Name: Implantacja i ocena czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Poznaj metodę implantacji czerniaka naczyniówki u myszy z wykorzystaniem optycznej koherentnej tomografii. Technika umożliwia obrazowanie na żywo wzrostu guza i tworzenie jednorodnych grup badawczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez grant 1304/20 od Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF), Izrael, dla Arie Marcovicha. Dziękujemy Shaharowi Ish-Shalom i Ady Yosipovichowi z Oddziału Patologii Centrum Medycznego Kaplan, Rehovot, Izrael, za analizę histologiczną.

Eksperymenty opisane w protokole zostały zatwierdzone przez izraelską Krajową Radę ds. Eksperymentów na Zwierzętach i są zgodne z oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzroku. W niniejszym badaniu wykorzystano samice myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni, które poddano 12/12-godzinnemu cyklowi światła i ciemności. Zwierzęta pozyskano z komercyjnego źródła (patrz Tabela materiałów).
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodować komórki B16LS9 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 25 mM HEPES, 1% mieszaniny witamin niezbędnych, 200 U/mL penicyliny oraz 200 mg/mL streptomycyny (patrz Tabela materiałów), w inkubatorze z nawilżaną atmosferą w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Zebrać komórki do wstrzyknięcia przy 70%-80% konfluencji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Przygotować mieszankę anestetyczną ketaminy (75 mg/kg masy ciała) i medetomidyny (0,5 mg/kg masy ciała). Zznieczulić myszy, wstrzykując mieszankę anestetyczną pojedynczym zastrzykiem dootrzewnowym.</li>
	<li>Zastosować miejscowo anestetyk oftalmiczny oksybukaina (0,4%) do obu oczu.</li>
	<li>Rozszerzyć źrenice myszy poprzez miejscowe zastosowanie tropikamidu (0,5%).</li>
</ol>
3. Wykonanie peritomii spojówki i toru twardówkowej do przestrzeni podchoroidejskiej
<ol>
	<li>Nanieść 1,4% hydroksyetylocelulozy (patrz Tabela materiałów) do obu oczu jako środek nawilżający, aby zapobiec wysuszeniu. Do prawego oka podać 0,5% tropikamidu.</li>
	<li>Obserwować operowane oko myszy pod mikroskopem operacyjnym (patrz Tabela materiałów). Powieki należy utrzymać w pozycji otwartej za pomocą sterylnych pęsety okulistycznej.</li>
	<li>Używając pęsety okulistycznej, chwycić górno-skroniową część spojówki limbalnej i odciągnąć ją w kierunku dolno-nosowym22. Utrzymać tę pozycję przez cały czas trwania procedury (Rycina 1A)&#160;.</li>
	<li>Używając końcówki igły 30 G, wykonać niewielką (1-2 mm) peritomię spojówki w obszarze grzbietowo-skroniowym, około 1-2 mm za limbusm. 
	UWAGA: Użycie cieńszych igieł może zapobiec nadmiernemu nakłuciu i pozwolić na lepszą precyzję lokalizacji guza.</li>
	<li>Usunąć nadmiar torebki Tenona z miejsca nacięcia peritomii. 
	UWAGA: Torebka Tenona to warstwa gęstej tkanki łącznej otaczająca gałkę oczną22.</li>
	<li>W tym miejscu wprowadzić końcówkę igły, aby przebić twardówkę. Wykonać nacięcie w celu stworzenia kanału do przestrzeni podchoroidealne, aż przez odsłoniętą białą tkankę twardówki pojawi się brązowy kolor naczyniówki (Rycina 1B).</li>
</ol>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64632/64632fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Inokulacja komórek nowotworowych. (A) Górno-skroniowa część spojówki limbatu jest utrzymywana za pomocą kleszczy okulistycznych i przesunięta w kierunku dolno-nosowym. (B) Końcówka igły 30 G jest wprowadzana w celu przebicia twardówki, a następnie wykonuje się nacięcie, aby utworzyć kanał do przestrzeni podnaczyniowej. (C) Strzykawka wypełniona komórkami i wyposażona w igłę 32 G jest wprowadzana do kanału, a następnie wstrzykuje się komórki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64632/64632fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
4. Inokulacja komórek czerniaka
<ol>
	<li>Resuspender 70 000 komórek B16LS9 w 2 &#181;L buforu PBS. Ilość ta jest określona w przeliczeniu na jedno oko.</li>
	<li>Przenieść komórki do sterylnego 10 &#181;L szklana strzykawka Hamiltona (patrz Tabela materiałów) wyposażonej w tępe igły 32 G, skręconej pod kątem 45&#176; kąt</li>
	<li>Wprowadź igłę załadowanej strzykawki na głębokość około 2 mm do kanału utworzonego w kroku 3.</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 &#181;L zawiesiny komórkowej.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy przytrzymać igłę w miejscu przez 2–3 s, aż cały płyn zostanie wchłonięty.</li>
	<li>Wyjąć igłę, wysuwając ją delikatnie i powoli, aby zapobiec wyciekowi z kanału (Rycina 1C). 
	UWAGI: Regulacja prędkości i siły wstrzykiwania może wpływać na wzorzec rozwoju guza. Sugeruje się, aby parametry te były kalibrowane przez osoby przeprowadzające doświadczenia w celu ustalenia odpowiedniej siły i prędkości podania. W badaniach wstępnych ustalono całkowitą liczbę 70 000 komórek. Jednak ze względu na możliwe różnice w typach lub partiach kultur komórkowych, a także pomiędzy szczepami myszy, niezbędna jest kalibracja tej liczby.</li>
</ol>
5. Ocena miejsca wstrzyknięcia
<ol>
	<li>Obejrzyj wstrzyknięte oko za pomocą skanów OCT natychmiast po inokulacji komórek czerniaka, aby zidentyfikować wystąpienie odwarstwienia siatkówki (RD), uszkodzeń siatkówki i/lub obecność komórek w ciele szklistym23. 
	UWAGI: W razie potrzeby ponownie zastosuj tropikamid, oksybuprokainę i etylocelulozę.</li>
