Przygotowanie próbki zatrzymującej zawiesinę białek do proteomiki łez metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas
1 grudnia 2023
Ten protokół opisuje metodę pobierania próbek łez za pomocą pasków Schirmera oraz zintegrowany ilościowy przepływ pracy do odkrywania nieinwazyjnych biomarkerów białka łez. Proces przygotowania próbki do wychwytywania zawiesiny umożliwia szybkie i niezawodne przygotowanie próbki do rozdarcia oraz analizę spektrometryczną mas, co skutkuje wyższą wydajnością odzyskiwania peptydów i identyfikacją białek niż standardowe procedury w roztworze.
Nasze badania mają na celu zademonstrowanie zastosowania preparatu próbki wychwytującej zawiesinę białkową, znanego jako S-Trap, do badań opartych na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje szybkie, powtarzalne i ustandaryzowane przygotowanie próbki ludzkiego płynu łzowego, pobranej za pomocą paska Schirmera do badań translacyjnych w okulistyce. Ludzki płyn łzowy to płyn biologiczny, który można pobrać do nieinwazyjnych, indywidualnych badań molekularnych w okulistyce.
Brakuje ustandaryzowanych metod pobierania płynu łzowego i przygotowywania próbek, które mają kluczowe znaczenie dla udanych badań klinicznych nad chorobami i stanami. Metody niestandaryzowane są trudne do porównania i interpretacji między metodologiami, a tym samym wpływają na wyniki kliniczne. Protokół ten umożliwia pobieranie próbek biopłynu łzowego i przechowywanie go w temperaturze pokojowej.
Pomaga to w łatwiejszym pobieraniu próbek i wysyłce. Zapewnia szybką i solidną ekstrakcję peptydów do analizy spektrometrii mas, co poprawia odzyskiwanie peptydów i identyfikację. Protokół ten obejmuje minimalne etapy przygotowania próbki, aby zminimalizować błędy i niepewności.
Szybka i doskonała wydajność identyfikacji i kwantyfikacji białek za pomocą spektrometrii mas ułatwi klinicystom i badaczom opracowywanie nieinwazyjnych testów molekularnych. Zoptymalizowane przygotowanie próbki zawsze będzie jednym z krytycznych etapów, niezależnie od metody wykrywania. Wartość kliniczna ludzkiego płynu łzowego nie została jeszcze w pełni zbadana.
Miejmy nadzieję, że proponowana metoda przygotowania próbek otworzy drzwi do potencjalnego zastosowania chemicznego w najbliższej przyszłości. Zacznij od noszenia rękawiczek i dezynfekcji rąk, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki. Sprawdź, czy wewnętrzne opakowanie paska Schirmer jest sterylne, nieprzeterminowane i nienaruszone.
Następnie zegnij górną część paska Schirmera lekko do wewnątrz w znaku zero milimetrów w pobliżu końcówki półkola. Usuń pasek, przytrzymując jego koniec, unikając bezpośredniego kontaktu z obszarem pobierania próbki o średnicy od zera do 25 milimetrów. Poinstruuj fotografowaną osobę, aby odwróciła wzrok, a następnie delikatnie pociągnij dolną powiekę w dół.
Zaczep koniec paska w dolnej złości w pobliżu bocznego obszaru kantu. Po powtórzeniu procesu dla drugiego oka, poproś badanego, aby delikatnie zamknął powieki, aby zminimalizować podrażnienie. Zbieraj płyn łzowy przez około pięć minut, aż do uzyskania próbki łzy o średnicy od 15 do 20 milimetrów.
Poinstruuj osobę, aby otworzyła oczy. Delikatnie pociągnij dolną powiekę w dół i usuń paski. Następnie sprawdź uwodnioną długość na pasku i zapisz zebraną ilość w milimetrach.
Wysusz pasek za pomocą standardowego, czystego grzejnika ramowego, aż płyn odparuje. Po wysuszeniu umieść pasek Schirmera w oznakowanej probówce kriogenicznej i przechowuj go w chłodnym, ciemnym miejscu do dalszej obróbki. Zacznij od przecięcia i wyrzucenia przedniego końca paska Schirmera zawierającego wysuszone ludzkie łzy powyżej znaku zero milimetrów.
