Name: Opracowanie i charakterystyka modeli ksenoprzeszczepów anaplastycznego raka tarczycy oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi pochodzących od pacjentów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj metodę tworzenia modeli ksenoprzeszczepów PDX dla anaplastycznego raka tarczycy oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Technika ta umożliwia badanie heterogeniczności nowotworowej i testowanie leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Wsparcia Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (Grant nr 2019JDRC0019 i 2021ZYD0097), projekt 1.3.5 dla dyscyplin doskonałości, Szpital Zachodniochiński, Uniwersytet Sichuan (Grant No. ZYJC18026), projekt 1.3.5 dla dyscyplin doskonałości – Projekt Inkubacji Badań Klinicznych, Szpital Zachodniochiński, Uniwersytet Syczuański (grant nr 2020HXFH023), Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (SCU2022D025), Projekt Współpracy Międzynarodowej Biura Nauki i Technologii w Chengdu (Grant nr 2022-GH02-00023-HZ), Projekt Innovation Spark Uniwersytetu Sichuan (Grant nr 2019SCUH0015) oraz Fundusz Szkolenia Talentów na rzecz Integracji Inżynierii Medycznej Zachodu Szpital Chiński - Uniwersytet Nauk i Technologii Elektronicznych (grant nr HXDZ22012).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i protokołami Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Zachodniochińskiego, Uniwersytet Syczuański. Do niniejszego badania wykorzystano myszy z niedoborem odporności NOD-SCID w wieku 4-6 tygodni (obu płci) oraz samice nagich myszy Balb/c w wieku 4-6 tygodni. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Komisja bioetyczna Szpitala Zachodniochińskiego zatwierdziła badanie z udziałem ludzi (numer protokołu 2020353). Każdy pacjent wyraził pisemną świadomą zgodę.
1. Przygotowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Ułóż jednorazowe ostrza, wysterylizowane nożyczki i pęsety oraz inne narzędzia potrzebne do przeszczepu guza, umieść je na ultraczystym stole warsztatowym i wcześniej naświetl je światłem ultrafioletowym.</li>
	<li>Przygotuj sterylną sól fizjologiczną i szalki Petriego do użycia podczas badania.</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie i transport świeżej tkanki nowotworowej
<ol>
	<li>Pobrać świeże próbki guza (zwykle o wymiarach większych niż 5 mm x 5 mm) z sali operacyjnej i umieścić je w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml lub 50 ml zawierającej sterylny roztwór HTK (patrz tabela materiałów) lub sól fizjologiczną. Oznacz probówki wirówkowe 
	UWAGA: Świeże próbki guza uzyskano przez chirurgiczne usunięcie lub nakłucie od pacjentów z ATC lub HNSCC.</li>
	<li>Umieść probówki wirówkowe w przygotowanym wcześniej pojemniku na lód. 
	UWAGA: W tym czasie operator przeszczepu musi przygotować niezbędne elementy do przeszczepienia (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Upewnij się, że czas między pobraniem próbki a transportem do laboratorium w celu budowy PDX nie przekracza 2 godzin. Podczas transportu należy otoczyć probówki zawierające tkanki mieszaniną lodu i wody lub okładami z lodu, aby zachować aktywność tkanek.</li>
</ol>
3. Przeszczep guza
<ol>
	<li>Gdy tkanki nowotworowe dotrą do laboratorium, zapisz je i ponumeruj ponownie. 
