Name: Przygotowanie próbki zatrzymującej zawiesinę białek do proteomiki łez metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj metodę S-Trap do przygotowania próbek łez ludzkich zebranych paskami Schirmera w celu analizy proteomicznej metodą spektrometrii mas. Ta standaryzowana technika poprawia odzysk peptydów i identyfikację białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez inicjatywę InnoHK i Rząd Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkongu; Centrum Badawcze SHARP Vision; oraz Centrum Badawcze Innowacji Medycyny Chińskiej (RCMI) na Politechnice w Hongkongu.

Badani wyrazili pisemną świadomą zgodę przed udziałem w badaniu. Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Człowieka Politechniki w Hongkongu i było zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej.
1. Zbieranie ludzkiego płynu łzowego za pomocą paska Schirmera
<ol>
	<li>Załóż rękawice i zdezynfekuj, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.</li>
	<li>Sprawdź, czy opakowanie wewnętrzne jest nienaruszone, sterylne i nie przeterminowane.</li>
	<li>Zegnij górną część paska Schirmera lekko do wewnątrz przy znaku 0 mm, jak wskazano w pobliżu półkola końcówki paska (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Wyjmij pasek z opakowania wewnętrznego, przytrzymując koniec paska i unikaj bezpośredniego kontaktu z obszarem pobierania próbki w odległości od 0 do 25 mm.</li>
	<li>Poproś osobę, aby odwróciła wzrok od miejsca, w którym znajduje się pasek, który ma zostać umieszczony.</li>
	<li>Delikatnie pociągnij dolną powiekę w dół i zaczep koniec paska w dolnej części kości w pobliżu bocznego obszaru kantu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Powtórz tę samą procedurę na drugim oku.</li>
	<li>Poproś osobę badaną, aby delikatnie zamknęła powieki, aby zminimalizować podrażnienie.</li>
	<li>Zbieraj płyn łzowy przez około 5 minut lub najlepiej pobrano próbkę łzy o średnicy 15-20 mm.</li>
	<li>Poproś osobę, aby otworzyła obie oczy, delikatnie pociągnęła dolną powiekę w dół i usunęła paski z obiektu.</li>
	<li>Sprawdź uwodnioną długość na pasku Schirmera i zapisz zebraną ilość w mm.</li>
	<li>Osusz pasek za pomocą standardowego, czystego grzejnika ramowego, aż płyn całkowicie wyschnie. 
	UWAGA: Należy unikać nadmiernego nagrzewania, które mogłoby potencjalnie zwęglić bibułę filtracyjną.</li>
	<li>Włóż każdy wysuszony pasek Schirmera do oznakowanej krioprobówki i przechowuj go najlepiej w chłodnym, suchym miejscu w ciemności do czasu dalszej obróbki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie chemikaliów i odczynników
<ol>
	<li>Bufor do lizy (5% SDS, 50 mM TEAB, pH 7,5), 20 ml
	<ol>
		<li>Odpipetować 1 ml 1 M TEAB i 80 μL 12% kwasu fosforowego. Wirować i krótko sonikować, aby usunąć pęcherzyki. Uzupełnij do 20 ml wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Odważyć 1 g SDS i dodawać do roztworu oscylując, aż do rozpuszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor do wytrącania białek (90% metanolu, 100 mM TEAB, pH 7,1), 10 ml
	<ol>
		<li>Dodać 893 μl 1 M TEAB i 92 μl wody dejonizowanej.</li>
		<li>Dodać 15 μl 85% wag. kwasu fosforowego i 9 ml metanolu do roztworu i krótko przemieszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor wytrawiający (50 mM TEAB), 1 ml
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl 1 M TEAB i uzupełnić do 1 ml wodą dejonizowaną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>200 mM roztwór ditiotreitolu (DTT), 500 μL
	<ol>
		<li>Odważyć 15 mg naziemnej telewizji cyfrowej i rozpuścić w 500 μl wody dejonizowanej; krótko przetrząsnąć. 
		UWAGA: Przygotuj przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>400 mM roztwór jodoacetamidu (IAA), 200 μL
	<ol>
		<li>Odważyć 15 mg IAA i rozpuścić w 200 μl wody dejonizowanej. UWAGA: Przygotuj się przed użyciem i unikaj światła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0,2% kwas mrówkowy, 50% acetonitryl, 10 ml
	<ol>
		<li>Przygotuj 10 ml 50% acetonitrylu w wodzie dejonizowanej.</li>
		<li>Dodać 20 μl kwasu mrówkowego i krótko wirować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0,2% roztwór kwasu mrówkowego, 10 ml
	<ol>
		<li>Dodaj 20 μl kwasu mrówkowego do 10 ml wody dejonizowanej i krótko wiruj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0,1% roztwór kwasu mrówkowego, 10 ml
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl kwasu mrówkowego do 10 ml wody dejonizowanej; krótko odwirować.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ekstrakcja białka w pasie Schirmera
<ol>
	<li>Wytnij i wyrzuć przedni koniec poza oznaczenie 0 mm paska, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenie spowodowane kontaktem tkanek spojówek z czystymi nożyczkami ze stali nierdzewnej.</li>
	<li>Pokrój pasek w odstępach co 1 mm do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu do lizy do probówki mikrowirówki i wirować z prędkością 1 000 obr./min, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w termomikserze.</li>