	<li>Na podstawie skanów OCT z kroku 5.1 sklasyfikuj wzorce RD21 zgodnie z następującymi kryteriami: (1) lokalne RD – jedno miejsce odwarstwienia siatkówki; (2) wyciek do ciała szklistego – obserwacja materiału komórkowego w ciele szklistym; (3) rozległe RD – wiele miejsc odwarstwienia siatkówki.</li>
	<li>Przewidź lokalizację guza na podstawie: (1) lokalnego RD – spodziewane guzy naczyniówki; (2) wycieku do ciała szklistego – spodziewane guzy w ciele szklistym; (3) rozległego RD – spodziewane guzy o zmiennej i rozproszonej lokalizacji (Rycina 2). 
	&#8203;UWAGA: Przewiduje się, że tylko u myszy z lokalnym RD (około 50%) rozwiną się guzy ograniczone do naczyniówki.</li>
</ol>
6. Przewidywanie wielkości guza na podstawie wysokości RD
<ol>
	<li>Zmierz wysokość lokalnego RD na skanach OCT, korzystając z oprogramowania do segmentacji/analizy OCT (patrz Tabela materiałów) i zaklasyfikować zgodnie z następującymi grupami: małe = &#60;300 &#181;m; medium = 300-400 &#181;m; duży = &#62;400 &#181;m.</li>
	<li>Ocenić objętość, którą guzy powinny osiągnąć w ciągu 5 dni od iniekcji, zgodnie z następującymi kryteriami: 
	Niską wartość wysokości RD obserwuje się zazwyczaj w guzach o niewielkich rozmiarach (objętość guza w zakresie od 0,0059 mm3 do 0,07 mm3 ze średnią objętością wynoszącą 0,027 &#177; 0,005 mm3). 
	Średnią wysokość RD stwierdzono zarówno w guzach małych, jak i średnich (objętość guza w zakresie od 0,015 mm3 do 0,15 mm3 z objętością średnią wynoszącą 0,056 &#177; 0,016 mm3). 
	A&#160;duża wysokość RD wiąże się z szerokim zakresem objętości guzów, sięgającym do 0,36 mm3. 
	UWAGA: Zakres oczekiwanych wielkości guzów określono na podstawie wcześniejszych wyników i podzielono na trzy grupy: guzy małe, średnie i duże.</li>
</ol>
7. Procedury pooperacyjne
<ol>
	<li>Zastosuj miejscowo ofloksacynę do oczu 0,3%.</li>
	<li>Odwróć działanie znieczulenia, wstrzykując podskórnie hydrochlorzeck atipamezolu (3 mg/kg).</li>
	<li>Wstrzykuj podskórnie buprenorfinę (0,05 mg/kg masy ciała) dwa razy dziennie przez 3 dni w celu zmniejszenia bólu i cierpienia zwierząt.</li>
	<li>W 5. dniu po wstrzyknięciu komórek czerniaka oceń wielkość guza,&#160;postępując zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Znieczul myszy zgodnie z opisem w kroku 2.1. Zastosuj tropikamid (0,5%).</li>
		<li>Zbadaj oczy za pomocą skanów OCT w płaszczyźnie podłużnej i strzałkowej, a następnie użyj oprogramowania do segmentacji/analizy OCT w celu pomiaru objętości i lokalizacji guza.</li>
		<li>Oblicz objętość guza, korzystając ze wzoru24: V = a*b*c*6/π (gdzie a, b i c to odpowiednio długość, szerokość i wysokość).</li>
		<li>Badaj wielkość guza co 2-3 dni zgodnie z opisem w krokach 7.4.1-7.4.3. 
		UWAGA: Procedurę należy zoptymalizować w przypadku zastosowania innych szczepów myszy lub linii komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jager, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Uveal melanoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 6 (1), 1-25 (2020).</li>
<li>Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. V. Uveal melanoma pathobiology: Metastasis to the liver. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+P+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22">Seminars in Cancer Biology</a>. 71, Academic Press. 65-85 (2021).</li>
<li>Damato, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+treatment+of+choroidal+melanoma+in+relation+to+the+prevention+of+metastatic+death-A+personal+view%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular treatment of choroidal melanoma in relation to the prevention of metastatic death-A personal view.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 66, 187-199 (2018).</li>
<li>Jouhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+fatal+choroidal+melanoma+study.+A+survey+by+the+European+Ophthalmic+Oncology+Group%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The small fatal choroidal melanoma study. A survey by the European Ophthalmic Oncology Group.</a> American Journal of Ophthalmology. 202, 100-108 (2019).</li>
<li>Cao, J., Jager, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+eye+models+for+uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Oncology+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal eye models for uveal melanoma.</a> Ocular Oncology and Pathology. 1 (3), 141-150 (2015).</li>
<li>Uner, O. E., Gandrakota, N., Azarcon, C. P., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Eye+Science%22%5BJournal%5D)">Animal models of uveal melanoma.</a> Annals of Eye Science. 7, 21-30 (2022).</li>
<li>Yang, H., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+alpha+2b+decreases+hepatic+micrometastasis+in+a+murine+model+of+ocular+melanoma+by+activation+of+intrinsic+hepatic+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Interferon alpha 2b decreases hepatic micrometastasis in a murine model of ocular melanoma by activation of intrinsic hepatic natural killer cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2056-2064 (2004).</li>
<li>Yang, H., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunologic+and+anti-angiogenic+therapy+reduces+hepatic+micrometastases+in+a+murine+ocular+melanoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Combined immunologic and anti-angiogenic therapy reduces hepatic micrometastases in a murine ocular melanoma model.</a> Current Eye Research. 31 (6), 557-562 (2006).</li>
