Chirurgia i testy behawioralne w modelu transpozycji nerwiaka piszczelowego u szczurów
6 stycznia 2023
Ten protokół opisuje model transpozycji nerwiaka piszczelowego, który pociąga za sobą uszkodzenie nerwu piszczelowego z późniejszą transpozycją końca nerwu proksymalnego w kierunku podskórnej pozycji przedpiszczelowej lub bocznej. Testy behawioralne bólu nerwiaka i hiperalgezji podeszwowej określa się ilościowo przy użyciu monofili von Freya.
Ta metoda pomaga znaleźć lepsze metody leczenia bólu nerwiaka. Zaletą tej techniki jest to, że można mierzyć zarówno ból nerwiaka, jak i ból uogólniony niezależnie w tym samym modelu powtórzenia. Model TNT jest szczególnie przydatny do badania bólu nerwiaka, ponieważ sam nerwiak może być mechanicznie stymulowany za pomocą monofili von Freya.
Zacznij od umieszczenia znieczulonego szczura na plecach z głową w lewo lub w prawo. Umieść nogę, która ma być operowana, w pobliżu chirurga. Wyegzorotuj dolną kończynę tylną tak, aby kostka przyśrodkowa była skierowana do góry.
Przed umieszczeniem szczura pod stereoskopowym mikroskopem chirurgicznym z 6-krotnym powiększeniem, zdezynfekuj ogolony obszar za pomocą co najmniej trzech naprzemiennych rund peelingu na bazie jodu i alkoholu. Zlokalizuj kolano i delikatnie wykonaj podłużne nacięcie o długości od dwóch do trzech centymetrów nad przyśrodkową stroną tylnej łapy od połowy łydki do kostki za pomocą skalpela. W razie potrzeby otwórz skórę i tkankę podskórną dalej za pomocą mikronożyczek, aż warstwy mięśni będą widoczne.
Zidentyfikuj powierzchowny pęczek nerwowo-naczyniowy jako dwie do trzech białych, fioletowych lub czerwonych linii, które mogą swobodnie poruszać się po warstwach mięśni. Utrzymuj pęczek nerwowo-naczyniowy w stanie nienaruszonym. Wypreparuj tył z tej wiązki.
Następnie przeprowadź sekcję, aby otworzyć powięź między mięśniami brzuchatymi łydki. Pomiędzy powięzią mięśni można znaleźć głębszy pęczek nerwowo-naczyniowy z nerwem piszczelowym, który jest około trzy razy większy niż powierzchowny pęczek nerwowo-naczyniowy. Użyj kości piszczelowej jako dodatkowego punktu orientacyjnego, ponieważ nerw piszczelowy leci tuż za kością piszczelową.
Aby wypreparować nerw piszczelowy z otaczających go wiązek naczyniowych, tępo przesuń nerw piszczelowy i przetnij odsłoniętą tkankę, która wykazuje pewne rozciągnięcie podczas poruszania nerwem piszczelowym. Po odsłonięciu całego nerwu piszczelowego umieść warstwy mięśni z powrotem, aby uniknąć odwodnienia nerwu do momentu rozwarstwienia skóry piszczelowej od mięśnia podskórnego. Aby wypreparować skórę piszczelową z podskórnej warstwy mięśniowej i wykonać podskórny tunel, przytrzymaj skórę do góry i wepchnij końcówkę w tkankę równoległą do skóry za pomocą narzędzia mikrochirurgicznego.
Upewnij się, że koniec tunelu znajduje się przedpiszczelowo lub bocznie, aby ułatwić dostęp do obszaru do badania nerwiaka. Po przecięciu nerwu piszczelowego na dystalnym końcu w pobliżu kostki zmień powiększenie mikroskopu na 10x lub 16x i zidentyfikuj epineurium nerwu piszczelowego proksymalnie do nacięcia wykonanego w pobliżu kostki. Lub, w przypadku bardziej proksymalnego rozwidlenia nerwu piszczelowego, zidentyfikuj epineurium zarówno przyśrodkowych, jak i bocznych gałęzi sadzarki proksymalnie do nacięcia wykonanego w pobliżu kostki.
Ostrożnie umieść 8-0 Nylonowy szew przez epineurium bliższego końca nerwu, przytrzymując epineurium pęsetą i umieszczając igłę między nerwem a epineurium z ugryzieniem około 0,5 milimetra. Ugryź igłą podskórnie na końcu tunelu podskórnego i pociągnij szew, aby przetransponować nerw bocznie do tunelu podskórnego. Zamocuj szew, robiąc węzeł.