	UWAGA: W przypadku niniejszego badania informacje o pacjencie były utrzymywane w ścisłej tajemnicy. Pozostałe etapy procedury zostały wykonane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Przy wejściu do laboratorium zaleca się założenie fartucha na ubranie robocze lub ochronne, nakrycie głowy i maskę. Leczenie tkanki nowotworowej odbywa się w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Zdezynfekuj probówki wirówkowe zawierające tkanki nowotworowe 75% alkoholem i umieść je na stole operacyjnym. Przenieś tkanki nowotworowe na 6-centymetrowe szalki Petriego wypełnione solą fizjologiczną za pomocą wysterylizowanych kleszczy okulistycznych. Następnie pokrój je na małe kawałki o wymiarach około 2 mm x 2 mm i 3 mm x 3 mm za pomocą ostrza.</li>
	<li>Przenieś kawałki tkanek nowotworowych na 6-centymetrową szalkę Petriego zawierającą odpowiednią ilość soli fizjologicznej, owiń naczynie folią uszczelniającą, umieść je w pojemniku na lód i przenieś do pomieszczenia dla zwierząt wolnego od patogenów (SPF) wraz z niezbędnymi narzędziami (nożyczkami, kleszczami i igłami do zaszczepiania).</li>
	<li>Przygotuj zwierzę, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Usuń włosy z prawej bocznej części klatki piersiowej 4-6 tygodniowej samicy lub samca myszy z niedoborem odporności NOD-SCID i zdezynfekuj skórę 75% alkoholem. Znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 80 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny (patrz Tabela materiałów) i posmarować oczy maścią weterynaryjną, aby zapobiec wysuszeniu. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez utratę odruchu pedałowania.</li>
		<li>Wykonaj 2 mm nacięcie nożyczkami przez skórę pośrodku prawej bocznej klatki piersiowej myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Weź kawałek guza z szalki Petriego i umieść go w igle trokarowej 2,4 mm x 2,0 mm (patrz Tabela materiałów) za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Przytrzymaj mysz, napnij skórę w miejscu nakłucia, użyj trokaru zawierającego kawałki guza, aby wprowadzić guz przez początkowe 2 mm nacięcie skóry, przejdź do tylnej części barku i popchnij rdzeń trokaru.</li>
	<li>Upewnij się, że część guza została wypchnięta i pozostała w zatoce przejściowej utworzonej przez nakłucie trokaru, a następnie wyciągnij trokar.</li>
	<li>Jeśli guz porusza się wraz z igłą po jej wycofaniu, użyj trokara, aby go zresetować i zszyć nacięcie. 
	UWAGA: W tym badaniu każda mysz została zaszczepiona na grzbietowych kończynach przednich i tylnych. Od jednej do trzech myszy inokulowano na próbkę guza od każdego pacjenta w zależności od wielkości guza.</li>
</ol>
4. Zachowanie, utrwalanie i zamrażanie białek w tkance nowotworowej
UWAGA: Pozostałe tkanki nowotworowe zostały użyte odpowiednio do konserwacji nasion, utrwalania i zamrażania DNA/RNA/białka.
<ol>
	<li>Usuń sól fizjologiczną z powierzchni guza za pomocą sterylnej gazy przed umieszczeniem jej w probówce do krioprezerwacji, aby upewnić się, że powierzchnia guza nie jest nadmiernie mokra.</li>
	<li>Umieścić od czterech do sześciu kawałków tkanki nowotworowej o wymiarach 2 mm x 2 mm w probówce do kriokonserwacji komórek o pojemności 2 ml, dodać 1 ml roztworu do kriokonserwacji składającego się z 90% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10% sulfotlenku dimetylu (DMSO) do probówki, umieścić probówkę w gradientowym pudełku chłodzącym, zamrozić w temperaturze -80 °C przez noc, i na koniec przenieś go do ciekłego azotu.</li>