Następnie pokrój pasek w jednomilimetrowe odstępy i umieść kawałki w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy do probówki mikrowirówkowej. Wiruj z prędkością 1000 obr./min w temperaturze pokojowej przez godzinę w termomikserze.
Po krótkim odwirowaniu przenieść supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Za pomocą czystych kleszczyków przenieś paski do końcówek do pipet o pojemności 200 mikrolitrów. Umieść końcówki z powrotem w tej samej mikroprobówce wirówkowej, a następnie odwiruj ją, aby uzyskać maksymalny odzysk próbki.
Zmierzyć stężenie białka za pomocą kwasu bicinchoninowego lub kompatybilnego testu białkowego. Zacznij od normalizacji próbek ludzkiego białka łez do 50 mikrogramów białka. Następnie dodać 200 milimolowy ditiotreitol lub DTT do końcowego stężenia 20 milimolowych DTT.
Inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po schłodzeniu roztworu białkowego do temperatury pokojowej dodać 400 milimolowy jodoacetamid do końcowego stężenia 40 milimolowych. Następnie inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Następnie dodaj 12% wodny kwas fosforowy w stosunku jeden do 10, co daje końcowe stężenie 1,2%. Krótko zmieszaj mieszaninę, aby wymieszać roztwór. Dodaj bufor wiążący białko w stosunku jeden do sześciu przed ponownym wirowaniem.
Odkręć zatrzymującą zawiesinę kolumnę MicroSpin i zmontuj kolumnę wirującą na dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej, aby zebrać przepływ. Dodać do 200 mikrolitrów zakwaszonej mieszaniny lizatu białkowego do kolumny. Odwirować kolumnę o stężeniu 4 000 G przez 20 sekund.
Następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu wiążącego białka i odwiruj jak poprzednio, aby przemyć zawieszone białko. Zamontuj mikrokolumnę zatrzymującą zawiesinę na nowej 1.5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. Ostrożnie dodaj 20 mikrolitrów buforu mineralizacyjnego TEAB na filtr wewnątrz kolumny wirowej, unikając pęcherzyków i szczelin powietrznych.
Bezpiecznie przykryj zatrzymującą zawiesinę kolumnę MicroSpin, aby zapobiec parowaniu. Inkubować w temperaturze 47 stopni Celsjusza przez godzinę w termomikserze bez wstrząsania. Peptydy elute za pomocą 40 mikrolitrów 50-milimolowego TEAB.
Następnie odwirować go przy 4 000 G przez 20 sekund. Teraz dodaj 40 mikrolitrów 0,2% kwasu mrówkowego i odwiruj jak poprzednio. Na koniec dodaj 35 mikrolitrów 0,2% kwasu mrówkowego i 50% acetonitrylu przed ponownym odwirowaniem.
Wyciągnąć trzy eluaty i wysuszyć je za pomocą wirówki próżniowej. Po wysuszeniu przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przyszłej analizy. Wyszukiwanie akwizycji zależne od danych dało w sumie 1 183 plus minus 118 białek w grupie wychwytującej zawiesinę i 874 plus minus 70 białek przy 1% FDR w grupie w roztworze.
Analiza ontologii genów ujawniła podobne proteomy dla obu podejść, których główną funkcją jest wiązanie aktywności katalitycznej i regulacja funkcji molekularnych.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę pobierania próbek łez ludzkich przy użyciu pasków Schirmera oraz zestandaryzowany schemat postępowania w celu identyfikacji nieinwazyjnych biomarkerów białkowych w łzach. Przygotowanie próbek z wykorzystaniem pułapkowania w zawiesinie (suspension trapping) zwiększa odzyskiwanie peptydów i identyfikację białek za pomocą spektrometrii mas.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Okulistyka
- Spektrometria mas
- Odkrywanie biomarkerów
Wprowadzenie
- Ludzka łza jest cennym płynem biologicznym do nieinwazyjnych testów molekularnych.
- Brakuje ustandaryzowanych metod pobierania i przygotowania łez.
- Brak standaryzacji metod utrudnia porównywalność badań klinicznych.
- Niniejszy protokół umożliwia przechowywanie próbek łez w temperaturze pokojowej.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody pobierania i analizy łez.
- Udoskonalenie ekstrakcji peptydów i identyfikacji białek w spektrometrii mas.
