Name: Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj generowanie trójwymiarowych organoidów jamy ustnej i przełyku u myszy do modelowania raka płaskonabłonkowego przełyku. Ta metoda umożliwia badanie zmian molekularnych i testowanie nowych strategii terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Wspólnemu Zasobowi (Cytometria Przepływowa, Patologia Molekularna oraz Mikroskopia Konfokalna i Specjalistyczna) w Herbert Irving Comprehensive Cancer Center na Uniwersytecie Columbia za wsparcie techniczne. Dziękujemy doktorom Alanowi Diehlowi, Adamowi J. Bassowi i Kwok-Kin Wongowi (NCI P01 Mechanizmy Karcynogenezy Przełyku) oraz członkom laboratoriów Rustgi i Nakagawa za pomocne dyskusje. Badanie to było wspierane przez następujące granty NIH: P01CA098101 (H.N. i A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. i H.N.) oraz P30CA013696 (A.K.R.). H.N. i C.L. są laureatami nagrody Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. jest laureatem nagrody Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. jest laureatem nagrody The Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) oraz nagrody American Association for Cancer Research Award. J.G. jest laureatem nagrody Amerykańskiego Towarzystwa Gastroenterologicznego (AGA).

<ol><li>Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Esophageal carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).</li>
<li>Dotto, G. P., Rustgi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Squamous+cell+cancers%3A+A+unified+perspective+on+biology+and+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics.</a> Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).</li>
<li>Giroux, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+keratin+15%2B+esophageal+progenitor+cells+contribute+to+homeostasis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).</li>
<li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li>
<li>Kinugasa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+SOD2+regulates+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+populations+defined+by+differential+CD44+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression.</a> Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).</li>
<li>Whelan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+supports+generation+of+cells+with+high+CD44+expression+via+modulation+of+oxidative+stress+and+Parkin-mediated+mitochondrial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance.</a> Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).</li>
<li>Natsuizaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Notch1+and+Notch3+promotes+EMT+and+tumor+initiation+in+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma.</a> Nature Communications. 8 (1), 1758(2017).</li>
<li>Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+3D+culture+systems+as+modeling+tools+in+esophageal+epithelial+pathobiology+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).</li>
<li>Sachdeva, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+cellular+origin+and+progression+of+esophageal+cancer+using+esophageal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids.</a> Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+targeting+of+the+cyclin+D1+oncogene+by+an+Epstein-Barr+virus+promoter+in+transgenic+mice+causes+dysplasia+in+the+tongue%2C+esophagus+and+forestomach%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach.</a> Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).</li>
<li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li>
<li>Opitz, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+human+oral-esophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A mouse model of human oral-esophageal cancer.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).</li>
<li>Stairs, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+p120-catenin+results+in+a+tumor+microenvironment+with+inflammation+and+cancer+that+establishes+it+as+a+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene.</a> Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).</li>
<li>Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+cavity+and+esophageal+carcinogenesis+modeled+in+carcinogen-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice.</a> Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).</li>
<li>Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+cyclin+D1+overexpression+and+zinc+deficiency+disrupts+cell+cycle+and+accelerates+mouse+forestomach+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis.</a> Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440(2021).</li>
<li>Hisha, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+lingual+organoid+culture+system%3A+generation+of+organoids+having+mature+keratinized+epithelium+from+adult+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells.</a> Scientific Reports. 3, 3224(2013).</li>
<li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Nguyen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B21+alters+esophageal+epithelial+barrier+function+by+attenuation+of+claudin-7+in+eosinophilic+esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis.</a> Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).</li>
<li>Sherrill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+expansion+of+the+eosinophilic+esophagitis+transcriptome+by+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing.</a> Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).</li>
<li>Ruffner, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+stimulation+augments+esophageal+barrier+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity.</a> Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).</li>
<li>Kabir, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomic+analysis+reveals+cellular+diversity+of+murine+esophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li>
<li>Shimonosono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+metabolism+enriches+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+that+survive+oxidative+stress+via+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy.</a> Biomolecules. 11 (10), 1479(2021).</li>
<li>Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+organoids%3A+An+untapped+platform+for+studying+host-microbiome+interactions+in+esophageal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers.</a> Microorganisms. 9 (11), 2182(2021).</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+cooperates+with+inflammation-mediated+stat3+activation+in+the+malignant+transformation+of+foregut+basal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W opisanych tutaj protokołach istnieje kilka kluczowych etapów i kwestii związanych z generowaniem i analizą prywatnego inwestora. Aby zapewnić odtwarzalność i rygor w eksperymentach w ramach prywatnego inwestora, ważne są zarówno kontrpróby biologiczne, jak i techniczne. W przypadku kontrprób biologicznych na ogół wystarczają dwie do trzech niezależnych myszy z ESCC na warunki doświadczalne. Jednak odpowiednia liczba kontrprób biologicznych może się różnić w zależności od parametrów, które mają być badane w poszczególny...