	<li>Umieść bloki tkanki nowotworowej o wymiarach 3 mm x 3 mm w 10% buforowanej formalinie w celu utrwalenia tkanki do badania patologicznego.</li>
	<li>Umieść blok tkanki o wymiarach 3 mm x 3 mm w probówce do krioprezerwacji komórek o pojemności 2 ml, szybko zamroź go w ciekłym azocie, a następnie przenieś do lodówki o temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji DNA/RNA i białka.</li>
	<li>Zbierz informacje kliniczne o pacjentach, takie jak historia palenia, wielkość guza, różnicowanie, podtyp patologiczny, stopień zaawansowania nowotworu, stadium raka, odległe przerzuty, pochodzenie, historia medyczna, immunohistochemia, zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) u pacjentów z HNSCC i leki lecznicze.</li>
</ol>
5. Pasażowanie, kriokonserwacja i resuscytacja guzów modelu PDX
<ol>
	<li>Zmierz długość i szerokość guzów podskórnych u myszy za pomocą suwmiarki z noniuszem raz w tygodniu i oblicz objętość guza zgodnie ze wzorem: objętość guza = 0,5 × długość × szerokość2. Narysuj krzywą wzrostu guza.</li>
	<li>Gdy guz PDX osiągnie 2,000 mm3, należy go przekazać następnemu pokoleniu myszy i przeprowadzić ponowny przeszczep guza. Wykonaj przygotowanie instrumentów zgodnie z krokiem 4.</li>
	<li>Poddać myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po znieczuleniu 80 mg/kg ketaminy.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę 75% alkoholem. Następnie przetnij skórę otaczającą guz za pomocą nożyczek, a następnie usuń guz za pomocą kleszczy i umieść go na szalce Petriego. </li>
	<li>Wykonaj procedurę przeszczepu guza zgodnie z krokiem 3.</li>
	<li>Wykonaj konserwację i kriokonserwację guzów modelu PDX, postępując zgodnie z krokiem 4.</li>
	<li>W celu resuscytacji tkanki nowotworowej należy postępować zgodnie z zasadą powolnego zamrażania i szybkiego rozpuszczania. Po wyjęciu kriowiali z ciekłego azotu należy je szybko umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu szybkiego rozpuszczenia.</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij kriowialiami w łaźni wodnej, aby przyspieszyć proces rozmrażania.</li>
	<li>Rozmrozić, przenieść kawałki guza do przygotowanej normalnej soli fizjologicznej do mycia, a następnie zaszczepić następne pokolenie myszy. Aby zapoznać się z konkretną operacją, zapoznaj się z procedurą przeszczepu tkanek w kroku 3.</li>
</ol>
6. Określanie skuteczności terapeutycznej lenwatynibu i cisplatyny w modelu ATC PDX
UWAGA: Model ATC PDX został użyty do przetestowania terapeutycznego efektu inhibitora kinazy tyrozynowej lenwatynibu i leku chemioterapeutycznego cisplatyny25,26,27.
<ol>
	<li>Wybierz tkankę nowotworową generacji P5 modelu ATC PDX (THY-017), pokrój na 2-4 mm3 kawałki tkanki i zaszczepij podskórnie (krok 3) po prawej stronie pleców dziesięciu 4-6 tygodniowych samic nagich myszy Balb/c.</li>
	<li>Wybierz 15 myszy o objętości guza od 50 do 150 mm3 i podziel je na trzy grupy.</li>
	<li>Lenwatynib (10 mg/kg mc.) podawać dożołądkowo jednej grupie raz na dobę przez 15 dni, cisplatynę (3 mg/kg mc.) dootrzewnowo jednej grupie co 3 dni, w sumie sześć dawek, a grupie kontrolnej podawać tę samą objętość soli fizjologicznej.</li>
	<li>Mierz masę ciała i objętość guza myszy dwa razy w tygodniu.</li>
	<li>Pod koniec testu poddaj myszy eutanazji (krok 5.3) i zważ guzy.</li>
</ol>

