Name: Test na zieleń malachitową w celu odkrycia inhibitorów białka szoku cieplnego 90 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj test na zieleń malachitową do wykrywania inhibitorów białka szoku cieplnego 90 (Hsp90). Ta prosta i czuła metoda kolorymetryczna umożliwia szybki pomiar nieorganicznego fosforanu zwalnianego podczas hydrolizy ATP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez program Korea Research Fellowship (KRF), doktora habilitowanego Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF), finansowanego przez ministerstwo nauki i ICT (NRF-2019H1D3A1A01102952). Autorzy są wdzięczni grantowi stacjonarnemu KIST oraz grantowi Ministerstwa Oceanów i Rybołówstwa nr 2MRB130 za udzielenie pomocy finansowej na ten projekt.

1. Test na skalę laboratoryjną malachitu
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu do badania
	<ol>
		<li>Przygotować bufor do oznaczania, zgodnie ze składem i preparatem przedstawionymi w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wzorców fosforanowych
	<ol>
		<li>Użyć wzorca fosforanowego 1 mM, znajdującego się w zestawie do oznaczania fosforanów z zielenią malachitową (przechowywanym w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Odpipetować 40 μl 1 mM wzorca fosforanowego w 960 μl ultraczystej wody, aby otrzymać 40 μM roztworu fosforanu (roztwór premiksu). Dodać roztwór premiksu z ultraczystą wodą, zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać seryjne rozcieńczenie fosforanu od 0 do 40 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie drożdży Hsp90
	<ol>
		<li>Użyj drożdży Hsp90 o stężeniu podstawowym glicerolu 0,66 mg/ml. Rozmrozić na lodzie tuż przed użyciem.</li>
		<li>Użyj 8 μl (5,98 μg, 0,80 μM) drożdży Hsp90, aby zmierzyć aktywność ATPazy. Sprawdzić, czy różnica gęstości optycznej po dodaniu odczynnika w kolorze zieleni malachitowej między ślepą próbą a kontrolą dodatnią wynosi co najmniej 0,5 i mniej niż 1,0. W tym przypadku stwierdzono, że różnica absorbancji między ślepą próbą (bez Hsp90) a kontrolą pozytywną (z Hsp90) wynosi 0,510.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie ATP
	<ol>
		<li>Przenieść 1 mg ATP do fiolki zawierającej 453,39 μl ultraczystej wody, aby uzyskać 4 mM roztworu podstawowego. Wykonaj obliczenia wagowe na podstawie bezwodnego ATP (masa cząsteczkowa [m.w.] = 551,14). Przygotuj ATP na świeżo, ponieważ z czasem może ulec spontanicznej hydrolizie.</li>
		<li>Dodać 4 μl roztworu podstawowego ATP do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie studzienki 0,2 mM (końcowa całkowita objętość studzienki testowej 80 μl). Dodaj ATP jako ostatni składnik do reakcji, używając pipety wielokanałowej, tak aby wszystkie reakcje rozpoczęły się jednocześnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat geldanamycyny (GA)
	<ol>
		<li>Przygotować 10 mM zapasu GA rozpuszczając 1 mg w 178,37 μl DMSO (m.w. = 560.64). Używając roztworu podstawowego, przygotować roztwór 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM i 0,00128 mM w DMSO przez seryjne rozcieńczanie.</li>
		<li>Dodaj 2 μl tych roztworów podstawowych do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie studzienki odpowiednio 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM i 0,000032 mM.</li>
		<li>Przygotować studzienki zgodnie z opisem w tabeli 2 i tabeli 3, przy czym studzienki zawierają ślepą próbę (bufor + woda + DMSO) i kontrolę ujemną (Hsp90 w buforze + woda + DMSO). Studnie zawierające GA (Hsp90 w buforze + woda + GA) służą jako kontrola pozytywna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płytek studzienkowych i kolejność dodawania
	<ol>
		<li>Przygotować płytki 96-dołkowe o układzie przedstawionym w tabeli 2. W przypadku związków, które wykazują absorbancję przy 620 nm, należy przygotować oddzielną studzienkę do rejestracji absorbancji przy tej długości fali. Nie należy przygotowywać oddzielnej studzienki dla GA, ponieważ GA nie wykazuje absorbancji przy 620 nm dla stężenia użytego w teście.</li>
		<li>Przygotować każdy składnik z całkowitą objętością każdego składnika, jak przedstawiono w tabeli 3.</li>
		<li>Skonfiguruj studnie testowe, dodając ultraczystą wodę do każdej studzienki. Następnie dodać wymaganą ilość buforu do oznaczania i roztwór złożony (na przykład roztwór GA).</li>
		<li>Następnie dodaj Hsp90 do odpowiednich dołków i potrząsaj płytkami przez 2 minuty na wytrząsarce do płytek w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 4 μl roztworu ATP za pomocą pipety wielokanałowej. Zawiń talerz w folię aluminiową i potrząsaj przez 2 minuty na wytrząsarce talerzowej (200 obr./min) w temperaturze pokojowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i dodanie odczynnika zieleni malachitowej
	<ol>
		<li>Odczynnik zieleni malachitowej składa się z odczynników A (molibdenian amonu w 3M HCl) i B (zieleń malachitowa i alkohol poliwinylowy). Przed użyciem doprowadzić odczynnik do temperatury pokojowej. Wymieszać odczynniki A i B w stosunku 100:1 (1 000 μL: 10 μL). Przygotuj go w ciągu 3 godzin przed użyciem, ponieważ jest niestabilny i zaczyna się rozkładać po 3 godzinach.</li>
		<li>Po 3 godzinach kroku 1.6.5 zatrzymać reakcję, dodając 20 μl odczynnika z zieleni malachitowej, dodawanego w tej samej kolejności co ATP, za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
		<li>Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej zmierzyć absorbancję płytki przy długości fali 620 nm w czytniku płytek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe inhibitorów Hsp90 za pomocą testu zieleni malachitowej
UWAGA: Protokół badań przesiewowych o wysokiej przepustowości jest podobny do metodologii stosowanej w skali laboratoryjnej. Ostateczna objętość studzienki w każdym przypadku wynosi 80 μl. Istnieje jednak niewielka różnica w kolejności dodawania odczynników. W metodzie laboratoryjnej wyróżnia się pięć etapów dodawania roztworu (34 μl wody, 32 μl buforu, 2 μl związku w DMSO, 8 μl Hsp90 i wreszcie 4 μl roztworu ATP). Natomiast w przypadku HTS wyróżnia się trzy etapy dodawania (40 μL roztworu buforowego zawierającego drożdże Hsp90, 2 μL DMSO w 18 μL wody zawierającej związki, a na końcu 20 μL ATP rozpuszczonego w wodzie). Minimalna ilość roztworu, którą można dokładnie odpipetować w układzie HTS, wynosi 20 μl. W związku z tym obserwuje się różnicę w pipetowaniu między wagami laboratoryjnymi a wagami HTS.
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu do oznaczania (pH 7,4)
	<ol>
		<li>W HTS należy użyć tego samego buforu, co w przypadku testu zieleni malachitowej w skali laboratoryjnej (Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie drożdży Hsp90
	<ol>
		<li>Używaj białka o podstawowym stężeniu glicerolu 0,66 mg/ml. Rozmrozić na lodzie tuż przed użyciem.</li>
		<li>Użyj 8 μl (5,98 μg, 0,80 μM) drożdży Hsp90 w każdym dołku, co zapewnia mierzalną aktywność ATPazy.</li>
		<li>Rozcieńczyć białko (8 μl) w buforze (32 μl) dla każdego dołka. Ostateczna całkowita objętość robocza dla każdej studzienki wynosi 40 μl przy całkowitej objętości testu wynoszącej 80 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 0,8 mM ATP
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1 mg ATP w 2,267 μl wody destylowanej do otrzymania roztworu o stężeniu 0,8 mM. Całkowita objętość robocza dla każdej studzienki wynosi 20 μl przy całkowitej objętości testu wynoszącej 80 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie geldanamycyny (GA)/badanych związków
	<ol>
		<li>Przygotuj zapas 0,8 mM GA w DMSO, jak w kroku 1.5. Rozcieńczyć 10 μl podstawowego GA w 90 μl wody, aby uzyskać końcowe stężenie 80 μM.</li>
		<li>Użyć 20 μl roztworu GA o stężeniu 80 μM w odpowiednich dołkach testowych (końcowa całkowita objętość studzienki testowej = 80 μL), uzyskując końcowe stężenie studzienki 20 μM. Służy to jako kontrola pozytywna.</li>
		<li>W przypadku badanych związków należy przygotować roztwory w DMSO zgodnie z ich pożądanym stężeniem do oceny.</li>
		<li>Przygotować 10 μl DMSO w 90 μl wody do dodania do studzienek ślepej próby (bufor + woda + DMSO) i kontroli ujemnej (Hsp90 w buforze + woda + DMSO). Przygotować badane związki w podobny sposób przy końcowym stężeniu studzienki 100 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Projektowanie płytek do oznaczania i kolejność dodawania
	<ol>
		<li>Użyj czterech płytek głównych, jednej płytki złożonej i czterech płytek addycyjnych zawierających zapasy odczynników, aby skonfigurować test (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2 i Tabela 4).</li>
		<li>Ponadto na płytkę A dodać 90 μl buforu do oznaczania do każdej studzienki; dodatkowo na płytkę B dodać 90 μl buforu z Hsp90 do każdej studzienki; dodatkowo na płytki C i D dodać odpowiednio 90 μl ATP i 90 μl odczynnika zieleni malachitowej do każdej studzienki (tabela 5 i tabela 6).</li>
		<li>Z płytki addycyjnej A i płytki B przenieść 40 μl roztworu z każdej studzienki na główną płytkę odpowiednio 1 i 2 oraz 3 i 4, używając zautomatyzowanego wielokanałowego systemu dozowania. W tym przypadku wykorzystano stację roboczą do automatyzacji laboratorium Biomek(R) FXP (<silna klasa="xfig">Rysunek 2 i Tabela 6).</li>
		<li>Z każdej studzienki płytki złożonej przenieś 20 μl roztworu na główne płytki 1, 2, 3 i 4 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Potrząsaj talerzami przez 1 minutę w wytrząsarce (200 obr./min).</li>
		<li>Z każdej studzienki płytki addycyjnej C (ATP) przenieś 20 μl roztworu na główne płytki 1, 2, 3 i 4 (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2). Potrząsaj talerzami przez 1 minutę w wytrząsarce (200 obr./min).</li>
		<li>Inkubować płytki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przygotować odczynnik z zieleni malachitowej zgodnie z krokiem 1.7. Po 3 godzinach przenieś 20 μl odczynnika zieleni malachitowej z płytki addycyjnej D do studzienek głównych płytek 1, 2, 3 i 4 (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej zmierzyć absorbancję płytki przy 620 nm w czytniku płytek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+attack+on+multistep+oncogenesis+by+inhibiting+the+Hsp90+molecular+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone.</a> Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).</li>
<li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis%3A+emerging+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).</li>
<li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP90+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li>
<li>Dutta Gupta, S., Pan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+update+on+discovery+and+development+of+Hsp90+inhibitors+as+senolytic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+HSP90+inhibitors+as+a+novel+class+of+senolytics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics.</a> Nature Communications. 8 (1), 422(2017).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90+inhibitors+as+senolytic+drugs+to+extend+healthy+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging.</a> Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).</li>
<li>Pearl, L. H., Prodromou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).</li>
<li>Park, H. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+full+potential+of+Hsp90+inhibitors+as+cancer+therapeutics+through+simultaneous+inactivation+of+Hsp90%2C+Grp94%2C+and+TRAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1.</a> Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).</li>
<li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimitespib%3A+first+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Pimitespib: first approval.</a> Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).</li>
<li>Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heat+shock+protein+HSP90-pp60v-src+heteroprotein+complex+formation+by+benzoquinone+ansamycins%3A+essential+role+for+stress+proteins+in+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).</li>
<li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
<li>Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+sulfonamide+drugs+inhibit+ATPase+activity+of+heat+shock+protein+90%3A+investigation+by+docking+simulation+and+experimental+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+and+pharmacophore+mapping+of+halogenated+pyridinium+derivatives+on+heat+shock+protein+90%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+and+Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90.</a> Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaborate+ligand-based+modeling+reveals+new+nanomolar+heat+shock+protein+90%CE%B1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+exploration+of+new+pyridinium-based+HSP90%CE%B1+inhibitors+tailored+to+thiamine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure.</a> Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+docking-based+comparative+intermolecular+contacts+analysis+to+validate+Hsp90%CE%B1+docking+studies+and+subsequent+in+silico+screening+for+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Modeling%22%5BJournal%5D)">Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors.</a> Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).</li>
<li>Dutta Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C4-dihydroxy+benzaldehyde+derived+Schiff+bases+as+small+molecule+Hsp90+inhibitors%3A+rational+identification+of+a+new+anticancer+lead%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead.</a> Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+malachite+green+assay+of+phosphate%3A+mechanism+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).</li>
<li>Gupta, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+docking+study%2C+synthesis+and+biological+evaluation+of+Mannich+bases+as+Hsp90+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+established+drugs+as+SARS-CoV-2+PLpro+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors.</a> Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).</li>
<li>Giri, A. K., Ianevski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+drug+discovery+targeting+the+cancer+cell-microenvironment+interactions+in+hematological+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).</li>
<li>Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahapatra%2C+DK+%22Advanced+Studies+in+Experimental+and+Clinical%22">Advanced Studies in Experimental and Clinical</a>. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).</li>
<li>Jaeger, A. M., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90%3A+enabler+of+cancer+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90: enabler of cancer adaptation.</a> Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).</li>
<li>Yang, S., Xiao, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+heat+shock+proteins+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis%2C+metabolism+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074(2021).</li>
<li>Mishra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Hsp90%CE%B2-selective+inhibitors+to+overcome+detriments+associated+with+pan-Hsp90+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).</li>
<li>Khandelwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+design+of+an+Hsp90beta+N-terminal+isoform-selective+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor.</a> Nature Communications. 9 (1), 425(2018).</li>
<li>Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+selective+are+Hsp90+inhibitors+for+cancer+cells+over+normal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells.</a> ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).</li>
<li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li>
<li>Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+design+and+development+strategies+for+finding+Hsp90+inhibitors+and+their+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases.</a> Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747(2021).</li>
<li>Howes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+polarization+assay+for+inhibitors+of+Hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90.</a> Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).</li>
<li>Opalińska, M., Jańska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA+proteases%3A+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163(2018).</li>
<li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+therapeutic+potential%2C+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li>
<li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase%2C+substrate+translocation+and+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li>
</ol>

Nie ma sprzecznych interesów finansowych.

Hsp90 jest ważnym celem dla odkrycia nowych cząsteczek leków przeciwnowotworowych. Od czasu ustalenia jego lekowrażliwości w 1994 r.10, 18 cząsteczek trafiło do badań klinicznych. Obecnie siedem cząsteczek znajduje się w różnych fazach badań klinicznych, zarówno samodzielnie, jak i w połączeniu22. Wszystkie takie małe cząsteczki są N-końcowymi inhibitorami wiązania ATP. Inne sposoby hamowania białka opiekuńczego (inhibitory C-końcowe, inhibitory domeny środkowej) nie postęp...

Białko szoku cieplnego 90 (Hsp90) jest molekularnym chaperonem, który utrzymuje stabilność białek odpowiedzialnych za rozwój i progresję raka. Ponadto białka odpowiedzialne za rozwój oporności na leki przeciwnowotworowe są również klientami Hsp901. Hsp90 ulega nadekspresji we wszystkich typach komórek nowotworowych (>90% białek komórkowych), w porównaniu z normalnymi komórkami, w których może stanowić mniej niż 2% wszystkich białek. Co więcej, Hsp90 komórek rakowych znajduje się w kompleksie z ko-chaperonami, podczas gdy w normalnej komórce występuje głównie w stanie wolnym, nieskompleksowanym2,3. W ostatnich latach wykazano, że kilka inhibitorów Hsp90 ma działanie senolityczne w badaniach in vitro i in vivo, gdzie znacznie poprawiły długość życia myszy4,5,6. Wszystkie wyżej wymienione odkrycia potwierdzają fakt, że inhibitory Hsp90 mogą być skuteczne w wielu typach raka, przy mniejszej liczbie działań niepożądanych i zmniejszonych szansach na rozwój oporności. Funkcja opiekuńcza Hsp90 jest realizowana poprzez wiązanie ATP w domenie N-końcowej Hsp90 i hydrolizę go do ADP i wolnego fosforanu7. Stwierdzono, że małe cząsteczki, które konkurencyjnie wiążą się z kieszenią wiążącą ATP Hsp90, skutecznie tłumią efekt opiekuńczy białka. Do tej pory pozostaje to najlepszą strategią hamowania Hsp90, co potwierdza fakt, że takie inhibitory osiągnęły wyniki badań klinicznych8. Jeden z nich, Pimitespib, został zatwierdzony w Japonii do leczenia guza podścieliska przewodu pokarmowego (GIST) w czerwcu 2022 r.9. Jest to pierwszy inhibitor Hsp90 zatwierdzony od czasu ustalenia w 1994 r. zdolności terapeutycznej białka opiekuńczego10.
Test zieleni malachitowej jest prostą, czułą, szybką i niedrogą procedurą wykrywania fosforanów nieorganicznych, odpowiednią do automatyzacji i wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) związków pod kątem pożądanego celu11. Test został z powodzeniem zastosowany do badań przesiewowych inhibitorów Hsp90 w małych konfiguracjach laboratoryjnych, a także w klasie HTS<sup="xref">12,13,14,15,16,17. Test wykorzystuje metodę kolorymetryczną, która określa wolny nieorganiczny fosforan powstały w wyniku aktywności ATPazy Hsp90. Podstawą tej kwantyfikacji jest tworzenie kompleksu fosfomolibdenianu między wolnym fosforanem a molibdenem, który następnie reaguje z zielenią malachitową, generując zielony kolor (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). To szybkie tworzenie się kolorów jest mierzone na spektrofotometrze lub czytniku płytkowym w zakresie 600-660 nm18,19.
W obecnym protokole opisana jest procedura przeprowadzania testu na zieleń malachitową z drożdżami Hsp90 i późniejszej identyfikacji inhibitorów przeciwko chaperonowi. Cząsteczka produktu naturalnego, geldanamycyna (GA), za pomocą której po raz pierwszy ustalono zdolność Hsp90 do działania, została uznana za autentyczny inhibitor10. HTS stał się integralną częścią obecnego programu odkrywania leków, ze względu na dostępność dużej liczby cząsteczek do testów. Technika ta zyskała na znaczeniu w ciągu ostatnich 2 lat ze względu na pilną potrzebę zmiany przeznaczenia leków do leczenia infekcji Covid-1920,21. W związku z tym przedstawiono szczegółowy zarys HTS cząsteczek przeciwko białku Hsp90 drożdży przy zastosowaniu metody oznaczania zieleni malachitowej.

<table><tbody><tr><td>1M Roztwór chlorku magnezu w wodzie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069-100ml</td><td></td></tr><tr><td>1M Roztwór chlorku potasu w wodzie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>SPL Nauki przyrodnicze</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli disodowej 5&prime;-trifosforanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Biomek FX laboratorium stacja robocza automatyki</td><td>Beckman Coulter</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Związki 3-96</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie dotyczy</td><td>Drożdże znakowane histydyną Hsp90 uzyskano od dr Chrisostomosa Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, Wielka Brytania, a białko wyrażono w KIST Gangneung Institute of Natural Products. Szczegóły nie mogą zostać ujawnione ze względu na kwestie związane z naruszeniem patentu.</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycyna, 99% (HPLC), proszek</td><td>AK Scientific, Inc.</td><td>V2064</td><td></td></tr><tr><td>Invitroge UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Test zielonego fosforanu malachitu&nbsp; Zestaw testowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK307-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek z wieloma detekcjami Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik wielopłytkowy Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy chlorowodorku Trizma, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93313-1L</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże Hsp90</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie dotyczy</td><td>School of Life Sciences, University of Sussex, Wielka Brytania, a białko wyrażono w KIST Gangneung Institute of Natural Products. Podstawowy numer dostępu: P02829</td></tr></tbody></table>

test na zieleń malachitową w celu odkrycia inhibitorów białka szoku cieplnego 90

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

Białko szoku cieplnego 90 (Hsp90) jest obiecującym celem przeciwnowotworowym ze względu na jego opiekuńczy wpływ na wiele białek onkogennych. Aktywność Hsp90 zależy od jego zdolności do hydrolizy trifosforanu adenozyny (ATP) do difosforanu adenozyny (ADP) i wolnego fosforanu. Aktywność ATPazy Hsp90 jest związana z jej funkcją opiekuńczą; ATP wiąże się z N-końcową domeną Hsp90, a przerwanie jej wiązania okazało się najbardziej skuteczną strategią tłumienia funkcji Hsp90. Aktywność ATPazy można zmierzyć za pomocą kolorymetrycznego testu zieleni malachitowej, który określa ilość wolnego fosforanu powstałego w wyniku hydrolizy ATP. W tym miejscu opisano procedurę oznaczania aktywności ATPazy drożdży Hsp90 przy użyciu zestawu do oznaczania zielonego fosforanu malachitu. Ponadto podano szczegółowe instrukcje dotyczące odkrywania inhibitorów Hsp90 poprzez przyjmowanie geldanamycyny jako autentycznego inhibitora. Na koniec omówiono zastosowanie tego protokołu testowego poprzez wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) cząsteczek inhibitora przeciwko drożdżom Hsp90.

Wyniki testu interpretuje się w oparciu o absorbancję wynikającą z stężenia wolnych jonów fosforanu. Absorbancję wolnego fosforanu powstałego w wyniku hydrolizy ATP przez drożdżowe Hsp90 przy 620 nm uznaje się za 100% aktywności ATPase, co odpowiada zerowemu procentowi inhibicji białka. Inhibicja białka prowadzi do zatrzymania hydrolizy ATP (mniejsza ilość wolnego fosforanu), co przejawia się spadkiem absorbancji przy 620 nm.
Wyniki testu z zielenią malachitową w skali laboratoryjnej</...

Protokół testu zieleni malachitowej jest prostą i opłacalną metodą do odkrycia tłumików białka szoku cieplnego 90 (Hsp90), a także innych związków hamujących enzymy zależne od ATP.

Test na zieleń malachitową w celu odkrycia inhibitorów białka szoku cieplnego 90

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

Protokół ten pomoże w określeniu aktywności białek ATPazy poprzez pomiar wolnego fosforanu powstałego w wyniku hydrolizy ATP przez białka. Test zieleni malachitowej jest prostą, czułą, szybką i niedrogą procedurą wykrywania fosforanów nieorganicznych. Nadaje się do automatyzacji i wysokoprzepustowego przesiewania związków w stosunku do celu.Technika ta odegra ważną rolę w szybkim odkryciu inhibitorów białka Hsp90, które jest ważnym celem przeciwnowotworowym. Na początek odpipetuj 40 mikrolitrów jednomilimolowego wzorca fosforanowego w 960 mikrolitrach ultraczystej wody, aby uzyskać 40-mikromolowy roztwór fosforanu. Dodaj ten roztwór zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać seryjne rozcieńczenie fosforanu od 0 do 40 mikromolów.Następnie użyj ośmiu mikrolitrów drożdży Hsp90, aby uzyskać mierzalną aktywność ATPazy. Dodać odczynnik w kolorze malachitowym do próby ślepej i kontroli dodatniej i sprawdzić różnicę gęstości optycznej między ślepą próbą a kontrolą pozytywną po dodaniu wynoszącą co najmniej 0,5 i mniejszą niż 1. Aby przygotować ATP, przenieś jeden miligram ATP do fiolki zawierającej 453,39 mikrolitrów ultraczystej wody, aby otrzymać czteromilimolowy roztwór podstawowy.Przygotuj ATP na świeżo, ponieważ z czasem może ulec samoistnej hydrolizie. Dodaj cztery mikrolitry roztworu podstawowego ATP do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie studzienki 0,2 milimola. Dodaj ATP jako ostatni składnik do reakcji za pomocą pipety wielokanałowej, aby wszystkie reakcje rozpoczęły się jednocześnie.Następnie przygotuj 10-milimolowy zapas geldanamycyny, rozpuszczając jeden miligram w 178,37 mikrolitrach DMSO. Korzystając z roztworu podstawowego, przygotować roztwór 4-milimolowy, 0,8-milimolowy, 0,16-milimolowy, 0,032-milimolowy, 0,0064-milimolowy i 0,00128-milimolowy w DMSO przez seryjne rozcieńczanie. Dodaj dwa mikrolitry tych roztworów podstawowych do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie studzienki 0,1 milimola, 0,02 milimola, 0,04 milimola, 0,0008 milimola, 0,00016 milimola i 0,000032 milimola.Następnie przygotuj studzienki wraz ze studzienkami zawierającymi ślepą próbę i kontrolę ujemną. Studzienki zawierające geldanamycynę służą jako kontrola pozytywna. Przygotuj płytki 96-dołkowe i przygotuj oddzielną studzienkę dla związków, które wykazują absorbancję przy 620 nanometrach, aby zarejestrować absorbancję przy tej długości fali.Nie należy pokazywać oddzielnego dołka dla geldanamycyny, ponieważ geldanamycyna nie wykazuje absorbancji przy 620 nanometrach dla stężenia użytego w tym teście. Skonfiguruj studnie testowe, dodając ultraczystą wodę do każdej studzienki. Następnie dodać wymaganą ilość buforu do oznaczania i roztwór złożony, taki jak roztwór geldanamycyny.Dodaj Hsp90 do odpowiednich dołków i potrząsaj płytkami przez dwie minuty na wytrząsarce do płytek w temperaturze pokojowej. Dodać cztery mikrolitry roztworu ATP za pomocą pipety wielokanałowej. Zawiń talerz w folię aluminiową i potrząsaj przez dwie minuty na wytrząsarce talerzowej w temperaturze pokojowej z prędkością 200 obr./min.Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Zatrzymaj reakcję, dodając 20 mikrolitrów odczynnika malachitowego w tej samej kolejności co ATP za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec zmierz absorbancję płytki przy 620 nanometrach w czytniku płytek.Oprócz płytki A dodać 90 mikrolitrów buforu do oznaczania do każdej studzienki. Oprócz płytki B dodać 90 mikrolitrów buforu z Hsp90 do każdej studzienki. Oprócz płytki C dodaj 90 mikrolitrów ATP, a dodatkowo płytkę D dodaj 90 mikrolitrów odczynnika malachitu do każdej studzienki.Użyj zautomatyzowanego wielokanałowego systemu dozowania, aby przenieść 40 mikrolitrów roztworu z każdej studzienki płytki dodatkowej A na płytkę główną pierwszą i drugą, a następnie płytkę B na płytkę główną trzecią i czwartą. Przenieś 20 mikrolitrów roztworu z każdej studzienki płytki złożonej na płytki główne pierwsze, płytki główne dwa, płytki główne trzy i płytki główne cztery. Potrząsaj talerzami przez minutę w wytrząsarce z prędkością 200 obr./min.Przenieś 20 mikrolitrów roztworu z każdej studzienki płytek dodatkowych C na główne płytki pierwsze, drugie, trzy i cztery. Potrząsaj talerzami przez minutę w wytrząsarce z prędkością 200 obr./min. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, a następnie przenieść 20 mikrolitrów odczynnika zieleni malachitowej z płytki dodawania D do dołków głównych płytek pierwszej, drugiej, trzeciej i czterech.Po 15-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej zmierz absorbancję płytki przy 620 nanometrach w czytniku płytek. Przedstawiono tutaj strukturę zieleni malachitowej oraz reakcje odczynnika A zieleni malachitowej A z wolnym fosforanem oraz późniejszą reakcję z odczynnikiem B. Standardowy wykres dla standardowego stężenia fosforanów jest przedstawiony na tym rysunku.W tym przypadku oś x reprezentuje stężenie wolnego fosforanu lub pi w mikromolach, a absorbancja przy 620 nanometrach jest przedstawiona na osi y. Słupki błędów reprezentują odchylenie między dwiema liczbami próbki. Procentowa aktywność ATPazy służy do pomiaru zależnego od dawki hamowania białka przez geldanamycynę.Zaobserwowano, że geldanamycyna hamuje białko w sposób zależny od dawki, a wartość IC50 wynosi 0,85 mikromola. Tutaj każdy punkt jest średnią z dwóch określeń. Rozwój koloru na płycie głównej pierwszej po dodaniu zielonego środka malachitowego pokazano na tym obrazie.Różowy kolor w studzience A11 wynika z koloru złożonego. Podobnie pokazano tutaj rozwój koloru na płycie głównej numer dwa. Różowy kolor w studzience A11 wynika z kolorowego charakteru związku.Rozwój koloru po dodaniu odczynnika zieleni malachitowej na płytce głównej trzeciej i na płytce głównej czwartej pokazano tutaj. Dodanie ATP i odczynnika malachitowego w tym samym czasie do każdej studzienki jest ważną rzeczą, o której należy pamiętać podczas próby tej procedury.

malachite-green-assay-for-discovery-heat-shock-protein-90

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym protokole opisana jest metoda pomiaru ponownego fałdowania białek wewnątrzkomórkowych po szoku cieplnym. Metoda ta może być stosowana do badania fałd, takich jak molekularne białka opiekuńcze i ich kofaktory lub związki, które mogą wpływać na ich aktywność. Aktywność lucyferazy świetlika jest używana jako reporter do pomiaru aktywności ponownego fałdowania białka opiekuńczego.

Test ponownego fałdowania wewnątrzkomórkowego

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

W tym filmie pokazujemy test jednorodności zbliżeniowej ze wzmocnioną luminescencją - test zbliżeniowy oparty na koralikach. Wykorzystuje kulki akceptora i dawcy o jednorodnej wielkości, unieruchomione dwoma białkami, które mają tendencję do oddziaływania w celu przesiewania potencjalnych małych cząsteczek hamujących interakcje białek.

Amplifikowany luminescencyjny test jednorodny zbliżeniowy: Test zbliżeniowy oparty na kulkach do badania przesiewowego małych cząsteczek hamujących interakcje białko-białko

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Możliwość oceny zaangażowania inhibitorów kandydatów w komórkach nienaruszonych jest kluczowa dla odkrywania leków. Protokół ten opisuje 384-dołkowy test termiczny przesunięcia komórkowego, który niezawodnie wykrywa zaangażowanie inhibitorów celujących w dziki typ SHP2 lub jego warianty onkogenne.

Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11)

SAMHD1 to trifosfohydrolaza deoksynukleozydowo-trifosforanowa, odgrywająca kluczową rolę w ludzkim zdrowiu i chorobie. Tutaj przedstawiamy wszechstronny test aktywności SAMHD1 sprzężony z enzymami, zastosowany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, który pozwala na ocenę małych cząsteczek i analogów nukleotydów jako substratów, aktywatorów i inhibitorów SAMHD1.

Wysokoprzepustowy test aktywności sprzężony z enzymami do badania interakcji małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1

Ten protokół przedstawia technikę badania interakcji białko-białko za pomocą koralików donorowych połączonych z glutationem z ko-chaperonami z motywem TPR i koralikami akceptorowymi sprzężonymi z peptydem pochodzącym z Hsp90. Wykorzystaliśmy tę technikę do badań przesiewowych małych cząsteczek w celu zakłócenia interakcji Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52 i zidentyfikowaliśmy silne i selektywne inhibitory interakcji Hsp90-FKBP51.

Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek

Ten protokół demonstruje aktywność białka szoku cieplnego 70 (Hsp70). Komórki E. coli dnaK756 służą jako model dla testu, ponieważ zawierają natywny, funkcjonalnie upośledzony Hsp70, co czyni je podatnymi na stres cieplny. Heterologiczne wprowadzenie funkcjonalnego Hsp70 ratuje niedobór wzrostu komórek.

Test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70

Protokół ten wprowadza fluorometryczną metodologię przesiewania zoptymalizowaną do identyfikacji produktów naturalnych/inhibitorów małych cząsteczek syntezy białek. Jego praktyczność sprawia, że nadaje się zarówno do nauczania technik odkrywania leków na poziomie licencjackim, jak i do wdrażania w kampaniach chemii medycznej.

Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

Poznaj test na zieleń malachitową do wykrywania inhibitorów białka szoku cieplnego 90 (Hsp90). Ta prosta i czuła metoda kolorymetryczna umożliwia szybki pomiar nieorganicznego fosforanu zwalnianego podczas hydrolizy ATP.

Test na zieleń malachitową w celu odkrycia inhibitorów białka szoku cieplnego 90

Przeglądaj więcej filmów