Rak płaskonabłonkowy przełyku (ESCC) jest najbardziej śmiertelnym z ludzkich raków płaskonabłonkowych, ze względu na późną diagnozę, oporność na terapię i przerzuty1,2. ESCC powstaje z warstwowego nabłonka płaskonabłonkowego, który wyściela powierzchnię światła przełyku. Nabłonek płaskonabłonkowy składa się z proliferacyjnych komórek podstawnych i zróżnicowanych komórek w warstwie komórek nadpodstawnych. W warunkach fizjologicznych komórki podstawne wyrażają markery, takie jak p63, Sox2 i cytokeratyna K5 i K14, podczas gdy komórki zróżnicowane wyrażają ekspresję K4, K13 i IVL. Same komórki podstawne są niejednorodne i zawierają domniemane komórki macierzyste zdefiniowane przez markery, takie jak K153 i CD734. W homeostazie komórki podstawne ulegają postmitotycznemu różnicowaniu końcowemu w warstwie komórek nadpodstawnych, podczas gdy zróżnicowane komórki migrują i złuszczają się do światła, aby zakończyć odnowę nabłonka. Przypominając komórki, z których pochodzą, ESCC wykazuje różnicowanie komórek płaskonabłonkowych w różnym stopniu. ESCC często towarzyszą wieloogniskowe histologiczne zmiany prekursorowe, znane jako neoplazja śródnabłonkowa (IEN) lub dysplazja, obejmująca atypowe komórki podstawne. Oprócz zmian nabłonkowych, ESCC wykazuje przebudowę tkanek w obrębie przedziału podnabłonkowego, gdzie następuje aktywacja fibroblastów związanych z rakiem (CAF) i rekrutacja komórek immunologicznych/zapalnych w celu wspierania mikrośrodowiska sprzyjającego nowotworowi.
Patogeneza ESCC obejmuje zmiany genetyczne i narażenie na środowiskowe czynniki ryzyka. Kluczowe zmiany genetyczne obejmują inaktywację genów supresorowych TP53 i CDKN2A (p16INK4A) oraz aktywację onkogenów CCND1 (cyklina D1) i EGFR, które prowadzą do upośledzenia funkcji punktu kontrolnego cyklu komórkowego, nieprawidłowej proliferacji i przeżycia w stresie genotoksycznym związanym z narażeniem na środowiskowe czynniki rakotwórcze. Rzeczywiście, zmiany genetyczne ściśle oddziałują na behawioralne i środowiskowe czynniki ryzyka, najczęściej palenie tytoniu i spożywanie alkoholu. Dym tytoniowy zawiera substancje rakotwórcze dla ludzi, takie jak aldehyd octowy, który jest również głównym metabolitem alkoholu. Aldehyd octowy indukuje addukty DNA i wiązania krzyżowe między niciami DNA, prowadząc do uszkodzenia DNA i akumulacji mutacji DNA oraz niestabilności chromosomalnej. Biorąc pod uwagę nadmierne bodźce mitogenne i nieprawidłową proliferację w wyniku aktywacji onkogenu, złośliwa transformacja komórek nabłonka przełyku jest ułatwiona przez mechanizmy radzenia sobie ze stresem genotoksycznym, w tym aktywację przeciwutleniaczy, autofagię i przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT). Co ciekawe, te funkcje cytoprotekcyjne są często aktywowane w rakowych komórkach macierzystych ESCC (CSC), które charakteryzują się wysoką ekspresją CD44 (CD44H) i mają zdolność inicjacji nowotworu, inwazji, przerzutów i oporności na terapię5,6,7.