	<li>Krótko odwirować i przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przenieś paski do końcówek do pipet o pojemności 200 μl za pomocą czystych kleszczyków. Umieścić końcówki w tej samej probówce z kroku 3.4 z uchwytem i odwirować w temperaturze pokojowej 4 000 × g przez 1 minutę dalej, aby uzyskać maksymalny odzysk pozostałej próbki na pasku.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka za pomocą kwasu bicinchoninowego (BCA) lub kompatybilnego testu białkowego.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki do wychwytywania zawiesiny
<ol>
	<li>Normalizować próbki do 50 μg białka na podstawie wyniku testu białka.</li>
	<li>Dodać 200 mM DTT w stosunku 1:10 (v/v, DTT: próbka) do końcowego stężenia 20 mM DTT i inkubować w temperaturze 95 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Schłodzić roztwór białka do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodać 400 mM IAA w stosunku 1:10 (v/v, IAA: próbka) do końcowego stężenia 40 mM IAA i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 12% wodnego roztworu kwasu fosforowego w stosunku 1:10 (v/v, kwas: próbka) do końcowego stężenia 1,2% kwasu fosforowego i krótko przetrząsnąć.</li>
	<li>Dodać bufor wiążący białko w stosunku 1:6 (v/v, próbka: bufor) i krótko wirować. 
	UWAGA: Na tym etapie powinny powstać cząstki białka koloidalnego, a roztwór będzie wyglądał na półprzezroczysty, jeśli ilość białka jest wystarczająca.</li>
	<li>Odkręć mikrokolumnę wirującą zatrzymującą zawieszenie i zmontuj kolumnę wirującą na probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml, aby zebrać przepływ.</li>
	<li>Dodać do kolumny do 200 μl zakwaszonej mieszaniny lizatu białkowego.</li>
	<li>Odwirować kolumnę pod ciśnieniem 4 000 × g przez 20 s. Cząstki białka zostały uwięzione; powtarzać, aż próbki zostaną załadowane do kolumny.</li>
	<li>Dodać 150 μl buforu wiążącego białka i odwirować w ilości 4 000 × g przez 20 s, aby przepłukać zawieszone białko. Powtórz 3 razy.</li>
	<li>Zamontuj mikrokolumnę zatrzymującą zawiesinę na nowej probówce mikrowirówki o pojemności 1.5 ml.</li>
	<li>Dodać 20 μl 50 mM buforu wytrawiającego TEAB zawierającego proteazę w stosunku 1:25 (w/w, trypsyna: białko) do filtra wewnątrz kolumny wirowej, unikając pęcherzyków i szczeliny powietrznej między filtrem a roztworem wytrawiającym.</li>
	<li>Zakryj mikrokolumnę wirującą zatrzymującą zawieszenie, aby zapobiec parowaniu. Inkubować w temperaturze 47 °C przez 1 godzinę w termomikserze; Nie potrząsać ani nie wirować podczas trawienia.</li>
	<li>Elute peptydy za pomocą 40 μl 50 mM TEAB za pomocą siły odśrodkowej przy 4 000 × g przez 20 s.</li>
	<li>Dodać 40 μl 0,2% FA i odwirować w temperaturze 4 000 × g przez 20 s.</li>
	<li>Dodaj 35 μl 0,2% FA, 50% acetonitrylu i odwiruj w 4,000 × g przez 20 s.</li>
	<li>Zebrać trzy eluaty i wysuszyć za pomocą wirówki próżniowej.</li>
	<li>Przechowywać w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy. UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
5. Odtworzenie peptydów do analizy spektrometrii mas
<ol>
	<li>Rozpuść próbkę w 12 μl 0,1% FA, odwiruj i krótko odwiruj.</li>
	<li>Zmierz stężenie peptydów za pomocą zestawu do oznaczania peptydów.</li>
	<li>Normalizuj stężenie peptydów do 0,5 μg/μL w 0,1% FA.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę peptydów do fiolki z automatycznym samplerem i przygotować do analizy metodą spektrometrii mas.</li>
</ol>
6. Pobieranie próbek metodą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas
<ol>
	<li>Załadować 3 μg peptydu izokratycznym buforem ładującym (0,1% FA, 5% ACN) do kolumny-pułapki (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) przy natężeniu przepływu 2 μL/min przez 15 min.</li>
	<li>Frakcjonować peptydy za pomocą nanokolumny analitycznej z odwróconymi fazami (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) przy natężeniu przepływu 350 nL/min w 155-minutowym gradiencie separacji. Stosować ruchomą fazę A składającą się z mieszaniny 0,1% kwasu mrówkowego (v/v), 5% ACN (v/v) w wodzie i ruchomej fazy B zawierającej 0,1% FA (v/v), 98% ACN (v/v) w wodzie. Użyj następującego gradientu: 0-0,5 min: 5% B, 0,5-90 min: 10% B, 90-120 min: 20% B, 120-130 min: 28% B, 130-135 min: 45% B, 135-141 min: 80% B, 141-155 min: 5% B.</li>
	<li>Wykonaj akwizycję zależną od danych (DDA) z zakresem skanowania TOF-MS od 350 do 1800 m/z czasem akumulacji 250 ms i dynamicznym czasem wykluczenia celu wynoszącym 18 s. Następnie należy przeprowadzić skanowanie MS/MS przy prędkości od 100 do 1 800 m/z w trybie wysokiej czułości z czasem akumulacji 50 ms dla 50 najlepszych prekursorów na cykl z progiem 125 cps dla sygnału MS/MS o stanie naładowania od +2 do +4.</li>
	<li>Analizuj surowe dane za pomocą przywołanego oprogramowania lub innych kompatybilnych silników z referencyjną bazą danych w FASTA z publicznie dostępnej bazy danych UniProt database.</li>
</ol>