<li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+%26+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion & Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li>
<li>Diaz, C. E., Rusciano, D., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B16LS9+melanoma+cells+spread+to+the+liver+from+the+murine+ocular+posterior+compartment+%28PC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">B16LS9 melanoma cells spread to the liver from the murine ocular posterior compartment (PC).</a> Current Eye Research. 18 (2), 125-129 (1999).</li>
<li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+%26+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion & Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li>
<li>Ashur-Fabian, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrac+delayed+the+onset+of+ocular+melanoma+in+an+orthotopic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Tetrac delayed the onset of ocular melanoma in an orthotopic mouse model.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 632335(2019).</li>
<li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+c-met+overexpression+in+liver-metastatic+B16-LS9+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating c-met overexpression in liver-metastatic B16-LS9 melanoma cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 81 (3), 477-487 (2001).</li>
<li>Harning, R., Szalay, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+metastasis+of+in+vivo+and+in+vitro+derived+syngeneic+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Ocular metastasis of in vivo and in vitro derived syngeneic murine melanoma.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1599-1604 (1987).</li>
<li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li>
<li>Notting, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+bioluminescent+imaging+of+human+uveal+melanoma+in+a+new+mouse+model+of+local+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Whole-body bioluminescent imaging of human uveal melanoma in a new mouse model of local tumor growth and metastasis.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (5), 1581-1587 (2005).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+xenograft+murine+human+uveal+melanoma+model+develops+hepatic+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">In-vivo xenograft murine human uveal melanoma model develops hepatic micrometastases.</a> Melanoma Research. 18 (2), 95-103 (2008).</li>
<li>Murthy, R. K., Haji, S., Sambhav, K., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Journal%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of spectral domain optical coherence tomography in retinal diseases.</a> Biomedical Journal. 39 (2), 107-120 (2016).</li>
<li>Drexler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-resolution+ophthalmic+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography.</a> Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).</li>
<li>Ochakovski, G. A., Fischer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+of+mouse+models+with+OCT%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotyping of mouse models with OCT.</a> Methods in Molecular Biology. 1834, 285-291 (2019).</li>
<li>Zaks, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+imaging+for+assessing+tumor+growth+in+mouse+models+of+ocular+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In-vivo imaging for assessing tumor growth in mouse models of ocular melanoma.</a> Experimental Eye Research. 204, 108431(2021).</li>
<li>Brar, V. S. American Academy of Ophthalmology 2022-2023 BCSC. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrar%2C+VS+%22Fundamentals+and+principles+of+ophthalmology%22">Fundamentals and principles of ophthalmology</a>. , (2022).</li>
<li>Duker, J. S., Waheed, N. K., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuker%2C+JS+%22Handbook+of+Retinal+OCT%3A+Optical+Coherence+Tomography%2C+2nd+Edition%22">Handbook of Retinal OCT: Optical Coherence Tomography, 2nd Edition</a>. , Elsevier Health Sciences. (2021).</li>
<li>Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+subcutaneous+tumor+size+in+athymic+%28nude%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).</li>
<li>Richards, J. R., Yoo, J. H., Shin, D., Odelberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+uveal+melanoma%3A+Strengths%2C+weaknesses%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of uveal melanoma: Strengths, weaknesses, and future directions.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (2), 264(2020).</li>
<li>Chen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+molecular+imaging-escorted+adipose+photodynamic-browning+synergy+for+fighting+obesity+with+virus-like+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic molecular imaging-escorted adipose photodynamic-browning synergy for fighting obesity with virus-like complexes.</a> Nature Nanotechnology. 16 (4), 455-465 (2021).</li>
<li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+visualization+of+early+cancer+hepatic+micrometastasis+and+intraoperative+image-guided+surgery+by+photoacoustic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free visualization of early cancer hepatic micrometastasis and intraoperative image-guided surgery by photoacoustic imaging.</a> Journal of Nuclear Medicine. 61 (7), 1079-1085 (2020).</li>
</ol>