Umieść grubszy szew 4-0 o ciemnym kolorze zaczerwienionym do utrwalonego końca nerwu bez wnikania w skórę. Upewnij się, że szew jest widoczny na zewnątrz skóry. Sprawdź, czy nerw pozostaje na swoim miejscu po poruszeniu łapą i mięśniami.
Odetnij końce szwu nieco dłuższym końcem szwu na 4-0, a następnie na 8-0 szew. Zmień powiększenie mikroskopu z powrotem na 6x i zamknij skórę szwami śródnaskórkowymi za pomocą 8-0 szew. Delikatnie oczyść skórę 0,9% chlorkiem sodu za pomocą bawełnianego wacika.
Jeśli w pomieszczeniu jest zimno, umieść poduszkę grzewczą pod częścią czystej klatki i umieść szczura w klatce pod ręcznikiem papierowym w wygodnej pozycji. Zapewnij łatwy dostęp do jedzenia i wody. Aby pobudzić sterylny nerw do nadwrażliwości, nałóż żyłkę na boczną stronę blisko granicy włosów, nie dotykając opuszków stóp.
Aby stymulować nerw piszczelowy pod kątem nadwrażliwości, nałóż żyłkę na środek powierzchni sadzarki tylnej łapy. W celu zbadania miejsca nerwiaka trzymaj szczury z nosem skierowanym w stronę fałdu łokciowego. Jeśli szczur jest trzymany w prawej ręce, jego lewa tylna łapa powinna swobodnie zwisać między prawym kciukiem a palcem wskazującym.
Po sprawdzeniu, czy szczur jest spokojny i wygodny podczas trzymania, na linii bazowej delikatnie umieść 15-gramową żyłkę na powierzchni piszczelowej odsłoniętej tylnej łapy. Po zabiegu umieść 15-gramową żyłkę na widocznym szwie i przyłóż do żyłki wystarczającą siłę, aby zgiąć włosy i przytrzymać je przez jedną sekundę. Von Frey z miejsca zajmującego się nerwiakiem wykazał, że na początku badania szczury reagowały na 10% do 15% zastosowań 15-gramowej żyłki.
Tydzień po operacji transpozycji nerwiaka piszczelowego odsetek odpowiedzi wzrósł z 45% do 50%Po stronie przeciwnej odpowiedzi po operacji były podobne do wartości wyjściowej. U około 20% szczurów nie rozwinął się bolesny nerwiak, a odsetek odpowiedzi nie wzrósł w porównaniu z wartością wyjściową. Pod koniec przeciętego i przetransponowanego kikuta nerwu piszczelowego 12 tygodni po operacji u wszystkich szczurów rozwinął się nerwiak.
Przecięcie nerwu piszczelowego zmniejszyło wrażliwość mechaniczną w środkowej części tylnej łapy po stronie sadzarki, unerwionej przez nerw piszczelowy. Niedowrażliwość obecna po tygodniu od zabiegu była istotnie różna od strony przeciwnej i wartości wyjściowej od trzech tygodni po operacji i utrzymywała się do 12 tygodni po operacji. W bocznej części tylnej łapy po stronie sadzarki, unerwionej przez nienaruszony nerw łydkowy, szczury rozwinęły znacząco różną nadwrażliwość mechaniczną od strony przeciwnej i linii wyjściowej od tygodnia po operacji.
Utrzymywał się przez 12 tygodni po zabiegu. W przypadku łapy przeciwległej wrażliwość mechaniczna nie była zaburzona w porównaniu z wartością wyjściową w obszarach unerwionych przez nerw łydkowy lub piszczelowy. Pamiętaj, aby utworzyć off-length nerwu piszczelowego, aby uzyskać zakres ruchu dla transpozycji bocznej.
Pamiętaj również, aby oznaczyć to miejsce nerwiaka ciemnym szwem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół modelu transpozycji neuromy nerwu piszczelowego, który obejmuje uszkodzenie nerwu piszczelowego, a następnie jego transpozycję w celu przeprowadzenia testów behawioralnych w kierunku bólu neuropatycznego i hiperalgezji z wykorzystaniem monowłókien Von Frey. Metoda ta pozwala na niezależną kwantyfikację zarówno bólu wywołanego przez neuromę, jak i bólu uogólnionego w ramach jednego modelu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Modele uszkodzeń nerwów
Wstęp
- Ból neuropatyczny wynikający z powstania neuromatu stanowi istotne wyzwanie kliniczne.
- Istniejące modele mogą nie pozwalać na niezależne pomiary bólu zlokalizowanego i uogólnionego.
- Model transpozycji nerwu piszczelowego zapewnia platformę do badania mechanizmów bólu.
Cel badania
- Opracowanie odtwarzalnego modelu do badania bólu w przebiegu neuromy.
- Przetestowanie skuteczności metod uśmierzania bólu.
- Ilościowa ocena reakcji behawioralnych związanych z uszkodzeniem i regeneracją nerwu.
Zastosowane metody
- Model obejmuje chirurgiczną dyssekcję nerwu piszczelowego u szczurów.
- W ocenie behawioralnej wykorzystuje się monofilamenty Von Frey do pomiaru hiperalgezji.
- Zabiegi chirurgiczne są przeprowadzane pod stereomikroskopem chirurgicznym z zastosowaniem precyzyjnych technik dyssekcji.
- Oceny pooperacyjne są wykonywane w punkcie wyjścia, po jednym tygodniu oraz do 12 tygodni po operacji.
Główne wyniki
- Badanie wykazało, że szczury wykazywały zwiększoną wrażliwość w miejscu powstania neuromy 12 tygodni po operacji.
- Od czterdziestu pięciu do pięćdziesięciu procent szczurów wykazało nasilenie reakcji na stymulację mechaniczną po operacji.
- Zaobserwowano również hiposensytywność, co wskazuje na zmiany w tempie reakcji w czasie w porównaniu z pomiarami bazowymi.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje nową metodę oceny bólu w przypadku neuromy oraz skuteczności stosowanych leczeń.
- Model ten pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów bólu i reakcji na uraz w przebiegu uszkodzenia nerwów obwodowych.
- Stanowi on podstawę dla przyszłych badań nad strategiami łagodzenia bólu.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Szczurzy model transpozycji neuromy piszczelowej (TNT) umożliwia niezależną kwantyfikację bólu specyficznego dla neuromy oraz bólu uogólnionego, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad bólem neuropatycznym. Model ten stanowi solidną platformę do oceny interwencji chirurgicznych i farmakologicznych ukierunkowanych na odmienne modalności bólu. Jego powtarzalność oraz możliwość oceny w dwóch miejscach zwiększają pewność prognostyczną w rozwoju translacyjnych terapii przeciwbólowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów bólu poprzez izolację allodynii wywołanej przez neurynom oraz nerw łydkowy.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dla potencjalnych leków przeciwbólowych oraz interwencji chirurgicznych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie miejscowych od uogólnionych reakcji bólowych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowany system in vivo do ilościowych testów behawioralnych bólu z wykorzystaniem monofilamentów Von Frey.
- Umożliwia powtarzalny pomiar nadwrażliwości mechanicznej w określonych miejscach anatomicznych.
- Wspiera standaryzację testów w celu zapewnienia porównywalności wyników między różnymi badaniami i zespołami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z istotnymi dla choroby punktami końcowymi bólu neuropatycznego obserwowanymi w klinicznych przypadkach neuromów.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu walidacji celu w fazie odkrywania do przedklinicznych testów skuteczności terapeutyków przeciwbólowych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, zapewniając trwałe i mierzalne fenotypy bólu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model TNT wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej w badaniach nad bólem neuropatycznym, stanowiąc pomost między badaniami nad mechanizmami a oceną kandydatów w badaniach translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zaangażowania szlaków bólowych oraz mechanizmów specyficznych dla neuromy.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, specyficznych dla miejsca badania odczytów behawioralnych do oceny związków lub interwencji.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie reakcji bólowych w różnych punktach czasowych i grupach terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Zapewnia trwałe fenotypy bólu odpowiadające klinicznemu bólowi neuromy do walidacji przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowany, reprodukowalny model możliwy do adaptacji w różnorodnych programach badań nad bólem.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych w leczeniu bólu oraz w badaniach mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację behawioralnych testów bólu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w przypadku kandydatów na leki przeciwbólowe.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów dotyczących analgetyków i interwencji chirurgicznych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagane jest doświadczenie w mikrochirurgii oraz znajomość neuroanatomii szczura.
- Konieczny jest dostęp do stereomikroskopii oraz infrastruktury do testów behawioralnych.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja protokołów chirurgicznych i behawioralnych pomiędzy zespołami.
- Model jest ograniczony do szczurów; testowanie miejsca powstania neuromy nie jest możliwe u myszy.
- U około 20% szczurów może nie rozwinąć się bolesna neuroma, co wymaga starannego doboru kohorty.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:40
Anesthesia and Preparation
1:12
Surgery and Post‐Surgical Treatment
4:30
Von Frey Testing of the Plantar Side of the Hind Paws and Neuroma Site
5:25
Results: Behavioral Testing of Neuroma Pain and Plantar Hyperalgesia
6:57
Conclusion