Non-Invasive Biomarker Discovery for Tear Proteomics Using LC-MS

<ol><li>Ma, J. Y. W., Sze, Y. H., Bian, J. F., Lam, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+mass+spectrometry+proteomics+in+tear+biomarker+discovery+for+multifactorial+ocular+diseases+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Critical role of mass spectrometry proteomics in tear biomarker discovery for multifactorial ocular diseases (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (5), 83(2021).</li>
<li>Tse, J. S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+clinical+data+and+tear+proteomics+to+assess+efficacy%2C+ocular+surface+status%2C+and+biomarker+response+after+orthokeratology+lens+wear%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Integrating clinical data and tear proteomics to assess efficacy, ocular surface status, and biomarker response after orthokeratology lens wear.</a> Translational Vision Science & Technology. 10 (11), 18(2021).</li>
<li>Cheung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tear+proteome+dataset+in+response+to+daily+wear+of+water+gradient+contact+lens+using+SWATH-MS+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Human tear proteome dataset in response to daily wear of water gradient contact lens using SWATH-MS approach.</a> Data in Brief. 36, 107120(2021).</li>
<li>Tse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+on+assessment+of+safety+and+tear+proteome+change+in+response+to+orthokeratology+lens+-+Insight+from+integrating+clinical+data+and+next+generation+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Data on assessment of safety and tear proteome change in response to orthokeratology lens - Insight from integrating clinical data and next generation proteomics.</a> Data in Brief. 29, 105186(2020).</li>
<li>Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+human+tear+fluid+biomarkers+specific+for+ocular+and+systemic+diseases+in+the+context+of+3P+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22The+EPMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3P medicine.</a> The EPMA Journal. 12 (4), 449-475 (2021).</li>
<li>Ponzini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+tear+proteomics+for+noninvasive+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based tear proteomics for noninvasive biomarker discovery.</a> Mass Spectrometry Reviews. 41 (5), 842-860 (2022).</li>
<li>HaileMariam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Trap%2C+an+ultrafast+sample-preparation+approach+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).</li>
<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+proteomics%3A+evaluation+of+different+sample+preparation+workflows+for+quantitative%2C+reproducible%2C+and+improved+depth+of+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Urine proteomics: evaluation of different sample preparation workflows for quantitative, reproducible, and improved depth of analysis.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).</li>
<li>Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+in-solution%2C+FASP%2C+and+S-Trap+based+digestion+methods+for+bottom-up+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).</li>
<li>Sze, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+fractionated+neural+retina+proteome+of+normal+growing+C57BL%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase fractionated neural retina proteome of normal growing C57BL/6 mouse.</a> Scientific Data. 8 (1), 27(2021).</li>
<li>Marchione, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HYPERsol%3A+High-quality+data+from+archival+FFPE+tissue+for+clinical+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">HYPERsol: High-quality data from archival FFPE tissue for clinical proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 19 (2), 973-983 (2020).</li>
<li>Chhuon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+S-Trap-based+approach+to+the+analysis+of+T+cell+lipid+raft+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A sensitive S-Trap-based approach to the analysis of T cell lipid raft proteome.</a> Journal of Lipid Research. 61 (11), 1512-1523 (2020).</li>
<li>Hayoun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+fast+proteotyping+of+microorganisms+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample preparation methods for fast proteotyping of microorganisms by tandem mass spectrometry.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1985(2019).</li>
<li>Templeton, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SPEED%2C+S-Trap%2C+and+in-solution-based+sample+preparation+methods+for+mass+spectrometry+in+kidney+tissue+and+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of SPEED, S-Trap, and in-solution-based sample preparation methods for mass spectrometry in kidney tissue and plasma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6290(2023).</li>
<li>Ding, Z., Wang, N., Ji, N., Chen, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+technologies+for+cancer+liquid+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Proteomics technologies for cancer liquid biopsies.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 53(2022).</li>
<li>Nättinen, J., Aapola, U., Jylhä, A., Vaajanen, A., Uusitalo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+capillary+and+Schirmer+strip+tear+fluid+sampling+methods+using+SWATH-MS+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Comparison of capillary and Schirmer strip tear fluid sampling methods using SWATH-MS proteomics approach.</a> Translational Vision Science & Technology. 9 (3), 16(2020).</li>
<li>Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+biomarkers+in+tear+fluid%3A+from+sampling+to+preanalytical+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing.</a> Scientific Reports. 11 (1), 10064(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Aby uzyskać dokładne wyniki przy użyciu tej metody, we wszystkich procedurach od pobrania próbki łez należy nosić jednorazowe rękawiczki niewymagające zasilania, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki. Ważne jest, aby na każdym etapie unikać pęcherzyków i szczelin powietrznych między filtrem a roztworem próbki, wykorzystując kolumny mikroprzędzące. Jeżeli objętość próbki jest większa niż pojemność kolumn, zaleca się powtórzenie procesu. Protokół ten okazał się bardziej wydajny niż tradycyjny protokół w roztworze pod względem czasu przygotowania, odzysku białka i całkowitej identyfikacji białka. Dzieje się tak głównie dlatego, że próbki poddawane są większości wymaganych procedur na tej samej kolumnie, w przeciwieństwie do metody w roztworze, która obejmuje wiele etapów przenoszenia, takich jak wytrącanie acetonu, trawienie i oczyszczanie (odsalanie), co zwiększa prawdopodobieństwo zmian w uzyskanych danych.
Oprócz próbek łez pobranych metodą mikrokapilarną16,17, ten przepływ pracy FASP z mikrokolumną zatrzymującą zawiesinę zapewnia alternatywną metodę przygotowania próbki, która umożliwia szybkie i solidne przygotowanie próbki łez pobranej za pomocą pasków Schirmera, przy minimalnym przygotowaniu materiału i przyjaznych dla użytkownika krokach do wykonania. Pozwala to na powtarzalne przygotowanie próbki łez do dużych badań kohortowych dotyczących wielu chorób lub schorzeń oczu z lepszym odzyskiwaniem peptydów i identyfikacją białek przez stwardnienie rozsiane w porównaniu z procedurami w roztworze. Ten niezawodny proces może być regularnie wykorzystywany do przygotowywania próbek biomarkerów łez do badań i innych celów klinicznych. Co najważniejsze, wymaga minimalnego przeszkolenia personelu w zakresie pobierania próbek na miejscu i eliminuje potrzebę przechowywania próbek w zamrażarce. Próbki są suszone na miejscu, aby zminimalizować autolizę i degradację białek. W związku z tym umożliwia to wygodną wysyłkę pocztą, co ułatwia dalszą analizę, w przeciwieństwie do stosowania rurek mikrokapilarnych.

