objętości 500 μL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 4: utrwalenie, zablokowanie i pierwotne utrwalenie immunocytochemii (ICC)
	<ol>
		<li>Po 48 godzinach wzrostu dodać 500 μl/studzienkę (lub objętość odpowiadającą pożywce w studzience) 8% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki. Jeśli pożądana jest analiza pożywki, można bezpośrednio naprawić za pomocą 4% PFA. Jednak tego nie testowaliśmy.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie D-PBS. Należy zauważyć, że trzymaliśmy te komórki w hodowli bez zmiany pożywki przez maksymalnie 72 godziny, ale przypuszczamy, że mogą przetrwać dłużej, szczególnie jeśli pożywka zostanie zmieniona w połowie.</li>
		<li>Usuń ostatnie płukanie i dodaj tyle roztworu blokującego do studzienki, aby całkowicie pokryć komórki. Blokuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe do roztworu przeciwciała: β3-tubulinę w rozcieńczeniu 1:1,000. Uszczelnić płytkę przezroczystą folią i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Można rozważyć barwienie PDGFRβ w przypadku braku fibroblastów, CD45 w przypadku braku komórek odpornościowych, P0 lub PMP22 w przypadku braku mieliny lub fabp7 w przypadku gleju satelitarnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 5: Wtórne ICC
	<ol>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie D-PBS. Usuń ostatnie płukanie i dodaj przeciwciała drugorzędowe w roztworze przeciwciał: anty-królik 488 w rozcieńczeniu 1:500 i DAPI w rozcieńczeniu 1:2,000. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.</li>
		<li>Umyj D-PBS trzy razy. Dodaj tyle D-PBS, aby pokryć dno studni i obraz. Płytkę można uszczelnić przezroczystą folią, chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human dorsal root ganglia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 271(2019).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).</li>
<li>Lin, Y. T., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+root+ganglia+isolation+and+primary+culture+to+study+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569(2018).</li>
<li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li>
<li>Nolle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+Glial+Cells+From+Human+Post-mortem+Tissue+for+Transcriptome+and+Proteome+Analysis+Using+Immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011(2021).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+and+troubleshooting+immunopanning+protocols+for+purifying+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).</li>
<li>Zuchero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+dorsal+root+ganglion+neurons+from+rat+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).</li>
<li>Sommer, I., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+%28O1+to+O4%29+to+oligodendrocyte+cell+surfaces%3A+an+immunocytological+study+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system.</a> Developmental Biology. 83 (2), 311-327 (1981).</li>
<li>Sommer, I., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+that+are+O4+antigen-positive+and+O1+antigen-negative+differentiate+into+O1+antigen-positive+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes.</a> Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).</li>
<li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+from+form+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research.+Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).</li>
<li>Viveiros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+labeling+coupled+to+direct+analysis+of+extracellular+vesicles+in+the+conditioned+medium+to+study+extracellular+vesicles+secretion+with+minimum+sample+processing+and+particle+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss.</a> Cells. 11 (3), 351(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Ten protokół immunopanningu zwiększa odsetek komórek neuronalnych w hodowlach pierwotnych DRG. Aby uzyskać najlepsze wyniki, sekcje powinny być wykonywane w odpowiednim czasie, a DRG powinny być przycięte z nadmiaru nerwów. Etap dysocjacji powinien być dokładnie monitorowany i nie powinien przekraczać 1 godziny, aby zapobiec niepotrzebnemu stresowi komórek. Jeśli chodzi o immunopanting, każda płytka powinna być delikatnie zawirowana w połowie drogi, aby umożliwić komórkom dostęp do powlekanych przeciwciał. Płytki należy ...