Nie ujawnia się żadnych potencjalnych konfliktów interesów.

W ramach tego badania udało się ustalić podskórne modele PDX ATC i HNSCC. Jest wiele aspektów, na które należy zwrócić uwagę podczas procesu budowy modelu PDX. Po oddzieleniu tkanki nowotworowej od pacjenta należy ją umieścić w pojemniku na lód i jak najszybciej wysłać do laboratorium w celu zaszczepienia. Po tym, jak guz dotrze do laboratorium, operator musi zwrócić uwagę na utrzymanie sterylnego pola i ćwiczyć procedury aseptyczne. W przypadku próbek z biopsji igłowej, ponieważ tkanka nowotworowa jest szczególnie mała,...

Model PDX to model zwierzęcy, w którym ludzka tkanka nowotworowa jest przeszczepiana myszom z niedoborem odporności i rośnie w środowisku dostarczonym przez myszy1. Tradycyjne modele linii komórkowych nowotworów mają kilka wad, takich jak brak heterogeniczności, niezdolność do utrzymania mikrośrodowiska guza, podatność na wariacje genetyczne podczas powtarzających się pasaży in vitro oraz słabe zastosowanie kliniczne2,3. Głównymi wadami genetycznie modyfikowanych modeli zwierzęcych są potencjalna utrata cech genomowych ludzkich nowotworów, wprowadzenie nowych, nieznanych mutacji oraz trudność w określeniu stopnia homologii między nowotworami myszy a ludzkimi4. Ponadto przygotowanie genetycznie modyfikowanych modeli zwierzęcych jest kosztowne, czasochłonne i stosunkowo mało efektywne4.
Model PDX ma wiele zalet w porównaniu z innymi modelami nowotworów pod względem odzwierciedlania heterogeniczności guza. Z punktu widzenia histopatologii, mimo że mysi odpowiednik z czasem zastępuje zrąb człowieka, model PDX dobrze zachowuje strukturę morfologiczną guza pierwotnego. Ponadto model PDX zachowuje metabolomiczną tożsamość guza pierwotnego przez co najmniej cztery pokolenia i lepiej odzwierciedla złożone wzajemne relacje między komórkami nowotworowymi a ich mikrośrodowiskiem, co czyni go wyjątkowym w symulacji wzrostu, przerzutów, angiogenezy i immunosupresji ludzkiej tkanki nowotworowej5,6,7. Na poziomie komórkowym i molekularnym model PDX dokładnie odzwierciedla niejednorodność ludzkich nowotworów między i wewnątrz guza, a także fenotypowe i molekularne cechy pierwotnego nowotworu, w tym wzorce ekspresji genów, status mutacji, liczbę kopii oraz metylację DNA i proteomikę8,9. Modele PDX z różnymi pasażami mają taką samą czułość na terapię lekową, co wskazuje, że ekspresja genów w modelach PDX jest wysoce stabilna10,11. Badania wykazały doskonałą korelację między reakcją modelu PDX na lek a klinicznymi odpowiedziami pacjentów na ten lek12,13. W związku z tym model PDX stał się potężnym przedklinicznym i translacyjnym modelem badawczym, szczególnie w zakresie badań przesiewowych leków i przewidywania rokowań klinicznych.
Rak tarczycy jest powszechnym nowotworem złośliwym układu hormonalnego i jest nowotworem złośliwym człowieka, którego częstość występowania gwałtownie wzrosła w ostatnich latach14. Rak anaplastyczny tarczycy (ATC) jest najbardziej złośliwym nowotworem tarczycy, z medianą przeżycia pacjenta wynoszącą zaledwie 4,8 miesiąca15. Chociaż każdego roku w Chinach diagnozuje się ATC u zaledwie mniejszości pacjentów z rakiem tarczycy, śmiertelność jest bliska 100%16,17,18. ATC zwykle rośnie szybko i atakuje sąsiednie tkanki szyi, a także węzły chłonne szyjne, a około połowa pacjentów ma odległe przerzuty19,20. Rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) jest szóstym najczęstszym nowotworem na świecie i jedną z głównych przyczyn zgonów z powodu raka, szacuje się, że każdego roku na HNSCC cierpi około 600 000 osób21,22,23. HNSCC obejmuje dużą liczbę nowotworów, w tym nowotwory nosa, zatok, jamy ustnej, migdałków, gardła i krtani24. ATC i HNSCC to dwa główne nowotwory złośliwe głowy i szyi. Aby ułatwić opracowywanie nowych środków terapeutycznych i spersonalizowanych metod leczenia, konieczne jest opracowanie solidnych i zaawansowanych przedklinicznych modeli zwierzęcych, takich jak modele PDX ATC i HNSCC.
Ten artykuł przedstawia szczegółowe metody ustalania podskórnego modelu PDX ATC i HNSCC, analizuje kluczowe czynniki wpływające na tempo wchłaniania guza w konstrukcji modelu i porównuje charakterystyki histopatologiczne między modelem PDX a guzem pierwotnym. Tymczasem w niniejszej pracy przeprowadzono testy farmakodynamiczne in vivo przy użyciu pomyślnie skonstruowanych modeli PDX w celu potwierdzenia ich przydatności klinicznej.