Proteomika łez została potraktowana jako przedmiot do zbadania potencjalnych biomarkerów chorób i schorzeń oczu1,2,3,4,5,6, aby uzyskać dostęp do patogenezy stanu okulistycznego i ogólnoustrojowego, a także wykorzystać zalety nieinwazyjnego pobierania próbek łez za pomocą Paski Schirmera. Postęp technologiczny spektrometrii mas nowej generacji umożliwił kwantyfikację białek w mikrolitrowych łzach z dokładnością i precyzją, które nie były możliwe w przeszłości. Metody przygotowania próbek nie są jeszcze znormalizowane. Solidny i ustandaryzowany proces przygotowania próbek ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia zastosowania klinicznego w badaniach nad biomarkerami białka łzowego. Proces przygotowania próbek do wychwytywania zawiesiny (S-Trap) został niedawno opisany jako skuteczna i czuła metoda przygotowania próbki do szerokiej analizy proteomicznej7,8. Jednak strategia ta nie została dobrze opisana w analizie ludzkiego proteomu łez, przewyższała przygotowanie próbki wspomagane filtrem (FASP) i trawienie w roztworze pod względem wydajności trawienia enzymatycznego i większej liczby identyfikacji białek za pomocą analizy spektrometrii mas9. Podejście oparte na S-Trap zostało zademonstrowane w przygotowaniu tkanki siatkówki 10, tkanki utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie (FFPE)11, cells12, microorganism13, oraz biopsji płynnej14,15.
Ten protokół opisuje zintegrowany ilościowy przepływ pracy od próbek klinicznych do enzymatycznie trawionego białka w celu odkrycia nieinwazyjnego panelu biomarkerów białka łez z szybką, powtarzalną i solidną strategią techniczną. Krótko mówiąc, płyn łzowy pobrano za pomocą standardowego paska Schirmera i natychmiast wysuszono za pomocą oftalmicznej grzałki ramowej, aby zapobiec autolizie białek w temperaturze pokojowej. Osadzone białka całkowite wyekstrahowano przy użyciu 5% buforu do lizy dodecylosiarczanu sodu (SDS) zgodnie z sugestią producenta, a następnie dokonano pomiaru białka. Wyekstrahowany lizat poddano następnie standardowej redukcji za pomocą ditiotreitolu (DTT) i alkilacji jodoacetamidem (IAA).
Po zakwaszeniu kwasem fosforowym, do białek zbiorczych dodano bufor wytrącający białko z kolumny zatrzymującej zawiesinę, zawierający 90% metanolu i 100 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB). Próbka została następnie przeniesiona do nowej mikrokolumny zatrzymującej zawiesinę. Trawienie enzymatyczne z trypsyną do sekwencjonowania w proporcji 1:25 (w/w, trypsyna: białko) w temperaturze 47 °C przez 1 godzinę. Powstałe peptydy zostały następnie eluowane przez wirowanie, sekwencyjnie z 50 mM TEAB, 0,2% wodnym kwasem mrówkowym (FA) i 50% acetonitrylem (ACN) zawierającym 0,2% FA. Wymyte peptydy suszono próżniowo i rozpuszczono w 0,1% FA. Stężenie peptydu zmierzono i dostosowano do 0,5 μg/μl do analizy spektrometrii mas.

<table><tbody><tr><td>Fiolki z plastikowym gwintem 9 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4000-11</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, LCMS Grade</td><td>Anaqua</td><td>AC-1026</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka MiniSpin plus</td><td>Eppendorf</td><td>5453000097</td><td></td></tr><tr><td>DL-ditiotreitol (DTT), BioUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy, odczynnik ACS, &ge; 96%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td></td></tr><tr><td>Grzejnik ramowy OPTIMONSUN Electronic</td><td>Breitfeld & Schliekert GmbH</td><td>1203166</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA), BioUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, HPLC Grade</td><td>Anaqua</td><td>MA-1292</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Biobankowanie i probówki kriogeniczne do hodowli komórkowych, 2 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosforowy, 85% wag. w H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>345245</td><td></td></tr><tr><td>Ilościowy kolorymetryczny test peptydowy Pierce</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA Pierce Rapid Gold</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A53225</td><td></td></tr><tr><td>Kwadrupolowa spektrometria mas czasu przelotu</td><td>Sciex</td><td>TripleTOF 6600</td><td></td></tr><tr><td>Paski okulistyczne Schirmer</td><td>Entod Research Cell UK Ltd</td><td>DEW Tearstrips</td><td></td></tr><tr><td>S-Trap Micro Kolumna</td><td>Protifi</td><td>C02-micro-80</td><td></td></tr><tr><td>SureSTART 9 mm Zakrętki</td><td>Thermo Scientific</td><td>CHSC9-40</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan trietyloamonu (TEAB), 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18597</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sprawna chromatografia cieczowa</td><td>Eksigent</td><td>NanoLC 400&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysty dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15525017</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki zatrzymującej zawiesinę białek do proteomiki łez metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Płyn łzowy jest jednym z łatwo dostępnych płynów biologicznych, które można zbierać bezinwazyjnie. Proteomika łez ma potencjał do odkrycia biomarkerów dla wielu chorób i schorzeń oczu. Stwierdzono, że kolumna wychwytująca zawiesinę jest wydajnym i przyjaznym dla użytkownika procesem przygotowywania próbek do szerokiego zastosowania dalszej analizy proteomicznej. Jednak strategia ta nie została dobrze zbadana w analizie ludzkiego proteomu łez. Niniejszy protokół opisuje zintegrowany przepływ pracy od klinicznych próbek ludzkich łez do oczyszczonych peptydów do nieinwazyjnych badań biomarkerów białka łzy przy użyciu spektrometrii mas, która zapewnia wgląd w biomarkery choroby i monitorowanie w połączeniu z analizą bioinformatyczną. Zastosowano preparat próbki wychwytującej zawiesinę białkową, co zademonstrowało odkrycie proteomu łez za pomocą szybkich, powtarzalnych i przyjaznych dla użytkownika procedur, jako uniwersalnego, zoptymalizowanego preparatu próbki do analizy ludzkiego płynu łzowego. W szczególności procedura wychwytywania zawiesiny przewyższyła przygotowanie próbki w roztworze pod względem odzysku peptydów, identyfikacji białek i krótszego czasu przygotowania próbki.