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) mieszczą ciała komórkowe neuronów czuciowych, które unerwiają tkanki obwodowe. Badanie tych neuronów pozwala nam zrozumieć mechanistyczne podstawy bólu i stanów czuciowych. Jednak DRG nie składają się z samych neuronów, ale zawierają również fibroblasty, komórki Schwanna, makrofagi i inne komórki odpornościowe1. Pomimo obecności tych różnych typów komórek, całe kultury DRG są często określane w literaturze jako neuronalal2,3. Kultury te są nadal przydatne do badania neuronów za pomocą obrazowania lub cytometrii przepływowej, co pozwoliłoby na identyfikację neuronów na podstawie barwienia, wielkości komórki i/lub morfologii. Jednak w przypadku testów, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) lub western blotting, w których hodowle są homogenizowane w celu zebrania RNA lub białka, obecność nieneuronalnych typów komórek może zakłócać wyniki. W związku z tym istnieje potrzeba zwiększenia udziału komórek nerwowych w hodowlach DRG.
Immunopanning to technika używana do oczyszczania różnych typów komórek, w tym neuronów korowych, astrocytów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i mikrogleju. Mówiąc prościej, polega na przyklejeniu przeciwciała przeciwko markerowi powierzchni komórki do szalki Petriego, przeznaczonej do wiązania określonych komórek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) i może być używana do wybierania za lub przeciw typom komórek będących przedmiotem zainteresowania4,5,6. Immunopanujące embrionalne DRG szczurów w celu selekcji komórek nieneuronalnych zostały wcześniej opisane przez Zuchero7. Nie udało nam się jednak znaleźć protokołu immunopanningu specyficznego dla mysich DRG. W tym protokole opieramy się na podstawowych lokatorach protokołu Zuchero, ale zamiast tego dostosowaliśmy sekwencję immunopanningu, aby wzbogacić hodowle DRG dorosłych myszy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Jest to potężne narzędzie do badania ustalonych neuronów czuciowych w kulturze. Jest to korzystne, ponieważ pozwala na wykorzystanie dorosłych myszy z modeli genetycznych, chorobowych i urazowych, dzięki czemu ich neurony czuciowe mogą być badane z większą szczegółowością.
Ten protokół jest korzystny dla czytelników chcących zwiększyć udział neuronów w hodowlach DRG dorosłych myszy. Można jednak również pominąć etapy immunopanningu, a protokół ten można również stosować do całych kultur DRG.

<table><tbody><tr><td>Filtry strzykawkowe 0,2 um</td><td>Fisher</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego 100 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe czarne szklane płytki</td><td>Cellvis</td><td>P24-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>70 um sitko komórkowe</td><td>Cedarlane</td><td>15-1070-1(BI)</td><td></td></tr><tr><td>B27+ suplement</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>dla 15% poduszki BSA i ICC (frakcja szoku cieplnego &ge; 98%)</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4161</td><td>dla 4% BSA do immunopanningu i SATO dla pożywki (zasadniczo wolna od globulin, odpowiednia do hodowli komórkowych, &ge; 99%)</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD45</td><td>BD Pharmigen</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>DNAse Worthington</td><td></td><td>LS002007</td><td>do roztworu stemxyme i buforu do płukania</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6267</td><td>dla DNAse roztwór</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna P8 gatunek ThermoFisher</td><td></td><td>09-795K</td><td>do 8% PFA</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>kozio-anty-mysia IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-005-020</td><td>do naczynia O4&nbsp;</td></tr><tr><td>koza-anty-królik 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>kozio-anty-królik IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-005-003</td><td>dla PDGFRB danie</td></tr><tr><td>kozio-anty-szczurze IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-005-044</td><td>dla talerza CD45</td></tr><tr><td>HBSS -/-</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>14175145</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>laminina</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało O4</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Hybridoma</td></tr><tr><td>Ovomucoid inhibitor trypsyny</td><td>Cedarlane</td><td>LS003086</td><td>na niskie ovo</td></tr><tr><td>granulki paraformaldehydu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>441244</td><td>dla 8% przeciwciała</td></tr><tr><td>PFA PDGFRB</td><td>Abcam</td><td>AB32570</td><td></td></tr><tr><td>penicylina / streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td>dla SATO</td></tr><tr><td>Dihydrochrlorek putrescyny&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5780</td><td>dla SATO</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Fisher</td><td>S374-1</td><td>dla 0,2 M PB</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04269</td><td>dla 0,2 M PB</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>ThermoFisher</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S5261</td><td>dla SATO</td></tr><tr><td>Stemxyme I</td><td>Cedarlane</td><td>LS004107</td><td>do dysocjacji tkanek; kolagenaza kombinowana</td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1147</td><td>dla SATO</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>trypan niebieski</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>&beta; 3-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2200</td><td></td></tr></tbody></table>

wzbogacanie kultur neuronów zwojów zwojów korzenia grzbietowego dorosłych myszy za pomocą immunopanningu