Marcovich A.L.: Steba Biotech (P), Yeda Weizmann (P), EyeYon Medical (C, P), Mor Isum (P). (C) = Konsultant; (P) = Patent. Wszyscy pozostali autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Czerniak błony naczyniowej gałki ocznej jest wyniszczającą chorobą, w przypadku której bardzo potrzebne są nowe podejścia terapeutyczne. Jednak badania nad czerniakiem błony naczyniowej gałki ocznej i potencjalnymi metodami leczenia są ograniczone przez wyzwania techniczne związane z modelami zwierzęcymi czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej 1,25. Guzy gałki ocznej, które są indukowane przez wstrzyknięcie komórek rakowych do gałki ocznej, są bardzo zmienne zar...

Czerniak błony naczyniowej gałki ocznej (UM) jest najczęstszym pierwotnym nowotworem wewnątrzgałkowym u dorosłych. Około 90% czerniaków gałki ocznej wywodzi się z melanocytów w obszarze naczyniówki drogi naczyniowej oka1. UM jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności, ponieważ szacuje się, że u blisko 50% pacjentów rozwija się choroba przerzutowa, przy czym głównym miejscem przerzutów jest wątroba2. Wczesne leczenie zmian pierwotnych może zmniejszyć ryzyko przerzutów, jednak żadne skuteczne leczenie nie zapobiega powstawaniu przerzutów3.
Standardowe leczenie czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej obejmuje napromienianie, które jest związane z utratą wzroku z powodu neuropatii nerwu wzrokowego, retinopatii, zespołu suchego oka i zaćmy. Resekcja chirurgiczna jest zwykle opóźniona do momentu rozpoznania i scharakteryzowania wzrostu zmiany. Jednak takie opóźnienie może pozwolić na rozwój choroby z przerzutami4. W niektórych przypadkach wymagane jest daremne wyłuszczenie. Oczywiście ta radykalna procedura pogarsza wzrok i powoduje dramatyczne pogorszenie estetyki.
Podjęto wiele wysiłków na rzecz opracowania eksperymentalnych modeli do badania czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej. Przedkliniczne modele zwierzęce, które umożliwiają dokładną ocenę tego nowotworu, mają kluczowe znaczenie dla badania nowych strategii diagnostycznych i terapeutycznych czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej. Eksperymentalne modele zwierzęce czerniaka gałki ocznej opierają się głównie na inokulacji komórek nowotworowych u myszy, szczurów i królików5,6. Modele mysie są opłacalne i szeroko stosowane w badaniach nad czerniakiem ze względu na ich szybkie tempo reprodukcji i wysokie podobieństwo genomu do ludzi. Mysia linia komórkowa czerniaka skóry B16 jest powszechnie stosowana do inokulacji myszy C57BL6 i wywoływania guzów syngenicznych. W przypadku stosowania tego modelu do indukcji czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej, oczy zawierające guz zwykle muszą być wyłuszczone 7-14 dni po inokulacji. Co więcej, witamina B16 jest modelem wysoce inwazyjnym. Uprzywilejowany immunologicznie charakter oka sprzyja przerzutom, a przerzuty można zwykle wykryć 3-4 tygodnie po inokulacji komórek nowotworowych. Subkultury oryginalnej linii B16 wykazują różne właściwości przerzutowe6. Na przykład linia czerniaka Queens ma wysoki wskaźnik przerzutów7,8. Linia komórkowa B16LS9 ma morfologię komórek dendrytycznych i została poprowadzona z przerzutów do wątroby myszy C57BL/6, którym wstrzyknięto rodzicielską linię czerniaka skóry B16F19. Po wstrzyknięciu do tylnego przedziału oka wykazano, że komórki te tworzą guzy wewnątrzgałkowe, które histologicznie przypominają ludzkiego czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej i tworzą przerzuty specyficzne dla wątroby w C57BL / 6, ale nie Balb / C, myszy10,11,12. Genetycznie komórki charakteryzują się wyższą ekspresją protoonkogenu c-met, który działa jako receptor komórkowy dla czynnika wzrostu hepatocytów13. W przeciwieństwie do tego, B16F10, dziesiąty pasaż rodzicielskiego B16, daje przerzuty do płuc głównie po zaszczepieniu dogałkowym14. Zarówno B16F10, jak i B16LS9 są pigmentowane12.