Niniejszy protokół umożliwia pobieranie próbek łez za pomocą pasków Schirmera, które są przechowywane w stanie suchym w temperaturze pokojowej przed późniejszym przygotowaniem próbek do analizy spektrometrią mas. Przepływ pracy w ramach przygotowania próbek wspomaganego filtrowaniem (FASP) z zastosowaniem mikrokolumny do pułapkowania zawiesiny umożliwił szybkie przygotowanie próbek w ciągu kilku godzin, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych procedur trawienia w roztworze, które trwają dni i wymagają inkubacji przez noc. Odzysk peptydów był znacznie wyższy (p &lt; 0,001) niż w standardowym protokole trawienia w roztworze, przy dobrej powtarzalności z współczynnikiem zmienności (%CV) &lt; 7%. Próbka połączona z łez była analizowana w sześciu powtórzeniach technicznych, uzyskując 74,2 ± 5,0% odzysku peptydów, w porównaniu do 52,8 ± 1,6% odzysku peptydów w próbkach przygotowanych procedurami w roztworze. Połączoną próbkę łez o zawartości białka 36,3 µg naniesiono na pasek Schirmera i wyekstrahowano zgodnie z wcześniejszym opisem; wydajność ekstrakcji białka wyniosła 81% (29,5 ± 6,8 µg, średnia ± SD).
W obu schematach analizy na MS naniesiono 3 µg peptydów, a przeszukiwanie DDA pozwoliło zidentyfikować łącznie 1 183 ± 118 białek (5 757 ± 537 unikalnych peptydów) w grupie z wychwytywaniem w zawiesinie oraz 874 ± 70 białek (4 400 ± 328 peptydów) w grupie z trawieniem w roztworze, przy FDR na poziomie 1%. Analiza ontologii genów (GO) z wykorzystaniem systemu klasyfikacji PANTHER wykazała bardzo podobne proteomy dla obu podejść, przy czym głównymi funkcjami molekularnymi były wiązanie, aktywność katalityczna oraz regulacja funkcji molekularnych (Rysunek 4).
<img alt="Proces pomiaru objętości w cylindrze miernym, oznaczenie poziomu cieczy, eksperyment laboratoryjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zegnij górną część paska Schirmera na oznaczeniu 0 mm przed aplikacją. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Pomiar płynu łzowego, eksperyment okulistyczny z użyciem paska Schirmera do diagnozy zespołu suchego oka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Położenie paska Schirmera podczas pobierania łez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat paska do pomiaru łez, wskazujący strefy odrzutu dla testu Schirmera w badaniach okulistycznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Ilustracja sposobu obchodzenia się z paskiem Schirmera przed ekstrakcją białek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy kołowe ontologii genów porównujące rozkład aktywności w grupach z trawieniem w roztworze i w zawiesinie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wykres kołowy ilustrujący analizę ontologii genów dla proteomów zidentyfikowanych przy użyciu procedury w roztworze oraz procedury z trawieniem w zawiesinie, z wykorzystaniem systemu klasyfikacji PANTHER. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje metodę pobierania próbek łez za pomocą pasków Schirmera oraz zintegrowany ilościowy przepływ pracy do odkrywania nieinwazyjnych biomarkerów białka łez. Proces przygotowania próbki do wychwytywania zawiesiny umożliwia szybkie i niezawodne przygotowanie próbki do rozdarcia oraz analizę spektrometryczną mas, co skutkuje wyższą wydajnością odzyskiwania peptydów i identyfikacją białek niż standardowe procedury w roztworze.