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) to struktury obwodowe przylegające do grzbietowego rogu rdzenia kręgowego, w których znajdują się ciała komórkowe neuronów czuciowych, jak również różne inne typy komórek. Opublikowane protokoły hodowli często odnoszą się do całych zdysocjowanych kultur DRG jako neuronalnych, pomimo obecności fibroblastów, komórek Schwanna, makrofagów i limfocytów. Podczas gdy te całe kultury DRG są wystarczające do zastosowań obrazowych, w których neurony można rozpoznać na podstawie morfologii lub barwienia, homogenaty białek lub RNA zebrane z tych kultur nie są pierwotnie pochodzenia neuronalnego. Tutaj opisujemy sekwencję immunosanitarną dla hodowanych mysich DRG. Celem tej metody jest wzbogacenie kultur DRG dla neuronów poprzez usunięcie innych typów komórek. Immunopanning odnosi się do metody usuwania typów komórek poprzez przyleganie przeciwciał do szalek z kulturą komórkową. Korzystając z tych szalek, możemy negatywnie selekcjonować i zmniejszać liczbę fibroblastów, komórek odpornościowych i komórek Schwanna w hodowli. Ta metoda pozwala nam zwiększyć odsetek neuronów w kulturach.

Utrwalone komórki barwione DAPI i β3-tubuliną obrazowano następnie za pomocą konfokalnego systemu wysokoprzepustowego przesiewania (high content screening system). Obrazy analizowano przy użyciu odpowiedniego komercyjnego oprogramowania, aby określić odsetek komórek DAPI-dodatnich wykazujących koekspresję β3-tubuliny (Rysunek 3). W całych kulturach zwojów korzeniowych tylnych (DRG) stwierdzono barwienie β3-tubuliną na poziomie 42,36% ± 6,4%, natomiast w kulturach DRG oczyszczonych metodą imm...

Ten artykuł opisuje protokół immunopaningu dla zwojów korzenia grzbietowego dorosłej myszy. Przylegając przeciwciała do płytek hodowlanych, możemy negatywnie selekcjonować i usuwać komórki nieneuronalne. Pokazujemy, że kultury są wzbogacone o neurony przy użyciu tego protokołu, co pozwala na dogłębne badanie reakcji neuronów na manipulację.

Wzbogacanie kultur neuronów zwojów zwojów korzenia grzbietowego dorosłych myszy za pomocą immunopanningu

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...

Protokół ten pozwala nam zwiększyć liczbę neuronów w hodowlach zwojów korzenia grzbietowego dorosłej myszy. Może to pomóc w określeniu wkładu komórek nerwowych w daną odpowiedź. Dodaliśmy etap immunopanningu do podstawowego protokołu hodowli DRG.Główną zaletą jest selekcja w stosunku do komórek nieneuronalnych. Jeśli dopiero zaczynasz przygodę z pierwotnymi hodowlami DRG, najlepiej jest ćwiczyć sekcje, aby uzyskać jak najwięcej DRG i przyciąć jak najwięcej nerwu. Na początek odessać poli-D-lizynę używaną do powlekania płytki hodowlanej i trzykrotnie umyć płytkę wodą z hodowli tkankowej.Otwórz pokrywę i poczekaj, aż powierzchnia całkowicie wyschnie. Nałóż tyle lamininy na płytkę, aby pokryć dno każdej studzienki i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj wcześniej przygotowane naczynia do garnkowania CD45, PDGFR-beta i O4 za pomocą D-PBS.Do szalki CD45 dodaj 5 mililitrów 0,2% BSA i 20 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego CD45. W przypadku naczynia PDGFR-beta dodaj 15,2 mikrolitra PDGFR-beta do 5 mililitrów płytki zawierającej 0,2% BSA. W przypadku naczynia O4 dodaj 2 mililitry hybrydoma O4 do 3 mililitrów 0,2% BSA i dodatkowe 100 mikrolitrów 4% BSA, aby