ESCC został zamodelowany w hodowli komórkowej i na modelach gryzoni8,9. W ciągu ostatnich trzech dekad opracowano solidne, genetycznie modyfikowane mysie modele ESCC. Należą do nich myszy transgeniczne CCND1 i EGFR10,11 oraz myszy z nokautem p53 i p120Ctn12,13. Jednak pojedyncze zmiany genetyczne zazwyczaj nie powodują szybkiego początku ESCC. Wyzwanie to zostało przezwyciężone dzięki zastosowaniu czynników rakotwórczych przełyku, które dobrze podsumowują zmiany genetyczne człowieka w ESCC14. Na przykład tlenek 4-nitrochinolino-1 (4NQO) przyspiesza rozwój ESCC u transgenicznych myszy CCND115. W ostatnich latach domniemane komórki macierzyste nabłonka przełyku, komórki progenitorowe i ich odpowiednie losy były badane w modelach myszy śledzących linię komórkową3,4. Co więcej, te myszy śledzące linię komórkową zostały wykorzystane do zbadania komórek pochodzenia ESCC i tego, w jaki sposób takie komórki powodują powstawanie CSC CD44H za pomocą konwencjonalnej histologii i charakterystyki molekularnej opartej na omice7.
Jednym z pojawiających się obszarów związanych z tymi modelami myszy jest nowatorskie zastosowanie technik hodowli komórkowych do analizy żywych komórek ESCC i komórek prekursorowych w trójwymiarowym (3D) systemie organoidowym, w którym architektura oryginalnych tkanek jest rekapitulowana ex vivo7,8,9. Te organoidy 3D są szybko hodowane z zawiesiny jednokomórkowej wyizolowanej z tkanek myszy, w tym guzów pierwotnych i przerzutowych (np. Uszkodzenia węzłów chłonnych, płuc i wątroby). Komórki są zanurzone w ekstrakcie z błony podstawnej (BME) i karmione dobrze zdefiniowaną, wolną od surowicy pożywką do hodowli komórek. Organoidy 3D rosną w ciągu 7-10 dni, a powstałe kuliste struktury są podatne na subhodowlę, kriopkonserwację i testy do analizy różnych właściwości i funkcji komórkowych, w tym markerów CSC, EMT, autofagii, proliferacji, różnicowania i apoptotycznej śmierci komórki.
Te metody mogą być szeroko stosowane do kultur organoidowych 3D utworzonych z dowolnej warstwowej tkanki nabłonka płaskonabłonkowego, takiej jak błona śluzowa głowy i szyi (jama ustna, język, gardło i krtań), a nawet przedni żołądek. Błona śluzowa głowy i szyi przylega do przełyku, a obie tkanki mają podobną organizację, funkcję i podatność na choroby. Zarówno rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC), jak i ESCC mają wspólne zmiany genetyczne i środowiskowe czynniki ryzyka związane ze stylem życia, takie jak narażenie na palenie tytoniu i alkohol. Podkreślając to podobieństwo, myszy leczone mimetykiem dymu tytoniowego 4NQO łatwo rozwijają zarówno HNSCC, jak i ESCC. Biorąc pod uwagę łatwość, z jaką opisane poniżej protokoły można zastosować do modelowania HNSCC, dołączamy szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia kultur organoidów 3D z tych zmian.
Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły generowania mysich organoidów 3D przełyku (MEO) reprezentujących normalne, przednowotworowe i ESCC zmiany rozwojowe u myszy leczonych 4NQO. Można wykorzystać różne szczepy myszy, w tym popularne szczepy laboratoryjne, takie jak C57BL/6 i identyfikowalne linie komórkowe oraz inne genetycznie modyfikowane pochodne. Kładziemy nacisk na kluczowe etapy, w tym izolację normalnego lub chorego mysiego nabłonka przełyku, przygotowanie zawiesin jednokomórkowych, hodowlę i monitorowanie rosnących organoidów 3D, subkulturę, krioprezerwację i przetwarzanie do kolejnych analiz, w tym morfologii i innych zastosowań.

<table><tbody><tr><td>0,05% trypsyna-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-300-120</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>0,4% Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>1 ml strzykawka tuberkulinowa bez igły</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>100 &mikro; m Sitko do komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>15 mL rurki stożkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Końcówki do mikropipet L o szerokim otworze</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>212361A</td><td></td></tr><tr><td>21 G igły</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-556-006</td><td></td></tr><tr><td>4-tlenek nitrochinolino-1 (4NQO)</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>NO250</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurki stożkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-565-270</td><td></td></tr><tr><td>6 dołków talerz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12556004</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m sitko komórkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>99,9% glikol etylenowo-propylenowy</td><td>SK picglobal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>15290018</td><td>Stężenie magazynowe 250 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 0,5 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Stężenie zapasowe 100x, stężenie końcowe 1x</td></tr><tr><td>suplement B-27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Stężenie zapasowe 50x, stężenie końcowe 1x</td></tr><tr><td>Inkubator Bacto</td><td>agar BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkubator, np. Heracell 150i</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026406</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Countess II FL Automatyczny licznik komórek Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-337-7D</td><td></td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>72-07-5022</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Corning</td><td>354235</td><td>Stężenie podstawowe 50 U/ml, stężenie końcowe 2,5&ndash; Nożyczki preparacyjne 5 U/ml</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>25870-002</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) firmy DulbeccoThermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td>Stężenie zapasów 1x</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania</td><td>Corning</td><td>432002</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G7-500</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Stężenie wyjściowe 100x, stężenie końcowe 1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Stężenie materiału 1 M, stężenie końcowe 10 mM</td></tr><tr><td>Płyta grzejna/mieszadło</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Lab Kąpiel z kulkami pancernymi (lub kąpiel wodna)</td><td>VWR</td><td>89409-222</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Waga laboratoryjna</td><td>Ohaus</td><td>71142841</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>Ekstrakt z błony podstawnej Matrigel (BME)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka Minispin</td><td>Eppendorf</td><td>22620100</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Stojak na probówki do mikrowirówek</td><td>Southern Labware</td><td>0061</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td>Stężenie magazynowe 100x, stężenie końcowe 1x</td></tr><tr><td>N-acetylocysteina (NAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>Stężenie wyjściowe 0,5 M, stężenie końcowe 1</td></tr><tr><td>mM Folia Parafilm M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>MiliporeSigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta patologiczna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z kontrastem fazowym</td><td>Nikon</td><td></td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi naskórkowy czynnik wzrostu (mEGF)</td><td>Peprotech</td><td>315-09-1mg</td><td>Stężenie standardowe 500 ng / &mikro; L, stężenie końcowe 100 ng / ml</td></tr><tr><td>RN kondycjonowane komórkowo podłoże eksprymujące R-Spondin1 i Noggin (RN CM)</td> <td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dostępne za pośrednictwem rdzenia organoidów i hodowli komórkowych na żądanie, stężenie końcowe 2%</td></tr><tr><td>Wirówka Sorval ST 16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004380</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>inhibitor trypsyny sojowej (STI)</td><td>MilliporeSigma</td><td>T9128</td><td>Stężenie zapasowe 250 i mikro; g/ml</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-285-562 PM</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>Stężenie zapasowe 10 mM, stężenie końcowe 10 i mikro; M</td></tr></tbody></table>

modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3d

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Rak płaskonabłonkowy przełyku (ESCC) jest powszechny na całym świecie, odpowiada za 90% wszystkich przypadków raka przełyku każdego roku i jest najbardziej śmiertelnym ze wszystkich ludzkich raków płaskonabłonkowych. Pomimo niedawnych postępów w definiowaniu zmian molekularnych towarzyszących inicjacji i rozwojowi ESCC, rokowanie pacjentów pozostaje niekorzystne. Funkcjonalna adnotacja tych zmian molekularnych jest niezbędnym kolejnym krokiem i wymaga modeli, które zarówno rejestrują cechy molekularne ESCC, jak i mogą być łatwo i niedrogo manipulowane w celu adnotacji funkcjonalnej. Myszy leczone mimetycznym tlenkiem 4-nitrochinoliny (4NQO) dymu tytoniowego przewidywalnie tworzą ESCC i preneoplazję przełyku. Warto zauważyć, że zmiany 4NQO powstają również w jamie ustnej, najczęściej na języku, a także w przedżołądku, które mają wspólny warstwowy nabłonek płaskonabłonkowy. Jednak myszami tymi nie można po prostu manipulować w celu testowania hipotez funkcjonalnych, ponieważ generowanie izogenicznych modeli myszy jest czasochłonne i zasobożerne. W tym celu pokonujemy to ograniczenie, generując trójwymiarowe (3D) organoidy pochodzące z pojedynczych komórek od myszy leczonych 4NQO, aby scharakteryzować mysie komórki ESCC lub komórki przednowotworowe ex vivo. Organoidy te wychwytują istotne cechy ESCC i preneoplazji przełyku, mogą być tanio i szybko wykorzystane do tworzenia modeli izogenicznych i mogą być wykorzystane do eksperymentów transplantacji syngenicznych. Pokazujemy, jak generować organoidy 3D z normalnej, przednowotworowej i SCC mysiej tkanki przełyku oraz utrzymywać i kriokonserwować te organoidy. Zastosowania tych wszechstronnych organoidów są szerokie i obejmują wykorzystanie genetycznie modyfikowanych myszy i dalszą charakterystykę za pomocą cytometrii przepływowej lub immunohistochemii, generowanie izogenicznych linii organoidowych przy użyciu technologii CRISPR oraz badania przesiewowe leków lub przeszczepy syngeniczne. Wierzymy, że powszechne zastosowanie technik zademonstrowanych w tym protokole przyspieszy postęp w tej dziedzinie w walce z poważnym obciążeniem ESCC.

Ten protokół opisuje proces generowania mysich organoidów przełyku (MEO) z normalnej tkanki przełyku lub tkanki nowotworowej ESCC od myszy leczonych 4NQO, zgodnie ze specyficznym schematem leczenia składającym się z 16 tygodni 4NQO podawanego w wodzie pitnej, po którym następuje okres obserwacji od 10 tygodni do 12 tygodni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Myszy są następnie poddawane eutanazji w celu wycięcia języka lub tkanki przełyku (<silna klasa="xfig">Rysunek 2 i <silna klasa="xfig"> Rysunek 3). Opisujemy metodę izo...

Ten protokół opisuje kluczowe kroki do wygenerowania i scharakteryzowania mysich organoidów 3D ustno-przełykowych, które reprezentują normalne, przednowotworowe i płaskonabłonkowe zmiany rakowokomórkowe wywołane przez chemiczną kancerogenezę.

Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Rak płaskonabłonkowy przełyku, ESCC, jest śmiertelny i powszechny na całym świecie. Trójwymiarowe organoidy mogą być wykorzystane do przyspieszenia postępu w tej dziedzinie w celu zwalczania poważnego obciążenia ESCC. Organoidy 3D pochodzące z pojedynczych komórek od myszy leczonych 4NQO mogą być łatwo i niedrogo manipulowane w celu funkcjonalnej adnotacji zmian molekularnych towarzyszących inicjacji i rozwojowi ESCC.Model ten pozwala uchwycić niejednorodność genetyczną nowotworów wywołanych mutagenem. W związku z tym organoidy te stanowią fizjologicznie istotną platformę do testowania nowych strategii terapeutycznych lub identyfikowania istotnych zmian genetycznych napędzających nowotworzenie nowotworów. W demonstracji sekcji zwierząt i pobierania narządów pomoże Yasuto Tomita, współpracownik personelu, a przygotowanie organoidu do procedury zatapiania parafiny zademonstruje Norihiro Matsuura, doktor habilitowany z mojego laboratorium.Na początek otwórz skórę myszy poddanych eutanazji, szczypiąc futro w środkowej części brzucha i za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj czaszkowo-ogonowe, brzuszne nacięcie linii środkowej od dolnej części brzucha do podbródka. Zaczynając od nacię

modeling-oral-esophageal-squamous-cell-carcinoma-in-3d-organoids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Organoidy pochodzące z nowotworów są rodzajem modelu hodowli komórek 3D, który może zachować patologiczne cechy i specyficzną dla narządu linię komórkową guzów. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują organoidy z guza prostaty z genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy.

Przygotowanie organoidów z guzów: model guza 3D in vitro

Ten film opisuje technikę hodowli in vitro do generowania ludzkich organotypowych konstruktów przełyku poprzez kokulturę pierwotnych ludzkich fibroblastów przełyku i płaskonabłonkowych komórek nabłonka w zdecelularowanym rusztowaniu świni. Te modele hodowli 3D naśladują funkcję i fizjologię swoich odpowiedników tkankowych in vivo.

Model hodowli tratwy 3D przełyku: technika hodowli in vitro do generowania modelu błony śluzowej przełyku

Ten manuskrypt opisuje produkcję, charakterystykę i potencjalne zastosowania konstruktu przełyku 3D wykonanego z normalnego pierwotnego ludzkiego fibroblastu przełyku i płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych umieszczonych w pozbawionym komórek rusztowaniu wieprzowym. Wyniki wskazują na tworzenie się dojrzałego nabłonka warstwowego podobnego do normalnego ludzkiego przełyku.

Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej

Tutaj prezentujemy protokół generowania 3D organotypowego modelu skóry czerniaka sferoidalnego, który podsumowuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządu/guza in vivo, ale jednocześnie uwzględnia systematyczną interwencję eksperymentalną.

Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

System modelowy in vitro został opracowany w celu uchwycenia zmian architektonicznych tkanek podczas progresji raka płaskonabłonkowego płuc (LUSC) w trójwymiarowej (3D) kohodowli z fibroblastami związanymi z rakiem (CAF). Ten system organoidów stanowi unikalną platformę do badania ról różnych zmian wewnętrznych i zewnętrznych komórek nowotworowych, które modulują fenotyp guza.

Wielowymiarowy system kokultury do modelowania progresji raka płaskonabłonkowego płuca

Artykuł opisuje stopniowe różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do trójwymiarowych organoidów całego płuca zawierających zarówno proksymalne, jak i dystalne komórki nabłonkowe płuc wraz z mezenchymą.

Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc

Ten protokół opisuje metody subhodowli i kriokonserwacji organoidów gruczolakoraka przełyku z trawieniem pojedynczych komórek i bez niego, aby umożliwić badaczom wybór odpowiednich strategii w oparciu o ich eksperymentalny projekt.

Subkultura i kriokonserwacja organoidów gruczolakoraka przełyku: plusy i minusy trawienia pojedynczych komórek

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Współhodowle organoidów i fibroblastów dostarczają modelu do badania niszy komórek macierzystych in vivo. W tym miejscu opisano protokół dla kokultur organoidów i fibroblastów przełyku. Dodatkowo obrazowanie całego mocowania służy do wizualizacji interakcji fibroblast-organoid.

Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

Niniejszy protokół opisuje tworzenie i analizę histologiczną modeli organoidów przełyku, które reprezentują różne etapy progresji nowotworu. Metoda ta umożliwia naukowcom badanie zmian w morfologii komórek, organizacji przestrzennej i wzorcach ekspresji markerów molekularnych podczas przejścia od tkanek normalnych do nowotworowych.

Ustalenie i analiza histologiczna organoidów przełyku modelujących progresję od tkanek prawidłowych do nowotworowych

Poznaj generowanie trójwymiarowych organoidów jamy ustnej i przełyku u myszy do modelowania raka płaskonabłonkowego przełyku. Ta metoda umożliwia badanie zmian molekularnych i testowanie nowych strategii terapeutycznych.

Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

Przeglądaj więcej filmów