Przygotowanie próbki zatrzymującej zawiesinę białek do proteomiki łez metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...

Nasze badania mają na celu zademonstrowanie zastosowania preparatu próbki wychwytującej zawiesinę białkową, znanego jako S-Trap, do badań opartych na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje szybkie, powtarzalne i ustandaryzowane przygotowanie próbki ludzkiego płynu łzowego, pobranej za pomocą paska Schirmera do badań translacyjnych w okulistyce. Ludzki płyn łzowy to płyn biologiczny, który można pobrać do nieinwazyjnych, indywidualnych badań molekularnych w okulistyce.Brakuje ustandaryzowanych metod pobierania płynu łzowego i przygotowywania próbek, które mają kluczowe znaczenie dla udanych badań klinicznych nad chorobami i stanami. Metody niestandaryzowane są trudne do porównania i interpretacji między metodologiami, a tym samym wpływają na wyniki kliniczne. Protokół ten umożliwia pobieranie próbek biopłynu łzowego i przechowywanie go w temperaturze pokojowej.Pomaga to w łatwiejszym pobieraniu próbek i wysyłce. Zapewnia szybką i solidną ekstrakcję peptydów do analizy spektrometrii mas, co poprawia odzyskiwanie peptydów i identyfikację. Protokół ten obejmuje minimalne etapy przygotowania próbki, aby zminimalizować błędy i niepewności.Szybka i doskonała wydajność identyfikacji i kwantyfikacji białek za pomocą spektrometrii mas ułatwi klinicystom i badaczom opracowywanie nieinwazyjnych testów molekularnych. Zoptymalizowane przygotowanie próbki zawsze będzie jednym z krytycznych etapów, niezależnie od metody wykrywania. Wartość kliniczna ludzkiego płynu łzowego nie została jeszcze w pełni zbadana.Miejmy nadzieję, że proponowana metoda przygotowania próbek otworzy drzwi do potencjalnego zastosowania chemicznego w najbliższej przyszłości. Zacznij od noszenia rękawiczek i dezynfekcji rąk, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki. Sprawdź, czy wewnętrzne opakowanie paska Schirmer jest sterylne, nieprzeterminowane i nienaruszone.Następnie zegnij górną część paska Schirmera lekko do wewnątrz w znaku zero milimetrów w pobliżu końcówki półkola. Usuń pasek, przytrzymując jego koniec, unikając bezpośredniego kontaktu z obszarem pobierania próbki o średnicy od zera do 25 milimetrów. Poinstruuj fotografowaną osobę, aby odwróciła wzrok, a następnie delikatnie pociągnij dolną powiekę w dół.Zaczep koniec paska w dolnej złości w pobliżu bocznego obszaru kantu. Po powtórzeniu procesu dla drugiego oka, poproś badanego, aby delikatnie zamknął powieki, aby zminimalizować podrażnienie. Zbieraj płyn łzowy przez około pięć minut, aż do uzyskania próbki łzy o średnicy od 15 do 20 milimetrów.Poinstruuj osobę, aby otworzyła oczy. Delikatnie pociągnij dolną powiekę w dół i usuń paski. Następnie sprawdź uwodnioną długość na pasku i zapisz zebraną ilość w milimetrach.Wysusz pasek za pomocą standardowego, czystego grzejnika ramowego, aż płyn odparuje. Po wysuszeniu umieść pasek Schirmera w oznakowanej probówce kriogenicznej i przechowuj go w chłodnym, ciemnym miejscu do dalszej