Name: Ortotopowa implantacja komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta u myszy podsumowuje zaawansowanego raka jelita grubego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj ortotopową implantację komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta u myszy immunodeficyjnych. Ten model odwzorowuje zaawansowanego raka jelita grubego z przerzutami do płuc i wątroby, umożliwiając ocenę nowych leków terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Fundacji Cellex, sieci CIBERONC i Instituto de Salud Carlos III za ich wsparcie. Ponadto dziękujemy również platformie obrazowania przedklinicznego w Instytucie Badawczym Vall d'Hebron (VHIR), gdzie przeprowadzono eksperymenty.

Uzyskano pisemną zgodę od wszystkich pacjentów. Projekt został zatwierdzony przez Komisję ds. Etyki Badań Naukowych Szpitala Uniwersyteckiego Vall d'Hebron w Barcelonie, Hiszpania (ID zatwierdzenia: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Próbki ludzkiej tkanki okrężnicy składały się z biopsji z niemartwiczych obszarów pierwotnego gruczolakoraka lub przerzutów do wątroby, odpowiadających pacjentom z rakiem okrężnicy i odbytnicy, którzy przeszli resekcję guza. Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą Unii Europejskiej w sprawie opieki nad zwierzętami (86/609/EWG) i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną ds. Doświadczeń na Zwierzętach VHIR-Instytutu Badawczego Vall d'Hebron (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA i 12/18 CEEA).
UWAGA: Kobieta NOD-SCID (NOD. Myszy CB17-Prkdcscid/NcrCrl) w wieku od 8 tygodni zakupiono w Charles River Laboratories.
1. Wyprowadzanie komórek pacjenta
<ol>
	<li>Ekstrakcja guza 
	UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana w komorze biologicznej w temperaturze pokojowej (RT) w pomieszczeniu dla zwierząt.
	<ol>
		<li>Uzyskaj próbki guza z operacji lub biopsji pacjentów oraz z PDX rosnących podskórnie u myszy.</li>
		<li>Do iniekcji ortotopowej należy przygotować komórki nowotworowe z ustalonych podskórnych modeli guzów PDX, a nie z tkanki uzyskanej bezpośrednio od pacjentów9.</li>
		<li>Wygeneruj guzy PDX, zaszczepiając zawiesinę 1 x 105 komórek nowotworowych w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (50 μL) zmieszanej z matrycą Matrigel (50 μL) podskórnie w boku myszy NOD-SCID2.
		<ol>
			<li>Mierz wzrost guza za pomocą suwmiarki co drugi dzień. 
			UWAGA: Co ważne, nasze laboratorium wygenerowało biobank ponad 350 modeli PDX. Modele guza CRC-PDX użyte w protokole są ustalonymi modelami PDX w laboratorium, które zostały amplifikowane więcej niż trzy pasaże u myszy i przeszły kryteria włączenia / wykluczenia z wynikiem pozytywnym (Tabela 1).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Poddać myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, gdy guzy podskórne osiągną maksymalny rozmiar ustalony przez CEEA (1 cm średnicy) lub gdy zwierzęta osiągną kryteria punktu końcowego.</li>
		<li>Wyodrębnij guz i ostrożnie usuń go ze skóry i otaczającej tkanki nienowotworowej za pomocą nożyczek i kleszczy.</li>
		<li>Zebrane guzy należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do następnego kroku. 
		UWAGA: Dysocjuj guzy w zawiesinie komórek tak szybko, jak to możliwe po usunięciu z ich pierwotnej lokalizacji w zmianach chorobowych pacjentów lub ksenoprzeszczepach podskórnych u myszy. Żywotność komórek jest znacznie zmniejszona 24 godziny po usunięciu tkanki, co skutkuje nieefektywną implantacją u myszy biorców.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek 
	UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana w komorze biologicznej w temperaturze pokojowej (RT) w pomieszczeniu do hodowli tkankowych.
	<ol>
		<li>Oddziel guzy za pomocą ostrza w 10-centymetrowej płytce hodowlanej z 1 ml kompletnej pożywki CoCSCM 6Ab (Tabela 2) (aby ułatwić mielenie). Umieścić jednorodną, zdysocjowaną próbkę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodać pełną pożywkę CoCSCM 6Ab do końcowej objętości 5 ml (nie użyć więcej niż 3 ml zdysocjowanej próbki w tej samej probówce). 
		UWAGA: Pierwotne raki jelita grubego wycięte od pacjentów są naturalnie zanieczyszczone bakteriami i grzybami. Konieczne jest usunięcie patogenów obecnych w oryginalnej próbce pacjenta za pomocą koktajlu sześciu antybiotyków (penicyliny, streptomycyny, fungizonu, kanamycyny, gentamycyny i nystatyny). Wstrzyknięcie komórek nowotworowych skażonych bakteriami u myszy z niedoborem odporności może spowodować śmierć zwierzęcia.</li>
		<li>Inkubować z 50 μl DNazy I (0,08 kU/ml) i 50 μl kolagenazy (1,5 mg/ml) (pożywka wytrawiająca; Tabela 2) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych, w pozycji 45°. Roztwór dobrze mieszać co 15 minut pipetą o pojemności 5 ml przed inkubacją. 
		UWAGA: Odciąć tkankę nowotworową i strawić ją, pipetując kilka razy, aby uzyskać roztwór jednokomórkowy. Jest to niezbędne do zliczenia komórek przed wstrzyknięciem myszom biorcy, a tym samym do uzyskania jednorodnej implantacji komórek nowotworowych.</li>
		<li>Dodać 5 ml kompletnej pożywki CoCSCM 6Ab i dobrze wymieszać pipetą o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Sortuj roztwór za pomocą sitka do komórek 100 μm za pomocą nowej sterylnej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wirować posortowane komórki w masie 500 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w 3 ml 1x roztworu buforowego do lizy RBC.</li>