<table><tbody><tr><td>Trokar 2,4 mm x 2,0 mm</td><td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td><td>18-9065</td><td></td></tr><tr><td>Nagie myszy Balb/c</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td>401</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Suzhou Antai</td><td>BSC-1300IIA2</td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td><td>18-0823</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430791/430829</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do kriokonserwacji</td><td>Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK-Solution</td><td>Custodiol</td><td>2103417</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl suloxide (DMSO)</td> <td>SIGMA-ALORICH</td><td>D5879-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczna</td><td></td> suwmiarka <td></td> cyfrowa METTLER ME104 <td></td></tr><tr><td></td><td>Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd</td><td>0-220</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca(FBS)</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td></td></tr><tr><td>Statystyki IBM SPSS 26</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd&nbsp;</td><td></td><td></td>100761663</tr><tr><td>Lenvatinib</td><td>ApexBio</td><td>A2174</td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID myszy z niedoborem odporności</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td>406</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep Solution</td><td>Biological Industries</td><td>03-03101BCS</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>WHB</td><td>WHB-60/WHB-100</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna&nbsp;</td><td>Sichuan Kelun</td><td>W220051705</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td><td>18-0110</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td><td>18-1241</td><td></td></tr><tr><td>Maść weterynaryjna</td><td>Pfizer Inc.</td><td></td><td></td>P10015353</tr><tr><td>Xylazine</td><td>Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd</td><td>070031777</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie i charakterystyka modeli ksenoprzeszczepów anaplastycznego raka tarczycy oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi pochodzących od pacjentów

Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) wiernie zachowują histologiczne i genetyczne cechy guza pierwotnego i utrzymują jego heterogeniczność. Wyniki farmakodynamiczne oparte na modelach PDX są silnie skorelowane z praktyką kliniczną. Rak anaplastyczny tarczycy (ATC) jest najbardziej złośliwym podtypem raka tarczycy, charakteryzującym się silną inwazyjnością, złym rokowaniem i ograniczonym leczeniem. Chociaż częstość występowania ATC stanowi tylko 2%-5% raka tarczycy, jego śmiertelność wynosi aż 15%-50%. Rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) jest jednym z najczęstszych nowotworów złośliwych głowy i szyi, z ponad 600 000 nowych przypadków na całym świecie każdego roku. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowe protokoły w celu ustalenia modeli PDX ATC i HNSCC. W niniejszej pracy przeanalizowano kluczowe czynniki wpływające na skuteczność budowy modelu oraz porównano cechy histopatologiczne pomiędzy modelem PDX a guzem pierwotnym. Ponadto potwierdzono znaczenie kliniczne modelu poprzez ocenę skuteczności terapeutycznej in vivo reprezentatywnych leków stosowanych klinicznie w pomyślnie skonstruowanych modelach PDX.

Przeszczepiono łącznie 18 próbek raka tarczycy, z czego pomyślnie opracowano pięć modeli PDX raka tarczycy (wskaźnik przyjęcia guza wyniósł 27,8%), w tym cztery przypadki niedróżnicowanych raków tarczycy i jeden przypadek raka anaplastycznego tarczycy. Przeanalizowano korelację między skutecznością tworzenia modeli a wiekiem, płcią, średnicą guza, stopniem złośliwości guza oraz stopniem zróżnicowania. Choć skuteczność tworzenia modeli dla próbek guza stopnia 4 była wyższa niż dla próbek o niższych stopniach, a skutecznoś...

Obecny protokół ustanawia i charakteryzuje model ksenoprzeszczepu (PDX) anaplastycznego raka tarczycy (ATC) oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) pochodzącego od pacjenta, ponieważ modele PDX szybko stają się standardem w dziedzinie onkologii translacyjnej.

Opracowanie i charakterystyka modeli ksenoprzeszczepów anaplastycznego raka tarczycy oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi pochodzących od pacjentów

Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully preserve the histological and genetic characteristics of the primary tumor and maintain its ...