Kilka kluczowych wyzwań ogranicza sukces modeli czerniaka mysiego błony naczyniowej gałki ocznej. Po pierwsze, refluks komórek nowotworowych może prowadzić do czerniaka zewnątrzgałkowego lub podspojówkowego. Po drugie, wzrost guza po wewnątrzgałkowym inokulacji komórek czerniaka jest często bardzo zmienny, co stwarza trudności w ocenie leczenia i postępów. Inną poważną trudnością jest ograniczona zdolność do śledzenia wzrostu guza in vivo. Podczas gdy obrazowanie bioluminescencyjne, takie jak guzy wyrażające lucyferazy, jest powszechnie stosowane do monitorowania wzrostu guza oka15,16, nie może dostarczyć informacji na temat wewnątrzgałkowej lokalizacji guza. Dlatego ocena guza jest zwykle przeprowadzana po enukleacji oka10,17. To znacznie ogranicza możliwość szerokiego scharakteryzowania progresji guza i odpowiedzi na leczenie. Kolejną poważną przeszkodą w badaniu czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej jest trudność w monitorowaniu zmian u myszy barwnikowych. Potrzebne są nowe podejścia, które pozwolą przezwyciężyć te trudności, aby wspierać badania nad czerniakiem błony naczyniowej gałki ocznej na modelach zwierzęcych.
Optyczna tomografia koherentna (OCT) zapewnia charakterystyczne możliwości obrazowania głęboko w różnych częściach oka w wysokiej rozdzielczości, co jest nieporównywalne z innymi metodologiami, w tym ultrasonograficznym18,19. Obrazowanie OCT zostało wykorzystane w modelach zwierzęcych do badania różnych chorób oczu20. Ostatnio wykazano, że obrazowanie OCT jest nieinwazyjnym sposobem oceny wzrostu guza wewnątrz gałki ocznej21. Opisany tutaj protokół przedstawia implantację komórek czerniaka w mysim naczyniówce i wykorzystanie OCT do przewidywania lokalizacji i wielkości guza wewnątrzgałkowego w momencie inokulacji komórek.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; Szklana strzykawka L (Hamilton Co., Bonaduz, Szwajcaria)</td><td>Igły Hamilton</td><td>721711</td><td></td></tr><tr><td>30 G</td><td>Mikrowaga BD</td><td>2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek atypamezolu</td><td>Orion Phrma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B16LS9 komórki</td><td>Hans Grossniklaus USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina&nbsp;</td><td>Richter pharma</td><td>102047</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 samice myszy</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essential mieszanka witamin</td><td>satorius</td><td>01-025-1A</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ren</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>satorius</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hydroksyetyloceluloza 1,4% krople do oczu</td><td>Fisher Pharmaceutical</td><td>390862</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do segmentacji OCT InSight&nbsp;</td><td>Phoenix Micron, Inc&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>bremer pharma GMBH (medimarket)</td><td>17889</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>satorius</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine&nbsp;</td><td>zoetis (vetmarket)</td><td>102532</td><td></td></tr><tr><td>Ofloxacin 0,3% krople do oczu</td><td>allergan</td><td>E92170</td><td></td></tr><tr><td>Optyczna koherentna tomografia&nbsp;</td><td>Phoenix Micron, Inc&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oksybuprokaina 0,4%</td><td>Fisher Pharmaceutical</td><td>393050</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna-amfoteryna</td><td>satorius</td><td>03-033-1B</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)&nbsp;</td><td>satorius</td><td>02-023-1a Pożywka</td><td></td></tr><tr><td>komórkowa RPMI</td><td>satorius</td><td>01-104-1A</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>satorius</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Zeiss</td><td>OPMI-6 CFC</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamid 0,5%</td><td>Fisher Pharmaceutical</td><td>390723</td><td></td></tr></tbody></table>

