Przygotowanie próbki zatrzymującej zawiesinę białek do proteomiki łez metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas
December 1st, 2023
Ten protokół opisuje metodę pobierania próbek łez za pomocą pasków Schirmera oraz zintegrowany ilościowy przepływ pracy do odkrywania nieinwazyjnych biomarkerów białka łez. Proces przygotowania próbki do wychwytywania zawiesiny umożliwia szybkie i niezawodne przygotowanie próbki do rozdarcia oraz analizę spektrometryczną mas, co skutkuje wyższą wydajnością odzyskiwania peptydów i identyfikacją białek niż standardowe procedury w roztworze.
Nasze badania mają na celu zademonstrowanie zastosowania preparatu próbki wychwytującej zawiesinę białkową, znanego jako S-Trap, do badań opartych na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje szybkie, powtarzalne i ustandaryzowane przygotowanie próbki ludzkiego płynu łzowego, pobranej za pomocą paska Schirmera do badań translacyjnych w okulistyce. Ludzki płyn łzowy to płyn biologiczny, który można pobrać do nieinwazyjnych, indywidualnych badań molekularnych w okulistyce.
Brakuje ustandaryzowanych metod pobierania płynu łzowego i przygotowywania próbek, które mają kluczowe znaczenie dla udanych badań klinicznych nad chorobami i stanami. Metody niestandaryzowane są trudne do porównania i interpretacji między metodologiami, a tym samym wpływają na wyniki kliniczne. Protokół ten umożliwia pobieranie próbek biopłynu łzowego i przechowywanie go w temperaturze pokojowej.
Pomaga to w łatwiejszym pobieraniu próbek i wysyłce. Zapewnia szybką i solidną ekstrakcję peptydów do analizy spektrometrii mas, co poprawia odzyskiwanie peptydów i identyfikację. Protokół ten obejmuje minimalne etapy przygotowania próbki, aby zminimalizować błędy i niepewności.
Szybka i doskonała wydajność identyfikacji i kwantyfikacji białek za pomocą spektrometrii mas ułatwi klinicystom i badaczom opracowywanie nieinwazyjnych testów molekularnych. Zoptymalizowane przygotowanie próbki zawsze będzie jednym z krytycznych etapów, niezależnie od metody wykrywania. Wartość kliniczna ludzkiego płynu łzowego nie została jeszcze w pełni zbadana.
Miejmy nadzieję, że proponowana metoda przygotowania próbek otworzy drzwi do potencjalnego zastosowania chemicznego w najbliższej przyszłości. Zacznij od noszenia rękawiczek i dezynfekcji rąk, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki. Sprawdź, czy wewnętrzne opakowanie paska Schirmer jest sterylne, nieprzeterminowane i nienaruszone.
Następnie zegnij górną część paska Schirmera lekko do wewnątrz w znaku zero milimetrów w pobliżu końcówki półkola. Usuń pasek, przytrzymując jego koniec, unikając bezpośredniego kontaktu z obszarem pobierania próbki o średnicy od zera do 25 milimetrów. Poinstruuj fotografowaną osobę, aby odwróciła wzrok, a następnie delikatnie pociągnij dolną powiekę w dół.
Zaczep koniec paska w dolnej złości w pobliżu bocznego obszaru kantu. Po powtórzeniu procesu dla drugiego oka, poproś badanego, aby delikatnie zamknął powieki, aby zminimalizować podrażnienie. Zbieraj płyn łzowy przez około pięć minut, aż do uzyskania próbki łzy o średnicy od 15 do 20 milimetrów.
Poinstruuj osobę, aby otworzyła oczy. Delikatnie pociągnij dolną powiekę w dół i usuń paski. Następnie sprawdź uwodnioną długość na pasku i zapisz zebraną ilość w milimetrach.
Wysusz pasek za pomocą standardowego, czystego grzejnika ramowego, aż płyn odparuje. Po wysuszeniu umieść pasek Schirmera w oznakowanej probówce kriogenicznej i przechowuj go w chłodnym, ciemnym miejscu do dalszej obróbki. Zacznij od przecięcia i wyrzucenia przedniego końca paska Schirmera zawierającego wysuszone ludzkie łzy powyżej znaku zero milimetrów.
Następnie pokrój pasek w jednomilimetrowe odstępy i umieść kawałki w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy do probówki mikrowirówkowej. Wiruj z prędkością 1000 obr./min w temperaturze pokojowej przez godzinę w termomikserze.
Po krótkim odwirowaniu przenieść supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Za pomocą czystych kleszczyków przenieś paski do końcówek do pipet o pojemności 200 mikrolitrów. Umieść końcówki z powrotem w tej samej mikroprobówce wirówkowej, a następnie odwiruj ją, aby uzyskać maksymalny odzysk próbki.
Zmierzyć stężenie białka za pomocą kwasu bicinchoninowego lub kompatybilnego testu białkowego. Zacznij od normalizacji próbek ludzkiego białka łez do 50 mikrogramów białka. Następnie dodać 200 milimolowy ditiotreitol lub DTT do końcowego stężenia 20 milimolowych DTT.
Inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po schłodzeniu roztworu białkowego do temperatury pokojowej dodać 400 milimolowy jodoacetamid do końcowego stężenia 40 milimolowych. Następnie inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Następnie dodaj 12% wodny kwas fosforowy w stosunku jeden do 10, co daje końcowe stężenie 1,2%. Krótko zmieszaj mieszaninę, aby wymieszać roztwór. Dodaj bufor wiążący białko w stosunku jeden do sześciu przed ponownym wirowaniem.
Odkręć zatrzymującą zawiesinę kolumnę MicroSpin i zmontuj kolumnę wirującą na dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej, aby zebrać przepływ. Dodać do 200 mikrolitrów zakwaszonej mieszaniny lizatu białkowego do kolumny. Odwirować kolumnę o stężeniu 4 000 G przez 20 sekund.
Następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu wiążącego białka i odwiruj jak poprzednio, aby przemyć zawieszone białko. Zamontuj mikrokolumnę zatrzymującą zawiesinę na nowej 1.5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. Ostrożnie dodaj 20 mikrolitrów buforu mineralizacyjnego TEAB na filtr wewnątrz kolumny wirowej, unikając pęcherzyków i szczelin powietrznych.
Bezpiecznie przykryj zatrzymującą zawiesinę kolumnę MicroSpin, aby zapobiec parowaniu. Inkubować w temperaturze 47 stopni Celsjusza przez godzinę w termomikserze bez wstrząsania. Peptydy elute za pomocą 40 mikrolitrów 50-milimolowego TEAB.
Następnie odwirować go przy 4 000 G przez 20 sekund. Teraz dodaj 40 mikrolitrów 0,2% kwasu mrówkowego i odwiruj jak poprzednio. Na koniec dodaj 35 mikrolitrów 0,2% kwasu mrówkowego i 50% acetonitrylu przed ponownym odwirowaniem.
Wyciągnąć trzy eluaty i wysuszyć je za pomocą wirówki próżniowej. Po wysuszeniu przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przyszłej analizy. Wyszukiwanie akwizycji zależne od danych dało w sumie 1 183 plus minus 118 białek w grupie wychwytującej zawiesinę i 874 plus minus 70 białek przy 1% FDR w grupie w roztworze.
Analiza ontologii genów ujawniła podobne proteomy dla obu podejść, których główną funkcją jest wiązanie aktywności katalitycznej i regulacja funkcji molekularnych.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę pobierania ludzkich próbek łez za pomocą pasków Schirmera oraz zstandaryzowany proces identyfikacji nieinwazyjnych biomarkerów białek łez. Przygotowanie próbki za pomocą pułapki suspensyjnej poprawia odzyskiwanie peptydów i identyfikację białek za pomocą spektrometrii mas.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Oftalmologia
- Spektrometria mas
- Odkrywanie biomarkerów
Tło
- Ludzka płyn łzowy jest wartościową biopłynem dla nieinwazyjnych testów molekularnych.
- Brakuje zstandaryzowanych metod pobierania i przygotowywania płynu łzowego.
- Niezstandaryzowane metody utrudniają porównywalność badań klinicznych.
- Ten protokół pozwala na przechowywanie próbek łez w temperaturze pokojowej.
Cel badania
- Ustawienie niezawodnej metody pobierania i analizy płynu łzowego.
- Poprawa ekstrakcji peptydów i identyfikacji białek w spektrometrii mas.
- Ułatwienie rozwoju nieinwazyjnych testów molekularnych w środowisku klinicznym.
Zastosowane metody
- Zbieranie próbek łez za pomocą pasków Schirmera.
- Przygotowanie próbek za pomocą metodologii pułapki suspensyjnej (S-Trap).
- Analiza spektrometryczna mas do identyfikacji białek.
- Zstandaryzowane protokoły w celu zminimalizowania błędów i niepewności.
Główne wyniki
- Łącznie zidentyfikowano 1,183 białka za pomocą metody S-Trap.
- 874 białka zidentyfikowano za pomocą standardowych procedur in-solution.
- Analiza ontologii genów wykazała podobne funkcje proteomiczne między metodami.
- Za pomocą nowego protokołu osiągnięto lepsze odzyskiwanie i identyfikację peptydów.
Wnioski
- Metoda S-Trap zapewnia solidne podejście do analizy próbek łez.
- Zstandaryzowanie pobierania płynu łzowego może poprawić wyniki kliniczne.
- Ten protokół może prowadzić do nowych zastosowań w okulistyce.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized, high-yield sample preparation for tear proteomics addresses a critical bottleneck in non-invasive biomarker discovery for ocular diseases. The suspension-trapping (S-Trap) workflow enhances reproducibility and protein identification, supporting translational research and pipeline continuity. This approach enables robust, scalable tear fluid analysis for early-stage biomarker validation and portfolio triage in ophthalmic R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of tear fluid proteomes for disease-relevant biomarker candidates.
- Reduces biological and technical variability, supporting functional target validation.
- Improves predictive confidence in early-stage biomarker selection and prioritization.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible peptide preparations for downstream mass spectrometry workflows.
- Facilitates quantitative, high-throughput protein identification for assay development.
- Supports assay scalability and cross-study comparability through minimized sample preparation error.
Translational & Preclinical Research
- Aligns non-invasive tear sampling with translational biomarker strategies in ophthalmology.
- Enables continuity from clinical sample collection to preclinical validation of candidate biomarkers.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust proteomic data.
Pipeline & Workflow Integration
This S-Trap-based protocol integrates from clinical sample collection through to mass spectrometry-based protein identification, supporting workflows from early discovery to translational research.
- Discovery Biology: Provides standardized, high-yield protein extraction for hypothesis-driven biomarker studies.
- Screening: Ensures reproducible, quantitative peptide outputs for reliable assay development.
- Analytics: Enables robust protein quantification and comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges clinical sample acquisition with preclinical biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a universal, optimized sample preparation platform for tear proteomics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in biomarker discovery.
- Operational Value: Delivers rapid, reproducible, and scalable sample preparation for mass spectrometry.
- Strategic Value: Supports efficient go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in ophthalmic portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of biomarker candidates for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics and mass spectrometry workflows.
- Needs access to S-Trap columns and compatible analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample collection and processing.
- Adaptable to various biofluid sample types with protocol optimization.
- Dependent on rigorous sample handling to minimize contamination and variability.