obróbki. Zacznij od przecięcia i wyrzucenia przedniego końca paska Schirmera zawierającego wysuszone ludzkie łzy powyżej znaku zero milimetrów.Następnie pokrój pasek w jednomilimetrowe odstępy i umieść kawałki w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy do probówki mikrowirówkowej. Wiruj z prędkością 1000 obr./min w temperaturze pokojowej przez godzinę w termomikserze.Po krótkim odwirowaniu przenieść supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Za pomocą czystych kleszczyków przenieś paski do końcówek do pipet o pojemności 200 mikrolitrów. Umieść końcówki z powrotem w tej samej mikroprobówce wirówkowej, a następnie odwiruj ją, aby uzyskać maksymalny odzysk próbki.Zmierzyć stężenie białka za pomocą kwasu bicinchoninowego lub kompatybilnego testu białkowego. Zacznij od normalizacji próbek ludzkiego białka łez do 50 mikrogramów białka. Następnie dodać 200 milimolowy ditiotreitol lub DTT do końcowego stężenia 20 milimolowych DTT.Inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po schłodzeniu roztworu białkowego do temperatury pokojowej dodać 400 milimolowy jodoacetamid do końcowego stężenia 40 milimolowych. Następnie inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie dodaj 12% wodny kwas fosforowy w stosunku jeden do 10, co daje końcowe stężenie 1,2%. Krótko zmieszaj mieszaninę, aby wymieszać roztwór. Dodaj bufor wiążący białko w stosunku jeden do sześciu przed ponownym wirowaniem.Odkręć zatrzymującą zawiesinę kolumnę MicroSpin i zmontuj kolumnę wirującą na dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej, aby zebrać przepływ. Dodać do 200 mikrolitrów zakwaszonej mieszaniny lizatu białkowego do kolumny. Odwirować kolumnę o stężeniu 4 000 G przez 20 sekund.Następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu wiążącego białka i odwiruj jak poprzednio, aby przemyć zawieszone białko. Zamontuj mikrokolumnę zatrzymującą zawiesinę na nowej 1.5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. Ostrożnie dodaj 20 mikrolitrów buforu mineralizacyjnego TEAB na filtr wewnątrz kolumny wirowej, unikając pęcherzyków i szczelin powietrznych.Bezpiecznie przykryj zatrzymującą zawiesinę kolumnę MicroSpin, aby zapobiec parowaniu. Inkubować w temperaturze 47 stopni Celsjusza przez godzinę w termomikserze bez wstrząsania. Peptydy elute za pomocą 40 mikrolitrów 50-milimolowego TEAB.Następnie odwirować go przy 4 000 G przez 20 sekund. Teraz dodaj 40 mikrolitrów 0,2% kwasu mrówkowego i odwiruj jak poprzednio. Na koniec dodaj 35 mikrolitrów 0,2% kwasu mrówkowego i 50% acetonitrylu przed ponownym odwirowaniem.Wyciągnąć trzy eluaty i wysuszyć je za pomocą wirówki próżniowej. Po wysuszeniu przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przyszłej analizy. Wyszukiwanie akwizycji zależne od danych dało w sumie 1 183 plus minus 118 białek w grupie wychwytującej zawiesinę i 874 plus minus 70 białek przy 1% FDR w grupie w roztworze.Analiza ontologii genów ujawniła podobne proteomy dla obu podejść, których główną funkcją jest wiązanie aktywności katalitycznej i regulacja funkcji molekularnych.