implantacja i ocena czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Ustanowienie eksperymentalnych modeli czerniaka naczyniówki jest wyzwaniem pod względem zdolności do indukowania guzów w prawidłowej lokalizacji. Ponadto trudności w obserwacji czerniaka tylnego naczyniówki in vivo ograniczają lokalizację guza i ocenę wzrostu w czasie rzeczywistym. Opisane tutaj podejście optymalizuje techniki ustalania czerniaka naczyniówki u myszy za pomocą wieloetapowej procedury wstrzykiwania komórek B16LS9 pod naczyniówkę. Aby umożliwić precyzyjne wstrzykiwanie do małych wymiarów błony naczyniowej myszy, cała procedura jest wykonywana pod mikroskopem. Najpierw tworzy się peritomia spojówki w okolicy grzbietowo-skroniowej oka. Następnie tworzy się drogę do przestrzeni podnaczyniówkowej poprzez wprowadzenie igły przez odsłoniętą twardówkę. Następnie wprowadza się igłę do przewodu pokarmowego i wstrzykuje komórki czerniaka do naczyniówki. Bezpośrednio po wstrzyknięciu stosuje się nieinwazyjną optyczną tomografię koherentną (OCT) w celu określenia lokalizacji i postępu guza. Odwarstwienie siatkówki jest oceniane jako predyktor miejsca i wielkości guza. Przedstawiona metoda umożliwia powtarzalną indukcję czerniaka zlokalizowanego naczyniówkowo u myszy oraz obrazowanie na żywo oceny wzrostu guza. W związku z tym stanowi cenne narzędzie do badania guzów wewnątrzgałkowych.

