Innowacyjna wkładka drukowana w 3D zaprojektowana z myślą o prostych hodowlach komórkowych 2D i 3D

Protokół ten może być wykorzystany do zbadania licznych badań kulturowych i zapewnić nowe narzędzie do badania bezpośredniej komunikacji komórkowej. To nowe urządzenie pozwala zaoszczędzić znaczną ilość czasu na tworzeniu modelu hodowli i ma zastosowanie do różnych typów komórek, które wymagają określonej powłoki lub nie. Rzeczywiście, cztery komory wkładek wydrukowanych w 3D pozwalają na hodowlę różnych typów komórek w monowarstwie lub w 3D w ten sam sposób z różnymi kombinacjami.

Wkładki drukowane w 3D są trwalsze, bardziej elastyczne, skalowalne i mogą być wykorzystywane do projektowania modeli eksperymentalnych do badań nad fizjopatologiami, takimi jak immunologia czy androgeneza. Na początek wymieszaj dwa składniki, krzem spożywczy i katalizator dostarczony w zestawie w stosunku 10:1, używając szpatułki sterylizowanej 70% etanolem zgodnie z instrukcjami producenta. Nałóż wkładki na mieszankę silikonową za pomocą pęsety tak, aby mieszanina była równomiernie rozprowadzona na dolnej krawędzi wkładu.

Umieść wkładki w dołkach sześciodołkowej płytki i delikatnie dociśnij, aby upewnić się, że wkładki są w bliskim kontakcie z płytką, aby uniknąć wycieku pożywki do hodowli komórkowych. Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wspomóc proces krzepnięcia krzemu przez godzinę. Po zestaleniu wysterylizuj płytki z wkładkami, zanurzając je w kąpieli 70% etanolowej na 30 minut do jednej godziny.

Następnie wyrzuć alkohol przez pipetowanie i pozostaw płytkę do wyschnięcia na noc w kapturze do hodowli komórkowych. Aby wyhodować keratynocyty zewnętrznej osłonki korzenia i ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry, wyrzuć pożywkę z kolb i dodaj pięć mililitrów trypsyny, aby odłączyć komórki. Umieścić kolbę zawierającą keratynocyty zewnętrznej osłonki korzenia w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez pięć minut i inkubować kolbę zawierającą ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

W sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów wymieszaj roztwór trypsyny zawierający keratynocyty zewnętrznej osłonki korzenia z pięcioma mililitrami pożywki mezenchymalnych komórek macierzystych uzupełnionych 5% FBS i czynnikami wzrostu oraz ludzkimi komórkami śródbłonka mikronaczyniowego skóry z pięcioma mililitrami pożywki z komórek śródbłonka uzupełnionej 5% FBS i czynnikami wzrostu. Odwirować keratynocyty zewnętrznej osłonki korzenia i zawiesiny ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach odpowiednich pożywek.

Wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek z 10 mikrolitrami niebieskiego barwnika trypanowego i dodaj 10 mikrolitrów mieszanki do komory szkiełka liczącego. Włóż szkiełko zliczające do systemu zliczania komórek i wykryj numer komórki oraz żywotność. Po przygotowaniu zawiesiny komórek w stężeniu 50 000 komórek na mililitr w odpowiednim podłożu, rozprowadzić 800 mikrolitrów na jeden mililitr zawiesiny komórek do poszczególnych dużych komór i od 100 do 150 mikrolitrów do poszczególnych małych komór za pomocą pipety.

Zobacz keratynocyty w pożywce mezenchymalnych komórek macierzystych uzupełnionych 5% FBS i czynnikami wzrostu oraz ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry w pożywce komórek śródbłonka, uzupełnione 5% FBS i czynniki wzrostu w małych i innych dużych przedziałach. Umieść płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla lub w zwykłych warunkach, aby umożliwić adhezję komórek i/lub dojrzewanie. Opróżnij pożywkę hodowlaną z różnych przegródek wkładek za pomocą pipety.

Następnie przepłucz komórki jednym mililitrem ciepłego PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza w dużych komorach i 200 mikrolitrami w małych komorach. Dodaj trzy mililitry wspólnego podłoża wybranego tak, aby było kompatybilne ze wszystkimi typami komórek. Umieść płytkę zawierającą kokultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 24 do 48 godzin.

Odłącz komórki za pomocą trypsyny do liczenia zawiesiny komórek i sprawdź żywotność za pomocą barwienia trypanem niebieskim. Po zaobserwowaniu morfologii policz liczbę komórek różnych przedziałów podczas eksperymentu pod mikroskopem optycznym po 24 do 48 godzinach inkubacji. Najpierw usuń wkładki z sześciodołkowej płytki pod koniec eksperymentu, lekko przekręcając, a następnie usuń silikon z wkładek, ściągając go.

Umyj wkładki konwencjonalnymi detergentami do hodowli komórkowych i środkami czyszczącymi. Następnie wysterylizuj wkładki do wykorzystania w przyszłości w autoklawie lub zanurzając je w kąpieli z 70% etanolem na godzinę. Porównano fenotyp i żywotność komórek, przy czym 90% żywotności zaobserwowano w studzienkach sześciu płytek dołkowych, a przy 91% zaobserwowano w wydrukowanych w 3D wkładkach keratynocytów zewnętrznej osłonki korzeniowej.

Żywotność ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry wynosiła 85% w studzienkach płytki sześciodołkowej, podczas gdy 86% w wkładkach wydrukowanych w 3D. Pośrednia komunikacja komórkowa między keratynocytami a komórkami śródbłonka we wstawkach wydrukowanych w 3D wykazała, że w obecności keratynocytów we wkładkach proliferacja ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry znacznie wzrosła 1,5-krotnie po 24 godzinach i 3,1-krotnie po 48 godzinach w porównaniu z kontrolą. Wykazano jednak, że keratynocyty pożywki zewnętrznej osłonki korzenia znacznie zwiększają proliferację ludzkich komórek mikronaczyniowych śródbłonka skóry o 1,5 razy po 24 godzinach i 2,1 razy po 48 godzinach.

Wydrukowany w 3D model kohodowli wkładki został przetestowany w celu określenia wpływu keratynocytów na migrację ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry. W warunkach kontrolnych komórki śródbłonka migrowały i po 24 godzinach pokryły około 44% powierzchni rany. W obecności keratynocytów zaobserwowano znaczny wzrost migracji komórek śródbłonka mikronaczyniowego skóry człowieka, co pokazuje, że 43%67%i 99% powierzchni rany zostało pokryte odpowiednio po trzech, 12 i 24 godzinach.

Podobnie, migracja HDMEC zwiększa się w obecności keratynocytów pożywki zewnętrznej osłonki korzeniowej. Kluczowe jest zapewnienie uszczelnienia wkładu do płytki, aby zapobiec wyciekowi medium z komórek z jednej komory do drugiej. Można zastosować kilka zastosowań, takich jak proliferacja, migracja, testy tworzenia środków uspokajających, analiza DNA, RNA, białek i inne.