		<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 3 ml kompletnej pożywki CoCSCM 6Ab, odpipetować próbkę i wirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad w 5-10 ml kompletnej pożywki CoCSCM 6Ab i użyć licznika komórek, aby obliczyć całkowitą liczbę komórek.</li>
		<li>Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zamieszać w 10 ml PBS.</li>
		<li>Zawiesić osad do uzyskania stężenia 20 x 106 komórek/ml i dobrze wymieszać, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.</li>
		<li>Przygotować strzykawki 29 G (igła 0,5 ml U 100, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) do wstrzyknięcia jelita ślepego w hodowli tkankowej (jedna strzykawka/mysz). Załadować 50 μl zawiesiny komórek nowotworowych (1 x 106 komórek/wstrzyknięcie) do strzykawki i trzymać ją na lodzie. Upewnij się, że pęcherzyki powietrza zostały usunięte z zawiesiny ogniwa. 
		UWAGA: Eliminacja pęcherzyków powietrza, gdy komórki nowotworowe są ładowane do strzykawki, jest niezbędna, aby uniknąć wstrzyknięcia nadmiernej objętości w ścianę jelita ślepego, co może spowodować pęknięcie tkanki i utratę próbki. Konieczne jest dokładne wymieszanie zawiesiny komórkowej podczas ładowania strzykawki, aby uniknąć nierównej wielkości guza wśród myszy w tym samym eksperymencie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Iniekcja ortotopowa w jelicie ślepym
UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana na stole w pomieszczeniu wolnym od określonych patogenów (SPF) w obiekcie dla zwierząt. Używany sprzęt jest wcześniej czyszczony i sterylizowany. Ponadto jest ponownie sterylizowany w przenośnym sterylizatorze między osobami lub strefami w obiekcie dla zwierząt.
<ol>
	<li>Oczyść pole operowane, spryskując je detergentem dezynfekującym i wycierając.</li>
	<li>Zdepiluj brzuch myszy za pomocą maszyny do usuwania włosów myszy.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej. Użyj 2% izofluranu do znieczulenia zwierzęcia. Potwierdź efekt znieczulenia, delikatnie szczypiąc kończynę i obserwując brak stymulacji.</li>
	<li>Umieść 50-100 μl kropli maści weterynaryjnej (3 mg/g Lacryvisc) w oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Zdezynfekuj brzuch myszy, kilkakrotnie szorując chlorheksydyną lub jodonem powidonu okrężnymi ruchami.</li>
	<li>Wykonaj 1 cm podłużne nacięcie nad dolną częścią brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych. Ostrożnie oddziel skórę od każdego miejsca, aby przedstawić otrzewną, która znajduje się pod skórą.</li>
	<li>Wykonaj 0,5-1 cm nacięcie w błonie otrzewnej, wystarczająco duże, aby zewnętrznie wydzielić jelito ślepe. 
	UWAGA: Zewnętrzizować jelito ślepe bez nadmiernego manipulowania narządami wewnętrznymi, co może znacznie zwiększyć śmiertelność zabiegu.</li>
	<li>Ostrożnie odizoluj jelito ślepe od myszy za pomocą wstępnie przyciętej, sterylnej gazy.</li>
	<li>Zwilżaj jelito ślepe roztworem soli fizjologicznej przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Unieruchomij jelito ślepe, ostrożnie chwytając je kleszczami, a igłę wprowadź powierzchownie do ściany jelita ślepego. Należy unikać naczyń włosowatych i naczynkowych w miejscu wstrzyknięcia. Usunąć pęcherzyki z zawiesiny komórek.</li>
	<li>Powoli wstrzyknij całe 50 μl zawiesiny komórek nowotworowych. Podanie trwa zwykle około 10 sekund. Należy unikać perforacji światła jelita ślepego igłą, ponieważ powoduje to eliminację zawiesiny komórek nowotworowych z organizmu poprzez perystaltykę jelit. 
	UWAGA: Wstrzyknięcie zawiesiny komórek nowotworowych do jelita ślepego myszy jest najtrudniejszym etapem całej procedury. W tej części protokołu należy użyć jasnego światła skupionego na miejscu wstrzyknięcia oraz lupy powiększającej. Wprowadzić igłę równolegle do powierzchni jelita ślepego. Jelito ślepe jest bardzo delikatną tkanką; Dlatego unieruchomienie jelita ślepego powinno być wykonywane za pomocą kleszczy chirurgicznych i poprzez delikatny nacisk, aby uniknąć pęknięcia tkanki skutkującego krwotokiem. Udana implantacja skutkuje powstawaniem białego pęcherzyka (osadu komórek) w ścianie jelita ślepego. Jeśli pęcherzyka nie można uwidocznić, może to oznaczać, że jelito ślepe zostało perforowane, a komórki zakończyły się w świetle jelita ślepego, co spowodowało ich usunięcie przez przewód pokarmowy.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy powoli wyjąć igłę z jelita ślepego i delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia aplikatorem z bawełnianą końcówką, aby uniknąć ucieczki komórek nowotworowych i zmniejszyć niewielkie krwawienie.</li>
	<li>Oczyść jelito ślepe roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.</li>
	<li>Zwróć jelito ślepe z powrotem do brzucha zwierzęcia.</li>
	<li>Zamknij otrzewną za pomocą szwów 5/0.</li>
	<li>Zamknij skórę brzucha za pomocą szwów 5/0.</li>
	<li>Pooperacyjne antybiotyki (100 mg/kg amoksycyliny lub 20 mg/kg enrofloksacyny) i leki przeciwbólowe (5 mg/ml metakamu/meloksykamu) we wstrzyknięciu podskórnym. Umieść myszy na poduszce grzewczej i trzymaj je tam, aż w pełni wyzdrowieją. Następnie włóż je z powrotem do klatki z innymi zwierzętami.</li>