Oczy zostały zbadane za pomocą OCT natychmiast po wstrzyknięciu komórek B16LS9. Po wstrzyknięciu obserwowano miejscowe odwarstwienie siatkówki. Myszy wykazywały trzy wzorce RD: ogniskowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, górny panel), przeciek do ciała szklistego (<silna klasa="xfig"> Rysunek 2, środkowy panel) i rozszerzony RD (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, dolny panel). Wydłużony RD jest prawdopodobnie spowodowany uszkodzeniem spowodowanym wstrzyknięciem. Stwierdzono związek między wzorcem RD bezpośrednio po ws...

Niniejszy protokół opisuje implantację i ocenę czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii.

Implantacja i ocena czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Ustalenie guzów jako tylnej części oka jest trudne. Metoda ta umożliwia indukcję powtarzalnych guzów czerniaka naczyniówki u myszy oraz obrazowanie wzrostu guza na żywo w celu oceny. Protokół ten wykorzystuje obrazowanie na żywo OCT do oceny lokalizacji guzów już w momencie inokulacji komórek nowotworowych oraz do śledzenia wzrostu guza u żywych zwierząt.Czerniak błony naczyniowej gałki ocznej jest wyniszczającą chorobą, w której odsetek przerzutów wynosi blisko 50%. Opracowanie modeli eksperymentalnych ma kluczowe znaczenie dla postępu w badaniach nad nowymi możliwościami terapeutycznymi. Zaletą tej metody jest to, że natychmiastowa ocena skuteczności iniekcji pozwala dotrzeć do grup badanych z jednorodnymi nowotworami i stale śledzić je za pomocą obrazowania na żywo.Aby zbadać progresję guza. Wstrzykiwanie do oczu małej myszy wymaga wprawy. Możliwość wizualizacji wstrzykniętych komórek pozwala natychmiast ocenić swój sukces i w razie potrzeby powtórzyć z większą liczbą myszy.Procedurę zademonstruje dr Dimitri Gaber z Laboratorium Badawczego Okulistyki w Centrum Medycznym Kaplan. Na początek nałóż 0,4% miejscowego znieczulenia okulistycznego, oksybuprokainy na oba oczy znieczulonej myszy. Następnie nałóż miejscowo 0,5% tropikamidu na oba oczy w celu rozszerzenia źrenic, a następnie 1,4% hydroksyetylocelulozy jako lubrykant, aby uniknąć wysuszenia oczu.Obserwuj jedno oko myszy pod mikroskopem operacyjnym. Trzymaj powieki otwarte za pomocą sterylnych kleszczy wewnątrzgałkowych. Następnie przytrzymaj górną dolną spojówkę skroniową i pociągnij w kierunku pozycji podnosowej.Zabezpiecz tę pozycję, przytrzymując limbo-spojówkę przez cały czas trwania zabiegu. Za pomocą końcówki igły o rozmiarze 30 wykonaj małą peritomię spojówek w okolicy skroniowej grzbietowej około jednego do dwóch milimetrów za rąbkiem. Usuń nadmiar torebki ścięgien z otworu peritomii.Włóż końcówkę igły, aby przeniknąć do twardówki, tworząc ścieżkę do przestrzeni podnaczyniówkowej, aż brązowy kolor naczyniówki pojawi się przez odsłoniętą istotę białą twardówki. Załaduj komórki do sterylnej szklanej strzykawki Hamilton o pojemności 10 mikrolitrów zamontowanej za pomocą igły o rozmiarze 32 skręconej pod kątem 45 stopni. Wprowadzić igłę załadowanej strzykawki na około dwa milimetry do utworzonego przewodu pokarmowego i wstrzyknąć dwa mikrolitry zawiesiny komórek.Po wstrzyknięciu należy przytrzymać igłę na miejscu przez dwie do trzech sekund, aż cały płyn zostanie usunięty. Wyjąć igłę, delikatnie ją wyciągając, aby uniknąć wycieku z przewodu pokarmowego. Bezpośrednio po inokulacji komórek czerniaka należy obserwować wstrzyknięte oko zwierzęcia za pomocą skanów OCT.Na podstawie skanów sklasyfikuj odwarstwienie siatkówki lub wzorce RD według trzech kategorii: lokalnego RD, przecieku do ciała szklistego lub rozszerzonego RD. Otwórz oprogramowanie do analizy segmentacji OCT, aby przewidzieć wielkość guza na podstawie wysokości RD. Zmierz wysokość lokalnego RD w skanach OCT i podziel je na trzy grupy. W fazie pooperacyjnej stosować miejscowo 0,3% ofloksacyny.Na tym rysunku przedstawiono prognozę wzrostu guza opartą na OCT po wstrzyknięciu komórek podnaczyniówkowych. Myszy wykazywały trzy wzorce: RD, Focal, Leak To The Grereous i Extended RD. Stwierdzono związek między wzorcem RD bezpośrednio po wstrzyknięciu, a lokalizacją guzów pięć dni po wstrzyknięciu. Ogniskowe RD było związane ze wzrostem komórek nowotworowych, który był ograniczony do naczyniówki.Jednak obserwacja komórek w ciele szklistym po wstrzyknięciu u zwierząt wykazujących Focal RD wskazywała na wzrost guza w jamie ciała szklistego i naczyniówce. gdy po wstrzyknięciu zaobserwowano rozszerzony RD, guzy były rozproszone w całym naczyniówce i ciele szklistym po pięciu dniach. Zakres rozmiarów guzów indukowanych w tym modelu można podzielić na mały, średni i duży.Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy pomiaru wysokości RD w OCT po wstrzyknięciu i odpowiadający mu obraz dna oka, poziomy skan OCT wysokości i szerokości guza w piątym dniu po wstrzyknięciu oraz odpowiadający mu obraz dna oka, a także odpowiedni wycinek oka zabarwiony H&E wykazujący porównywalne pomiary guza. Przedstawiono tutaj pomiary objętości guza u myszy, u których wystąpiło małe, średnie lub duże RD bezpośrednio po wstrzyknięciu komórek. Regulacja siły wstrzyknięcia może wpływać na wielkość i lokalizację guza.Ważne jest, aby to skalibrować i ocenić wzorzec indukowanego odwarstwienia siatkówki przez OCT po wstrzyknięciu. Obrazowanie na żywo guzów naczyniówki jest ważnym narzędziem eksperymentalnym, które pozwala zbadać wpływ różnych czynników lub potencjalnych terapii na progresję nowotworu.