Protokół ten pomaga w ustaleniu modeli ATC i HNSCC PDX, które lepiej odzwierciedlają niejednorodność guza, różnorodność molekularną i przewidują wyniki kliniczne. Technika jest prosta w obsłudze, ma wysoki wskaźnik sukcesu i może być również odpowiednia dla innych modeli PDX. Technika ta może być rozszerzona w kierunku badań przesiewowych wrażliwości na leki przeciwnowotworowe, aby kierować spersonalizowanym leczeniem pacjenta z rakiem.Osoba, która nigdy nie wykonywała tej techniki, może napotkać pewne trudności i zaleca się zwrócenie uwagi na każdy szczegół schematu. Po pobraniu próbek guza ATC i HNSCC w 50-milimetrowej probówce wirówkowej zawierającej sterylny roztwór HTK, należy je zdezynfekować 75% alkoholem. Użyj wysterylizowanych kleszczy okulistycznych, aby przenieść tkankę nowotworową na sześciocentymetrową szalkę Petriego wypełnioną solą fizjologiczną i pokrój je na małe kawałki za pomocą ostrza.Następnie przenieś kawałki na nową, sześciocentymetrową szalkę Petriego zawierającą sól fizjologiczną i owiń ją folią uszczelniającą. Umieść zawinięte naczynie w pojemniku na lód, zanieś je do wolnego od patogenów pomieszczenia dla zwierząt za pomocą nożyczek, kleszczy i igieł do zaszczepiania. Po znieczuleniu myszy usuń włosy z prawej bocznej części klatki piersiowej i zdezynfekuj obszar 75% alkoholem.Użyj nożyczek, aby wykonać dwumilimetrowe nacięcie na środku prawej bocznej klatki piersiowej. Za pomocą kleszczy weź tkankę z szalki Petriego i umieść ją w igle trokarowej. Przytrzymaj mysz i napnij skórę w miejscu nakłucia.Włóż trokar z kawałkiem guza do nacięcia do przestrzeni podskórnej, a następnie przejdź do tylnej części barku i popchnij rdzeń trokaru. Aby zarezerwować pozostałą tkankę za pomocą sterylnej gazy, usuń sól fizjologiczną z powierzchni guza, upewniając się, że nie jest nadmiernie mokra. Umieść od czterech do sześciu kawałków tkanki w dwumililitrowej probówce do krioprezerwacji komórek i dodaj jeden mililitr roztworu do krioprezerwacji do probówki.Następnie umieść rurkę w gradientowym pudełku chłodzącym i zamroź ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Na koniec przenieś go do ciekłego azotu. Do resuscytacji guzów modelu PDX należy raz w tygodniu używać suwmiarki do pomiaru długości i szerokości guza podskórnego.Oblicz objętość guza i narysuj krzywą wzrostu guza. Następnie za pomocą nożyczek przeciąć uświęconą skórę myszy otaczającą guz. Usuń guz za pomocą kleszczy i umieść go na szalce Petriego.Przeszczep guza należy wykonać do piątego pokolenia myszy, jak wykazano wcześniej. Wybierz tkankę nowotworową myszy ATC PDX generacji P5. Pokrój na dwa do czterech milimetrowych kawałków.Zaszczepij te kawałki podskórnie, jak pokazano wcześniej, po prawej stronie nagiej samicy myszy BALB/c w wieku od czterech do sześciu tygodni. Kiedy guz rośnie od 50 do 150 milimetrów sześciennych, podziel myszy na trzy grupy. Po podaniu lenwatynibu, cisplatyny i grupy kontrolnej dwa razy w tygodniu, zmierz masę ciała myszy.Zmierz również objętość guza. Analiza korelacji wykazała, że wskaźnik sukcesu konstrukcji modelu ATC PDX nie był zależny od wieku, płci, średnicy guza, stopnia zaawansowania guza i zróżnicowania. Wskaźnik wchłaniania guza w konstrukcji modelu HNSCC PDX wykazał, że stopień zróżnicowania był związany ze wskaźnikiem sukcesu modelu, podczas gdy inne parametry nie wpływały na wskaźnik wchłaniania guza.Krzywe wzrostu guza dla każdego modelu PDX zilustrowały, że próbki ATC były stabilnie przekazywane do pokolenia P3, podczas gdy dwa przypadki próbek HNSCC nie utworzyły guzów po przejściu do pokolenia P1. Tempo wzrostu guza generacji P0 dla większości modeli PDX było stosunkowo wolniejsze niż dla późniejszych pasaży, prawdopodobnie ze względu na adaptację mikrośrodowiska myszy. W badaniu histopatologicznym wykazano, że guzy PDX zachowują cechy morfologiczne guzów pierwotnych.Leczenie lenwatynibem istotnie hamowało wzrost guza i wykazało mniejszą masę guza w modelu ATC PDX w porównaniu z grupą kontrolną. Ponadto myszy leczone lenwatynibem nie wykazywały zauważalnych zmian w swojej całkowitej masie ciała. Nadmierne dawkowanie cisplatyny powodowało znaczną toksyczność, o czym świadczyła utrata masy ciała, a nawet śmierć.Świeże guzy należy kilkakrotnie przemyć zwykłą solą fizjologiczną przed pokrojeniem na kawałki. Mieszanie próbek guza z biopsji i zaszczepianie ich prawdopodobnie spowoduje powstanie guza. Model ten może być używany do badań biologicznych nowotworów, badań przesiewowych leków, terapii spersonalizowanej.