- Ułatwienie opracowania nieinwazyjnych testów molekularnych w warunkach klinicznych.
Zastosowane metody
- Pobieranie próbek łez przy użyciu pasków Schirmera.
- Przygotowanie próbek z zastosowaniem metodologii pułapkowania w zawiesinie (S-Trap).
- Analiza spektrometrią mas w celu identyfikacji białek.
- Znormalizowane protokoły w celu zminimalizowania błędów i niepewności.
Główne wyniki
- Za pomocą metody S-Trap zidentyfikowano łącznie 1 183 białka.
- Przy użyciu standardowych procedur w roztworze zidentyfikowano 874 białka.
- Analiza ontologii genów wykazała podobne funkcje proteomiczne dla obu metod.
- Zastosowanie nowego protokołu pozwoliło na zwiększenie odzysku i identyfikacji peptydów.
Wnioski
- Metoda S-Trap zapewnia niezawodne podejście do analizy próbek łez.
- Standaryzacja pobierania filmu łzowego może poprawić wyniki kliniczne.
- Niniejszy protokół może prowadzić do nowych zastosowań w okulistyce.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustandaryzowane, wysokowydajne przygotowanie próbek do proteomiki łez rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w nieinwazyjnym odkrywaniu biomarkerów chorób oczu. Procedura oparta na metodzie S-Trap (suspension-trapping) zwiększa powtarzalność oraz identyfikację białek, wspierając badania translacyjne i ciągłość procesu analitycznego. Podejście to umożliwia solidną i skalowalną analizę płynu łzowego w celu walidacji biomarkerów we wczesnych etapach oraz selekcji projektów w badaniach i rozwoju (R&D) w dziedzinie okulistyki.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną analizę proteomów łez w celu poszukiwania kandydatów na biomarkery istotne w przebiegu chorób.
- Zmniejsza zmienność biologiczną i techniczną, wspierając walidację funkcjonalną celów.
- Zwiększa pewność predykcyjną w procesie selekcji i priorytetyzacji biomarkerów na wczesnym etapie.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne preparaty peptydowe do dalszych etapów analizy spektrometrią mas.
- Umożliwia ilościową, wysokoprzepustową identyfikację białek na potrzeby opracowywania testów.
- Wspiera skalowalność testów oraz porównywalność między badaniami dzięki zminimalizowaniu błędów podczas przygotowania próbek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie nieinwazyjnego pobierania próbek łez do translacyjnych strategii poszukiwania biomarkerów w okulistyce.
- Zapewnia ciągłość procesu od klinicznego pobierania próbek po przedkliniczną walidację kandydatów na biomarkery.
- Wspiera decyzje dotyczące dalszego rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez dostarczanie wiarygodnych danych proteomicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół oparty na metodzie S-Trap integruje procesy od pobierania próbek klinicznych po identyfikację białek za pomocą spektrometrii mas, wspierając przepływy pracy od wczesnego etapu odkryć po badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia standaryzowaną, wysokowydajną ekstrakcję białek do badań nad biomarkerami opartych na hipotezach.
- Screening: Gwarantuje powtarzalne, ilościowe wyniki pozyskiwania peptydów w celu wiarygodnego opracowania testów.
- Analityka: Umożliwia rzetelną kwantyfikację białek i analizę porównawczą w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy pozyskiwanie próbek klinicznych z przedkliniczną walidacją biomarkerów.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy uniwersalną, zoptymalizowaną platformę przygotowania próbek do proteomiki łez.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w odkrywaniu biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybkie, powtarzalne i skalowalne przygotowanie próbek do spektrometrii mas.
- Wartość strategiczna: Wspiera efektywne podejmowanie decyzji go/no-go i zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach w portfolio okulistycznym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na biomarkery z uwzględnieniem ryzyka w celu ich dalszego rozwoju.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie proteomiki i procedur spektrometrii mas.
- Wymaga dostępu do kolumn S-Trap oraz kompatybilnej aparatury analitycznej.
- Wymaga standaryzacji pobierania i przetwarzania próbek pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych typów próbek biofluidów poprzez optymalizację protokołu.
- Zależność od rygorystycznego obchodzenia się z próbkami w celu zminimalizowania kontaminacji i zmienności.