implantation-evaluation-melanoma-murine-choroid-via-optical-coherence

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje technikę obrazowania in vivo do wykrywania i ilościowego określania stanu zapalnego oka w mysim modelu poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Technika ta, znana jako optyczna tomografia koherentna (OCT), generuje obrazy przekroju poprzecznego oka o wysokiej rozdzielczości w celu oceny postępu choroby.

Obrazowanie optycznej koherentnej tomografii do oceny zapalenia błony naczyniowej oka w modelu mysim

Source: Jagodzińska, J., et. al., optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy . J. Vis. Exp. (2017)  W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.

Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Opisujemy nieinwazyjną platformę obrazowania zwierząt, która pozwala na wykrywanie, kwantyfikację i monitorowanie wzrostu i nawrotów raka jajnika. Ten model ksenoprzeszczepu dootrzewnowego naśladuje profil kliniczny pacjentek z rakiem jajnika.

Mysi model do nieinwazyjnego obrazowania w celu wykrywania i monitorowania nawrotu raka jajnika

Ten manuskrypt opisuje protokół obrazowania in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii spektralnej o wysokiej rozdzielczości (SD-OCT). Koncentruje się na komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w okolicy okołobrodawkowatej, z opisanymi kilkoma podejściami do skanowania i kwantyfikacji.

Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.

In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Poniższa procedura opisuje metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji guza melanocytowego w skórze grzbietowej myszy, przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy. Protokół ten opisuje makroskopową i mikroskopową inicjację czerniaka skóry.

Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów

Tutaj opisujemy technikę obrazowania in vivo wykorzystującą optyczną koherentną tomografię ułatwiającą diagnozę i ilościowy pomiar retinopatii u myszy.

Zastosowanie optycznej koherentnej tomografii do mysiego modelu retinopatii

Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Opisujemy metodę wykorzystującą ukierunkowane promieniowanie obwodowe do wywołania u myszy zachowania przypominającego zmęczenie. Wybrana, nieśmiertelna dawka napromieniania prowadzi do tygodniowego ograniczenia dobrowolnej aktywności związanej z bieganiem po kółkach.

Mysi model zmęczenia wywołanego promieniowaniem obwodowym

Poznaj metodę implantacji czerniaka naczyniówki u myszy z wykorzystaniem optycznej koherentnej tomografii. Technika umożliwia obrazowanie na żywo wzrostu guza i tworzenie jednorodnych grup badawczych.

Implantacja i ocena czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Przeglądaj więcej filmów