establishment-characterization-patient-derived-xenograft-models

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Generacja ortotopowego mysiego modelu anaplastycznego raka tarczycy jest opisana tutaj. Technika ta polega na chirurgicznym umieszczaniu ludzkich komórek anaplastycznego raka tarczycy w tarczycy myszy z niedoborem odporności, tworząc w ten sposób bardziej istotne klinicznie warunki do badania postępu choroby, a także do badań przesiewowych innowacyjnych interwencji terapeutycznych.

Ortotopowy mysi model anaplastycznego raka tarczycy

Wykorzystanie guzów pochodzących od pacjentów w podskórnym modelu przedklinicznym to doskonały sposób na badanie skuteczności nowych terapii, predykcyjnego odkrywania biomarkerów i ścieżek oporności na leki. Model ten, w procesie opracowywania leków, ma zasadnicze znaczenie dla określenia losu wielu nowatorskich terapii przeciwnowotworowych przed rozpoczęciem badań klinicznych.

Opracowanie i utrzymanie przedklinicznego modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pochodzącego od pacjenta w celu zbadania nowych terapii przeciwnowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Obecny protokół opisuje metody tworzenia modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) i pierwotnych linii komórek rakowych z próbek chirurgicznego raka żołądka. Metody te stanowią użyteczne narzędzie do opracowywania leków i badań w zakresie biologii nowotworów.

Opracowanie modeli ksenoprzeszczepów i pierwszorzędowych linii komórkowych pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka

Modele PDX z przerzutami do ośrodkowego układu nerwowego reprezentują fenotypowe i molekularne cechy ludzkich przerzutów, co czyni je doskonałymi modelami do badań przedklinicznych. Poniżej opisano, jak ustalić modele PDX i drogi inokulacji, które najlepiej wykorzystać w badaniach przedklinicznych.

Opracowanie i wykorzystanie modeli ksenoprzeszczepów do ośrodkowego układu nerwowego pochodzących od pacjentów

Tutaj prezentujemy standardowy potok do uzyskiwania mysich guzów ATC za pomocą spontanicznych genetycznie modyfikowanych modeli myszy. Ponadto przedstawiamy dynamikę guza i informacje patologiczne o zmianach pierwotnych i przerzutowych. Model ten pomoże naukowcom zrozumieć proces powstawania nowotworów i ułatwi odkrywanie leków.

Samoistny mysi model anaplastycznego raka tarczycy

Obecny protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) przy użyciu ludzkiej tkanki kostniakomięsaka.

Opracowanie mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z tkankami ludzkiego kostniakomięsaka

To badanie przedstawia ortotopowy model niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) oparty na wewnątrzpłucnej inokulacji wielokomórkowych sferoid fluorescencyjnych komórek A549-iRFP. Model podsumowuje kliniczne stadia niedrobnokomórkowego raka płuca i reaguje na cisplatynę, zgodnie z dynamicznym monitorowaniem in vivo fluorescencji na długich falach.

Budowa ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu niedrobnokomórkowego raka płuca naśladującego postęp choroby i predykcję działania leków

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Ten protokół opisuje skuteczną, niechirurgiczną metodę ortotopowego wszczepiania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi u myszy. Technika ta polega na enzymatycznej dysocjacji guza, a następnie bezpośrednim wstrzyknięciu do poduszek tłuszczowych sutka, co umożliwia implantację o wysokiej przepustowości. Kompleksowa walidacja zapewnia wierność modelu, ułatwiając rygorystyczne badania nad różnymi podtypami raka piersi.

Wysokoprzepustowa dysocjacja i ortotopowa implantacja ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi

Poznaj metodę tworzenia modeli ksenoprzeszczepów PDX dla anaplastycznego raka tarczycy oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Technika ta umożliwia badanie heterogeniczności nowotworowej i testowanie leków.

Opracowanie i charakterystyka modeli ksenoprzeszczepów anaplastycznego raka tarczycy oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi pochodzących od pacjentów (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie i charakterystyka modeli ksenoprzeszczepów anaplastycznego raka tarczycy oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi pochodzących od pacjentów

Przeglądaj więcej filmów