enrichment-adult-mouse-dorsal-root-ganglia-neuron-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten artykuł opisuje metody uzyskiwania wzbogaconych populacji mysich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) w hodowli podstawowej, które różnicują się w celu wytworzenia dojrzałych oligodendrocytów (OL). Ponadto w raporcie opisano techniki wytwarzania mysich kokultur mielinizacyjnych poprzez wysiewanie mysich OPC na łożu neurytowym neuronów zwojowych korzenia grzbietowego myszy (DRGN).

Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

Ten film demonstruje procedurę izolowania neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) od zarodków szczurów i współhodowli ich z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia dojrzałych komórek Schwanna. Wyizolowane DRG są przetwarzane w celu wyizolowania neuronów i komórek glejowych. Wyizolowane komórki są hodowane w celu oczyszczenia neuronów, które są następnie hodowane wspólnie z komórkami podobnymi do komórek Schwanna (SCLC) w pożywce do wspólnej hodowli. Interakcja z neuronami DRG...

Izolacja neuronów DRG i kokultura z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia komórek Schwanna

Ten film demonstruje protokół wzbogacania kultur neuronalnych z grzbietowych zwojów korzeniowych poprzez immunopanning, poprawiając w ten sposób ich czystość i użyteczność dla badań neurologicznych.

Wzbogacenie neuronalne zwojów korzenia grzbietowego przez immunopanning

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Rozwój bólu neuropatycznego wiąże się z patologicznymi zmianami komórek glejowych rdzenia kręgowego. Brakuje niezawodnego systemu hodowli glejowej pochodzącego z dorosłej tkanki rdzenia kręgowego i przeznaczonego do badania tych komórek in vitro. Dlatego pokazujemy tutaj, jak ustalić pierwotne mieszane kultury glejowe z tkanki rdzenia kręgowego dorosłej myszy.

Przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłych myszy

W tym raporcie, zalety kultur organotypowych i dysocjacji kultur pierwotnych zwojów korzenia grzbietowego pochodzących od myszy są podkreślone w celu zbadania szerokiego zakresu mechanizmów związanych z interakcją neuron-glej, neuroplastycznością, zapaleniem nerwów i reakcją na infekcję wirusową.

Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Mikroglej jest uważany za jedne z najbardziej wszechstronnych komórek w organizmie, zdolne do adaptacji morfologicznej i funkcjonalnej. Ich heterogeniczność i wielofunkcyjność umożliwiają utrzymanie homeostazy mózgu, a jednocześnie są powiązane z różnymi patologiami neurologicznymi. Tutaj opisano technikę oczyszczania mikrogleju rdzenia kręgowego.

Szybkie i skuteczne wzbogacenie mikrogleju rdzenia kręgowego myszy

Protokół ten opisuje metody tworzenia całych i zdysocjowanych kultur zwojów korzenia grzbietowego myszy (DRG) i ich zastosowanie do oceny interakcji guz-nerw.

Tworzenie modeli in vitro hodowli zwojów korzenia grzbietowego: uzupełniające podejścia do badania przesłuchów rak-nerw

Poznaj metodę immunopanningu do wzbogacania kultur neuronów zwojów korzenia grzbietowego dorosłych myszy. Protokół selektywnie eliminuje komórki pozaneuronalne, zwiększając zawartość neuronów do ponad 70%.

Wzbogacanie kultur neuronów zwojów zwojów korzenia grzbietowego dorosłych myszy za pomocą immunopanningu

Przeglądaj więcej filmów