</ol>
3. Ocena wzrostu guza ortotopowego za pomocą skanowania μCT
UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana na platformie obrazowania przedklinicznego () z zakładu dla zwierząt.
<ol>
	<li>Wykonuj wszystkie procedury na zwierzętach zgodnie z przepisami instytucjonalnej komisji etycznej.</li>
	<li>Rozpocznij monitorowanie objętości guza za pomocą μCT 2 tygodnie po wstrzyknięciu komórki, a następnie co tydzień.</li>
	<li>Świeżo rozcieńczyć środek kontrastowy iopamiro (300 mg/ml) w roztworze soli fizjologicznej w stosunku 3:1 dla obu dawek. Podawać 300 ml iopamiro przez zgłębnik doustny. 
	UWAGA: Ze względu na słaby kontrast tkanek miękkich w μCT zaleca się stosowanie środka kontrastowego w celu poprawy czułości techniki. Protokół obejmuje doustne podanie środka na bazie jodu (iopamiro) w celu określenia obciążenia guzem w świetle oraz wtórne podanie dootrzewnowe tego samego środka w celu określenia obciążenia guzem w trzewnej powierzchni jelita. Wcześniej przeprowadzono eksperymenty pilotażowe w celu określenia dokładnego czasu, w którym środek kontrastowy musi dotrzeć do jelita ślepego myszy przed jego eliminacją. W przypadku iopamiro jest to około 2 h.</li>
	<li>Po 2 godzinach należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcie 300 ml wcześniej rozcieńczonego iopamiro. Podanie pomaga określić granice guza w powierzchni ciemieniowej.</li>
	<li>Znieczulić zwierzęta za pomocą 2% izofluranu.</li>
	<li>Po upewnieniu się, że zwierzę jest prawidłowo znieczulone poprzez uszczypnięcie stopy myszy, umieść zwierzę na łóżku skanującym μCT. Najlepsza pozycja to leżenie na plecach (twarzą do góry).</li>
	<li>W oprogramowaniu sterującym uruchom tryb na żywo (tryb fluoroskopii), aby umieścić obszar brzucha w polu widzenia (FOV) skanera. Aby to zrobić, przesuwaj łóżko do przodu i do tyłu oraz na boki, aż do uzyskania żądanej pozycji. Obróć lampę rentgenowską i detektor o 90° i przesuń łóżko skanujące w osi y, aby całkowicie wyśrodkować zwierzę.</li>
	<li>Dla obrazów skanowania μCT należy użyć następujących parametrów: 30 mm FOV, 26 s czasu akwizycji, 90 kV napięcia prądu i 200 μA natężenia prądu, przy użyciu systemu obrazowania FX μCT.</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania należy zwrócić zwierzęta do ich klatek w celu odzyskania sił. Zapewnij wsparcie termiczne i monitoruj zwierzęta do czasu, aż wyzdrowieją ze znieczulenia przed powrotem do pomieszczeń inwentarskich.</li>
	<li>Akwizycja μCT daje plik o rozmiarze 250 Mb dla każdego skanowania. Utworzone pliki danych mają format VOX. Aby udostępnić je dowolnemu oprogramowaniu do analizy obrazowania, należy je przekonwertować do formatu DICOM za pomocą oprogramowania zarządzającego bazą danych μCT. Partię utworzonych plików należy przechowywać na przenośnym dysku twardym w celu ich analizy za pomocą dowolnego komputera z dostępnym oprogramowaniem do obrazowania. 
	UWAGA: Podczas analizy obrazu jelito ślepe jest zlokalizowane jako rozszerzone jelito o gęstej zawartości promieniowania (iopamiro), często po lewej stronie brzucha ogonowego. W zgięciu trzewnym jelita ślepego obserwuje się pogrubienie ściany w porównaniu z sąsiednimi obszarami jelitowymi. Pogrubienie odpowiada wzrostowi guza.</li>
	<li>Gdy guz zostanie zlokalizowany, znajdź największą średnicę w różnych widokach (osiowym, czołowym i strzałkowym). Zmierz te trzy osie i oblicz objętość guza zgodnie ze wzorem elipsoidalnym: objętość = 4/3π x (x-półoś x y-półoś x z-półoś)10.</li>
</ol>
4. Interwencja terapeutyczna u myszy z guzami ortotopowymi
<ol>
	<li>Monitoruj myszy z guzami ortotopowymi co tydzień.</li>
	<li>Gdy u większości myszy zostanie wykryty sygnał skanowania μCT guza, wykonaj kolejne badanie μCT w następnym tygodniu, aby potwierdzić obecność guza. 
	UWAGA: Czas rozpoczęcia leczenia zależy od zastosowanego modelu PDX i waha się od 3 do 12 tygodni po inokulacji komórek nowotworowych w jelicie ślepym.</li>
	<li>Losowo podziel myszy na cztery grupy: grupę nośnika (n = 10-15 myszy), grupę testującą lek (n = 10-15 myszy), grupę standardowej chemioterapii (n = 10-15 myszy) i grupę leczenia skojarzonego (n = 10-15 myszy).</li>
	<li>Myszy należy leczyć dootrzewnowo solą fizjologiczną (grupa nośnika), lekiem testowym (20 mg/kg) (grupa leku testowego), irynotekanem (50 mg/kg) (grupa standardowej opieki) lub lekiem testowym (20 mg/kg) z irynotekanem (50 mg/kg) (grupa leczenia skojarzonego). Wykonuj podawanie raz w tygodniu do końca eksperymentu.</li>
	<li>Monitoruj wzrost guza co tydzień za pomocą skanowania μCT przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentu poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i zbierz wątrobę, płuca i wszelkie inne możliwe zmiany w innych narządach.</li>
	<li>Umieść próbki tkanek w kasetach i inkubuj je w 4% formalinie przez noc. Użyj tkanki jelitowej myszy bez guza w jelicie ślepym jako kontroli.</li>
	<li>Wyjmij kasety z formaliny i inkubuj z 70% etanolem przez co najmniej 3 godziny.</li>
	<li>Zanurz kasety w parafinie, korzystając ze standardowych protokołów placówki histopatologii.</li>
	<li>Wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) z jelita ślepego, wątroby i płuc, stosując standardowe protokoły placówki histopatologii.</li>
</ol>

<ol><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Cancer+Statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Puig, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personalized+preclinical+model+to+evaluate+the+metastatic+potential+of+patient-derived+colon+cancer+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells.</a> Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li>
<li>Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer%3A+Metastases+to+a+single+organ%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer: Metastases to a single organ.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+micro-CT+colonography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small animal micro-CT colonography.</a> Methods. 50 (1), 36-41 (2010).</li>
<li>Boll, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-contrast+micro-CT+colonoscopy+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Colorectal+Disease%22%5BJournal%5D)">Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice.</a> International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).</li>
<li>O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+colon+cancer+cell+capable+of+initiating+tumour+growth+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice.</a> Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).</li>
<li>Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+volume+in+subcutaneous+mouse+xenografts+measured+by+microCT+is+more+accurate+and+reproducible+than+determined+by+18F-FDG-microPET+or+external+caliper%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper.</a> BMC Medical Imaging. 8, 16(2008).</li>
<li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+x+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li>
<li>Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+colorectal+cancer+orthotopic+patient-derived+xenograft+models+for+cancer+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research.</a> Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).</li>
</ol>

W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano i przetestowano wiele nowych terapii przeciwnowotworowych u pacjentów z różnymi typami nowotworów, w tym rakiem jelita grubego (CRC). Chociaż w wielu przypadkach zaobserwowano obiecujące wyniki w modelach przedklinicznych, skuteczność terapeutyczna u pacjentów z zaawansowanym przerzutowym CRC była często ograniczona. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania modeli przedklinicznych, które pozwolą na testowanie skuteczności nowych leków terapeutycznych w klinicznie istotn...

Rak jelita grubego (CRC) jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka na świecie1. Możliwość generowania modeli nowotworów in vitro lub in vivo pochodzących z pojedynczych komórek nowotworowych pacjenta przyczyniła się do rozwoju medycyny precyzyjnej w onkologii. W ciągu ostatniej dekady organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) lub ksenoprzeszczepy (PDX) były używane przez wiele grup badawczych na całym świecie2. PDO to wielokomórkowe struktury in vitro, które przypominają cechy oryginalnej tkanki nowotworowej i mogą się samoorganizować i samoodnawiać3. Te obiecujące modele in vitro mogą być z powodzeniem wykorzystywane do badań przesiewowych leków i ułatwiania badań translacyjnych. Z drugiej strony, modele PDX wiernie odwzorowują oryginalny CRC na wszystkich istotnych poziomach, od histologii po cechy molekularne i odpowiedź na lek2,4.
Modele PDX in vivo są najczęściej hodowane jako guzy podskórne u myszy z niedoborem odporności. Stosując to podejście, PDX stały się złotym standardem w badaniach nad rakiem, szczególnie w badaniu wrażliwości lub oporności na leki. Jednak zgony związane z CRC są najczęściej związane z obecnością zmian przerzutowych w wątrobie, płucach lub jamie otrzewnej, a żadne z dwóch podejść (PDO lub PDX) nie może podsumować zaawansowanego stanu klinicznego. Ponadto wykazano, że specyficzne miejsce wzrostu guza determinuje ważne cechy biologiczne, które mają wpływ na skuteczność leku i rokowanie choroby2. W związku z tym istnieje pilna potrzeba ustanowienia modeli przedklinicznych, które można wykorzystać do oceny skuteczności leków przeciwnowotworowych w klinicznie istotnych warunkach przerzutowych6.
Skanery tomografii komputerowej (μCT) mogą funkcjonować jako pomniejszone kliniczne tomografy komputerowe, zapewniając pierwotne obrazowanie guza i przerzutów u myszy w rozdzielczości obrazu proporcjonalnej do rozdzielczości CT pacjentów z rakiem7. Aby przeciwdziałać słabemu kontrastowi tkanek miękkich w technice μCT, można zastosować radiologiczne jodowe środki kontrastowe w celu poprawy kontrastu i oceny obciążenia guza. Stosując podejście z podwójnym kontrastem, jod podawany doustnie i dootrzewnowo jest podawany w różnym czasie. Kontrast podawany doustnie pomaga określić granice między tkanką nowotworową a treścią jelita ślepego w jelicie. Z drugiej strony, kontrast podawany dootrzewnowo pozwala na identyfikację zewnętrznych granic masy guza, który często rośnie i atakuje otrzewną8.
Rękopis opisuje protokół wykonywania ortotopowej implantacji komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta w ścianie jelita ślepego myszy z niedoborem odporności, oraz metodologię monitorowania wzrostu guza jelita za pomocą skanowania μCT. Z niniejszego artykułu wynika, że model ten podsumowuje scenariusz kliniczny zaawansowanych nowotworów jelita grubego i choroby przerzutowej u pacjentów z CRC, których nie można badać za pomocą modeli PDO lub PDXO. Ponieważ ortotopowe modele PDX CRC podsumowują scenariusz kliniczny pacjentów z CRC, dochodzimy do wniosku, że są one jak dotąd najlepsze do testowania skuteczności leków przeciwnowotworowych w zaawansowanych nowotworach jelita i chorobie przerzutowej.

<table><tbody><tr><td>ODCZYNNIK</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>T1147-500MG</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Life Technologies S.A (Hiszpania)</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Wodny roztwór chlorheksydyny 2%</td> <td>DH Materiał M & Eacute; DICO, S.L.</td><td></td><td></td>1111696250</tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DMEM /F12&nbsp;</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I&nbsp; &nbsp;</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>D4263-5VL</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PEPRO TECH EC LTD.</td><td>AF-100-15-500 &mikro; g</td><td></td></tr><tr><td>FGF basic</td><td>PEPRO TECH EC LTD.</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Life Technologies S.A. (Hiszpania)</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td></td><td></td>15750037</tr><tr><td>Heparyna Sól sodowa</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>H4784-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iopamiro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td></td><td></td>15160047</tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td></td><td></td>25030032</tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>CULTEK, S.L.U.</td><td>356235/356234/354234</td><td></td></tr><tr><td>Metacam, 5 mg/ml</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td></td><td></td>11140035</tr><tr><td>Nystatyna</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>N4014-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies S.A. (Hiszpania)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), sterylne</td><td>Labclinics S.A</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>P0130-25G</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>P5780-5G</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC&nbsp;</td><td>Labclinics S.A</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td></td><td></td>11360039</tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>S5261-25G</td><td></td></tr><tr><td><mocne>NIEZBĘDNE MATERIAŁY</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-tygodniowy NOD. Myszy CB17-Prkdcscid/NcrCrl</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>BD Micro-Fine 0,5 ml U 100 igła 0,33 mm (29G) x 12,7 mm&nbsp;</td><td>BECTON DICKINSON, S.A.U.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>320926 Ostrze #24</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sitko komórkowe 100 i mikro; m</td><td>Cultek, SLU</td><td>45352360</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze i nożyczki chirurgiczne</td> <td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Lacryvisc, 3 mg / g, żel okulistyczny</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Surfasafe</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Szew PROLENE 5-0&nbsp;</td><td>JOHNSON& JOHNSON S, A.</td><td>8720H</td><td></td></tr><tr><td>SPRZĘT/OPROGRAMOWANIE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantum FX &micro; System obrazowania</td><td>CT Perkin Elmer</td><td>Perkin Elmer http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083</td><td></td></tr></tbody></table>

ortotopowa implantacja komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta u myszy podsumowuje zaawansowanego raka jelita grubego

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

W ciągu ostatniej dekady stworzono bardziej zaawansowane modele przedklinicznego raka jelita grubego (CRC) wykorzystujące komórki rakowe pochodzące od pacjentów i guzy 3D. Ponieważ organoidy nowotworowe pochodzące od pacjenta mogą zachować cechy oryginalnego guza, te wiarygodne modele przedkliniczne umożliwiają badania przesiewowe leków przeciwnowotworowych i badanie mechanizmów oporności na leki. Jednak zgon związany z rakiem jelita grubego u pacjentów jest najczęściej związany z obecnością choroby z przerzutami. W związku z tym niezbędna jest ocena skuteczności terapii przeciwnowotworowych w odpowiednich modelach in vivo, które naprawdę podsumowują kluczowe cechy molekularne przerzutów raka u ludzi. Stworzyliśmy model ortotopowy oparty na wstrzyknięciu komórek nowotworowych pochodzących od pacjentów z CRC bezpośrednio do ściany jelita ślepego myszy. W tych komórkach nowotworowych rozwijają się pierwotne guzy w jelicie ślepym, które dają przerzuty do wątroby i płuc, co często obserwuje się u pacjentów z zaawansowanym CRC. Ten mysi model CRC może być wykorzystany do oceny odpowiedzi na leki monitorowanych za pomocą tomografii mikrokomputerowej (μCT), klinicznie istotnej metody obrazowania na małą skalę, która może łatwo zidentyfikować guzy pierwotne lub przerzuty u pacjentów. Tutaj opisujemy procedurę chirurgiczną i wymaganą metodologię wszczepiania komórek rakowych pochodzących od pacjenta do ściany jelita ślepego myszy z niedoborem odporności.

Myszy z ortotopowo wszczepionymi komórkami nowotworowymi pochodzącymi od pacjentów monitorowano co tydzień za pomocą skanowania µCT. Po zakończeniu eksperymentu zwierzęta uśmiercono. Jelita, kątnice (Rysunek 1A,B), wątroby, płuca oraz wszelkie inne możliwe zmiany zebrano, umieszczono w kasetkach i utrwalono w 4% formalinie przez noc. Jako kontrolę wykorzystano tkankę jelita myszy bez guza w kątnicy (Rysunek 1C). Następnie kasetki przeniesiono do...

Ten protokół opisuje ortotopową implantację komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta w ścianie jelita ślepego myszy z niedoborem odporności. Model podsumowuje zaawansowany rak jelita grubego, chorobę z przerzutami i pozwala na ocenę nowych leków terapeutycznych w klinicznie istotnym scenariuszu przerzutów do płuc i wątroby.

Ortotopowa implantacja komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta u myszy podsumowuje zaawansowanego raka jelita grubego

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Protokół ten opisuje ortotopową implantację komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta w ścianie jelita ślepego myszy z niedoborem odporności. Model ten podsumowuje zaawansowany rak jelita grubego z przerzutami. Przedstawiony tutaj ortotopowy model raka jelita grubego podsumowuje scenariusz kliniczny zaawansowanych nowotworów jelita grubego i choroby przerzutowej u pacjentów z rakiem jelita grubego, których nie można badać przy użyciu organoidów pochodzących od pacjenta lub modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta.Z myszy poddanej eutanazji wyekstrahuj guz, ostrożnie usuwając go ze skóry i otaczającej tkanki nienowotworowej za pomocą nożyczek i kleszczy. Umieść zebrane guzy w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą ostrza rozdziel guzy na 10-centymetrowej płytce hodowlanej zawierającej jeden milimetr pożywki.Umieść jednorodną zdysocjowaną próbkę w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj pożywkę do końcowej objętości pięciu mililitrów. Następnie dodaj pożywkę wytrawiającą do probówki.Umieść probówkę w pozycji 45 stopni w inkubatorze do hodowli komórkowych na godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podczas godzinnej inkubacji mi

orthotopic-implantation-patient-derived-cancer-cells-mice

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Do ustanowienia tego modelu można wykorzystać dwie techniki: wstrzyknięcie zawiesiny komórek nowotworowych w ścianę kątnicy lub przeszczepienie fragmentu guza podskórnego na kątnicę. Model ten jest przydatny do badania naturalnej progresji raka jelita grubego oraz testowania nowych środków terapeutycznych przeciwko rakowi jelita grubego.

Ortotopowy model raka jelita grubego u myszy

Film demonstruje technikę ortotopowej inokulacji raka piersi na modelu mysim. Technika ta zapewnia wysoki wskaźnik nowotworzenia przy mniejszej zmienności wielkości i kształtu guza w porównaniu z wstrzyknięciem podskórnym lub niechirurgicznym.

Wstrzyknięcie ortotopowe: wszczepianie komórek rakowych specyficznych tkankowo dorosłej myszy

Ten film opisuje protokół tworzenia mysiego modelu spontanicznych przerzutów ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem jelita grubego lub PDX. Te modele ksenoprzeszczepów częściowo naśladują cechy ludzkich nowotworów i rozumieją krytyczne aspekty nowotworów złośliwych u ludzi, w tym inwazję i przerzuty.

Mysie modele spontanicznych przerzutów: platforma do badania potencjału przerzutowego komórek raka jelita grubego wstrzykiwanych ortotopowo

Film opisuje technikę iniekcji śródśladowej komórek rakowych w celu opracowania ortotopowego modelu myszy z wysoce jednorodnymi guzami. W związku z tym ortotopowy model myszy umożliwia realistyczną symulację przerzutów, stanowiąc cenne narzędzie do badania zmian fenotypu podczas wzrostu i rozprzestrzeniania się guza.

Wstrzyknięcie śródśladowych komórek nowotworowych: technika dostarczania komórek rakowych w celu ustalenia ortotopowego modelu myszy raka jelita grubego

Zdolność klonów przerzutowych do kolonizacji odległych miejsc zależy od ich zdolności do proliferacji i/lub zdolności do przetrwania w mikrośrodowisku gospodarza bez znaczącej proliferacji. W tym miejscu przedstawiamy model zwierzęcy, który umożliwia ilościową wizualizację obu typów kolonizacji wątroby przez klony z przerzutami.

Zaawansowany zwierzęcy model przerzutów jelita grubego w wątrobie: techniki obrazowania i właściwości klonów z przerzutami

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Przedstawiono protokół tworzenia genetycznie modyfikowanego mysiego modelu raka jelita grubego poprzez segmentowe zakażenie adeno-cre i jego nadzorowanie za pomocą kolonoskopii o wysokiej rozdzielczości.

Genetycznie zmodyfikowany mysi model sporadycznego raka jelita grubego

Aby umożliwić bardzo czułe wykrywanie komórek kolonizujących tkanki ludzkiego raka jelita grubego (CRC), pokazujemy protokół efektywnej transdukcji cząsteczek lentiwirusa z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do komórek organoidowych CRC pochodzących z PDX przed ich wstrzyknięciem myszom biorcy, z obserwacją mikroskopową stereofluorescencji.

Wysoka czułość wykrywania mikroprzerzutów generowanych przez organoidy transdukowane przez GFP lentiwirus hodowane z guza jelita grubego pochodzącego od pacjenta

Tutaj prezentujemy protokół wszczepiania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej w prosty, mniej inwazyjny i łatwy w obsłudze sposób, a ten mysi ortotopowy model raka piersi z odpowiednim środowiskiem poduszeczki tłuszczowej może być wykorzystany do badania różnych aspektów raka.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy

Ten protokół opisuje generowanie modeli ortotopowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów poprzez dopęcherzowe wkraplanie komórek raka urotelialnego o wysokim stopniu złośliwości lub dodoodbytnicze wstrzykiwanie komórek raka jelita grubego do myszy z nieotyłym cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) w celu pierwotnego wzrostu guza i spontanicznych przerzutów pod wpływem komórek zrębu węzłów chłonnych, co naśladuje postęp ludzkich chorób przerzutowych.

Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów pobrane od pacjentów dla ludzkiego raka urotelialnokomórkowego i raka jelita grubego, wzrostu guza i spontanicznych przerzutów

Wstrzyknięcie organoidów raka jelita grubego (CRC) do żyły wrotnej powoduje przerzuty do wątroby bogate w zręb. Ten mysi model przerzutów do wątroby CRC stanowi użyteczne narzędzie do badania interakcji guz-zręb i opracowywania nowych terapii ukierunkowanych na zręb, takich jak terapie genowe za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem.

Wstrzyknięcie do żyły wrotnej organoidów raka jelita grubego w celu zbadania zrębu z przerzutami do wątroby

Poznaj ortotopową implantację komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta u myszy immunodeficyjnych. Ten model odwzorowuje zaawansowanego raka jelita grubego z przerzutami do płuc i wątroby, umożliwiając ocenę nowych leków terapeutycznych.

Ortotopowa implantacja komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta u myszy podsumowuje zaawansowanego raka jelita grubego

Przeglądaj więcej filmów