a-protein-suspension-trapping-sample-preparation-for-tear-proteomics

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Cyfrowa mikroprzepływność to technika polegająca na manipulowaniu pojedynczymi kroplami (~nL - mL) na macierzy elektrod poprzez przykładanie pól elektrycznych. Jest ona odpowiednia do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Poziom reaktywnych form tlenu wzrasta, gdy komórki znajdują się w warunkach stresowych. Przedstawiamy tutaj przykład barwienia 3',3'-diaminobenzydyną oraz znakowania cysTMT i spektrometrii mas w celu profilowania proteomu redoks w liściach pomidora traktowanych Pseudomonas syringae.

Profilowanie proteomu redoks grup tiolowych z wykorzystaniem spektrometrii mas z tagowaniem izotopowym

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Ten protokół służy do ekstrakcji i koncentracji białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej zebranej z wody morskiej, a następnie do generowania peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas.

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Charakterystyka proteomu łożysk mikronaczyniowych oka jest kluczowa dla dogłębnego zrozumienia wielu patologii oczu u ludzi. Badanie to demonstruje skuteczną, szybką i solidną metodę ekstrakcji białek i przygotowania próbek z małych naczyń krwionośnych, wykorzystującą krótkie tylne tętnice rzęskowe świń jako naczynia modelowe do analiz proteomicznych opartych na spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do analizy proteomicznej mikronaczyń oka w oparciu o spektrometrię mas

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Prezentujemy zoptymalizowany protokół etykietowania tandemowego znacznika masy (TMT), który zawiera szczegółowe informacje dla każdego z następujących etapów: ekstrakcja białka, kwantyfikacja, wytrącanie, trawienie, etykietowanie, przesyłanie do ośrodka proteomicznego i analiza danych.

Przygotowanie próbki TMT do przedłożenia przez placówkę proteomiczną i późniejszej analizy danych

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Poznaj metodę S-Trap do przygotowania próbek łez ludzkich zebranych paskami Schirmera w celu analizy proteomicznej metodą spektrometrii mas. Ta standaryzowana technika poprawia odzysk peptydów i identyfikację białek.

Przygotowanie próbki zatrzymującej zawiesinę białek do proteomiki łez metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie próbki zatrzymującej zawiesinę białek do proteomiki łez metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów