Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego
21 kwietnia 2023
To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.
Nasz protokół zapewnia sposób wizualizacji reakcji neuronalnej na stres mechaniczny u żywej myszy, co może dostarczyć bezpośrednich dowodów na to, jak urazowe uszkodzenie mózgu wpływa na mózg. Technika ta może monitorować białko docelowe w tym samym miejscu mózgu u tego samego zwierzęcia zarówno w ostrej, jak i przewlekłej fazie po urazowym uszkodzeniu mózgu. Interesujący nas gen i promotor wirusa mogą być odpowiednio zmienione w celu zbadania innych białek w określonych typach komórek w mózgu.
Na początek nałóż maść okulistyczną na znieczulone oczy myszy. Usuń włosy z czubka głowy, przycinając je zwykłymi nożyczkami. Po ustanowieniu nacięcia linii środkowej o długości od 12 do 15 milimetrów, wytnij skórę nad lewą i prawą półkulą czaszki za pomocą nożyczek sprężynowych z zakrzywioną końcówką.
Po odsłonięciu czaszki usuń okostną, delikatnie pocierając ją sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką i spłukując sterylną solą fizjologiczną. Po wysuszeniu obszaru czaszki zaznacz miejsce uderzenia Traumatic Brain Injury (TBI) we współrzędnych 2,5 milimetra za bregmą i dwa milimetry w bok od szwu strzałkowego w prawo. Szybko wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i połóż głowę na poduszce buforowej pod urządzeniem TBI.
Dopasuj końcówkę impaktora do zaznaczonego miejsca uderzenia. Podnieś metalową kolumnę, ciągnąc nylonowy sznurek na uwięzi 15 centymetrów nad głową myszy, a następnie zwolnij go, pozwalając ciężarkowi swobodnie opaść na pręt przetwornika, który styka się z górną częścią czaszki w miejscu TBI. Umieść znieczuloną głowę myszy na stereotaktycznej ramie trzymanej pod mikroskopem operacyjnym.
Delikatnie i powoli nawiercić powierzchnię czaszki za pomocą wiertła z węglika spiekanego FG4 przy niskiej prędkości wirnika, aby usunąć pozostałą okostną i stworzyć szorstką powierzchnię czaszki, tak aby cement dentystyczny bezpiecznie wiązał się z czaszką. Użyj soli fizjologicznej, aby przepłukać i usunąć pył kostny z powierzchni czaszki. Aby oddzielić mięśnie boczne od czaszki, około pięciu milimetrów za okiem, gdzie znajduje się szew łączący czaszkę ciemieniową i skroniową, delikatnie włóż cienkie zamknięte końcówki i delikatnie przesuwaj zamknięte końcówki w kierunku tylnym, aż do szwu lambdoidalnego.
Oddziel mięśnie boczne po stronie, po której nastąpi implantacja okna czaszki. Zmyj zanieczyszczenia z pola operacyjnego za pomocą soli fizjologicznej i osusz obszar gazą. Aby wszczepić słupek głowy, zaznacz punkt środkowy 2,5 milimetra za bregmą i 1,5 milimetra od szwu strzałkowego na prawej półkuli za pomocą markera i suwmiarki chirurgicznej.
Następnie odrysuj obwód kraniotomii na czystej i suchej czaszce. Poluzuj nausznik i obróć głowę tak, aby płaszczyzna kraniotomii była idealnie pozioma, a następnie ponownie dokręć nausznik. Użyj drewnianego patyczka aplikatora z bawełnianą końcówką, aby dodać dwie małe krople superglue do przedniej i tylnej krawędzi słupka głównego.
Umieść tytanowy słupek głowy nad środkiem kraniotomii i szybko wyreguluj go tak, aby spoczywał w tej samej płaszczyźnie, w której zostanie wszczepione okno czaszki. Lekko dociśnij, aż superglue wyschnie, co zwykle trwa około 30 sekund. Przygotuj cement dentystyczny we wstępnie schłodzonym naczyniu ceramicznym, dokładnie mieszając 300 miligramów proszku cementowego, sześć kropli płynu QuickBase i jedną kroplę katalizatora.
Szybko nałóż dużą ilość mieszanki cementu dentystycznego na zewnętrzny obwód wyznaczonego obwodu i przykryj odsłoniętą powierzchnię kości. Nie należy jednak zakrywać miejsca kraniotomii. Zwolnij pałąk na ucho i przymocuj słupek głowy do metalowej ramy, aby upewnić się, że głowa jest stabilna do precyzyjnego wiercenia wzdłuż zaznaczonego obwodu kraniotomii.
Aby wykonać kraniotomię, użyj suwmiarki chirurgicznej, aby sprawdzić średnicę zaznaczonego koła, jak pokazano wcześniej, i wyreguluj w razie potrzeby, tak aby okienko czaszki ściśle przylegało do kraniotomii. Za pomocą elektrycznej wiertarki dentystycznej wytrawić i rozcieńczyć czaszkę wzdłuż zewnętrznej strony zaznaczonego okręgu za pomocą wiertła z węglika spiekanego FG4, które tworzy ścieżkę, w której można przerzedzić czaszkę. Przepłukać obszar solą fizjologiczną, aby zmyć pył kostny.
Kontynuuj rozrzedzanie czaszki za pomocą wiertła z węglika spiekanego FG 1/4, aż czaszka stanie się cienka jak papier i przezroczysta. Okresowo przerywaj wiercenie i ponownie przepłucz cały obszar sterylną solą fizjologiczną, aby zmniejszyć nagrzewanie się wiertła i zmyć pył kostny. Zakończ przerzedzanie czaszki za pomocą wiertła z węglika spiekanego EF4 i kontynuuj przerzedzanie i wiercenie w pozostałej części czaszki wzdłuż toru.
Włóż kleszczyki o grubości 0,5 milimetra z cienką końcówką przez pęknięte miejsce i delikatnie podnieś płat kostny do góry, nie wciskając leżącego pod spodem mózgu. Po usunięciu płata kostnego należy przepłukać obszar kraniotomii solą fizjologiczną. Za pomocą zakrzywionych kleszczy chirurgicznych delikatnie usuń widoczną pajęczynówkę.
Użyj kleszczy chirurgicznych z prostą końcówką, aby podnieść sterylne szklane okienko z trzymilimetrową szklaną szkiełkiem pokrywy skierowaną w dół. Umieść i wyreguluj szklane okienko nad miejscem kraniotomii, aby upewnić się, że okienko może ściśle przylegać do krawędzi kraniotomii. Pięciomilimetrowe szklane szkiełko nakrywkowe znajduje się na górze.
Przygotuj cement dentystyczny, jak pokazano wcześniej, i odczekaj około sześciu minut, aż cement stanie się pastowaty i gęsty. Czekając, aż cement stanie się pastowaty i gęsty, przyłóż odpowiednią siłę nacisku na okno za pomocą manipulatora stereotaktycznego, aby sprawdzić, czy czaszka może bezpiecznie i szczelnie zetknąć się ze szklaną szybą. Użyj regulowanego, precyzyjnego pędzelka z aplikatorem, aby dodać niewielką ilość cementu wzdłuż krawędzi okna, aby uszczelnić szklane okno czaszką.
Odczekaj około 10 minut, aby cement całkowicie wyschł, a następnie delikatnie zwolnij i wyjmij manipulator nad oknem. Zakończ, przycinając cement dentystyczny za pomocą wiertła dentystycznego z wiertłem z węglika spiekanego FG4, jeśli nadmiar cementu zakrywa okno. Po około czterech godzinach od operacji przeprowadzono obrazowanie dwufotonowe, w którym na powierzchownym poziomie naczyń krwionośnych wydawała się, a na głębokim poziomie około 400 mikrometrów ekspresja białka EGFP była rozprowadzona po całym ciele komórki.
Po tygodniu i czterech miesiącach od TBI, wzorzec unaczynienia zaobserwowany w punkcie czasu zero dnia został wykorzystany jako odniesienie do zlokalizowania tego samego regionu obrazowania. Wzorzec unaczynienia jest podobny do tego w dniu zero. Podobnie, ekspresję EGFP wykryto w całym ciele komórki.
Intensywność fluorescencji w dniu zero i po czterech miesiącach była podobna zarówno na poziomie powierzchownym, jak i głębszym. Jednak intensywność fluorescencji po jednym tygodniu była niższa niż w dniu zero i czterech miesiącach, prawdopodobnie z powodu represji translacyjnej zgłoszonej dla innych modeli TBI. Bardzo ważne jest, aby zachować najwyższą ostrożność podczas wykonywania etapu kraniotomii, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.
Nie wkładaj końcówki wiertła do mózgu. Korzystając z tej techniki, naukowcy mogą wizualizować różne białka będące przedmiotem zainteresowania w tej samej komórce wzdłużnie w różnych fazach po TBI, dostarczając informacji na temat lokalizacji, ekspresji i rozpuszczalności tego białka w mózgu ssaków po urazie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę wizualizacji odpowiedzi neuronalnej na stres mechaniczny po urazie czaszkowo-mózgowym (TBI) w żywym modelu mysim. Opisano w nim implantację okna czaszkowego w celu umożliwienia obrazowania intravitalnego neuronów wykazujących ekspresję EGFP za pomocą mikroskopii dwufotonowej, co pozwala na śledzenie odpowiedzi neuronalnej w czasie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Urazy czaszkowo-mózgowe
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) prowadzi do istotnych zmian neuronalnych.
- Monitorowanie odpowiedzi neuronalnych w fazach ostrej i przewlekłej jest kluczowe dla zrozumienia skutków TBI.
- Mikroskopia dwufotonowa umożliwia głębokie obrazowanie w żywych tkankach.
- Ekspresja EGFP pomaga w śledzeniu specyficznych populacji neuronalnych.
Cel badania
- Wizualizacja i kwantyfikacja odpowiedzi neuronalnych na stres mechaniczny w żywym modelu mysim po TBI.
- Zrozumienie wpływu TBI na funkcje neuronalne w czasie.
- Opracowanie protokołu zmiany celów genowych w celu badania różnych białek w różnych typach komórek.
Zastosowane metody
- Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania odpowiedzi neuronalnych.
- Wykorzystanie myszy do eksperymentów in vivo z indukowanym urazem czaszkowo-mózgowym.
- Szczegółowy protokół chirurgiczny implantacji okna czaszkowego w celu zapewnienia dostępu do obrazowania.
- Podkreślono znaczenie stabilnego pozycjonowania oraz technik przygotowawczych w celu zminimalizowania uszkodzeń podczas procedur.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia monitorowanie zachowania neuronów w czasie rzeczywistym po urazie czaszkowo-mózgowym (TBI).
- Reakcje zaobserwowane w neuronach wykazujących ekspresję EGFP ilustrują zmiany w pobudliwości po urazie mechanicznym.
- Dane wykazujące ciągłość odpowiedzi zarówno w fazie ostrej, jak i przewlekłej, dowodzą trwałych skutków TBI dla integralności neuronów.
Wnioski
- Niniejsze badanie ustanawia wartościowe narzędzie do badania dynamicznych odpowiedzi neuronów na uraz traumatyczny in vivo.
- Umożliwia ono badanie specyficznych zmian molekularnych związanych z TBI w czasie, co potencjalnie może prowadzić do lepszego zrozumienia i opracowania strategii leczenia.
- Wyniki mają istotne znaczenie dla plastyczności neuronalnej i mechanizmów regeneracji po urazie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Podłużne obrazowanie intravitalne ekspresji białek fluorescencyjnych w żywych modelach mysich umożliwia bezpośrednią wizualizację odpowiedzi neuronalnych na urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) z rozdzielczością pojedynczej komórki. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych i redukcji ryzyka mechanistycznego w procesach badawczych nad neurotraumą. Zdolność tej metody do śledzenia lokalizacji i ekspresji białek w czasie wspiera ciągłość translacyjną oraz decyzje portfelowe skorygowane o ryzyko w procesie odkrywania leków na schorzenia ośrodkowego układu nerwowego (CNS).
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę odpowiedzi neuronalnej na uraz mechaniczny in vivo.
- Wspiera funkcjonalną walidację białek docelowych w obszarach mózgu istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wizualizację ostrych i przewlekłych zmian molekularnych po TBI.
- Zapewnia platformę do testowania hipotez dotyczących lokalizacji białek oraz dynamiki ich rozpuszczalności.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane systemy obrazowania in vivo do ilościowej oceny ekspresji białek.
- Umożliwia powtarzalne pomiary podłużne w wielu punktach czasowych u tego samego zwierzęcia.
- Pozwala na standaryzację wyników obrazowania w celu późniejszej oceny związków.
- Umożliwia adaptację wektorów wirusowych i promotorów do przesiewania różnych białek docelowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla danej choroby w zakresie translacyjnego odkrywania biomarkerów w urazach neurologicznych.
- Zapewnia ciągłość od wczesnych badań mechanistycznych po przedkliniczną walidację hipotez terapeutycznych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o trwałe zmiany molekularne po urazie.
- Wspiera ocenę efektów interwencji w zakresie plastyczności neuronalnej i mechanizmów regeneracji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje procesy od wczesnego odkrywania po badania przedkliniczne, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celu oraz dopasowanie biomarkerów translacyjnych w modelach uszkodzeń OUN.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez mechanistycznych i wyjaśnianie szlaków w żywej tkance mózgowej.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki obrazowania w celu przygotowania testów.
- Analityka: Dostarcza podłużnych pomiarów intensywności fluorescencji do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy ostre i przewlekłe fazy urazu w celu zapewnienia ciągłości biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę obrazowania z możliwością ponownego wykorzystania, którą można dostosować do różnych białek docelowych i podtypów neuronów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w neurotraumie.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w obrazowaniu in vivo w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go oraz alokację kapitału poprzez dostarczanie trwałych odczytów molekularnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w OUN z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o podłużne dane in vivo.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii stereotaktycznej i mikroskopii dwufotonowej.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury obrazowej oraz sal operacyjnych dla zwierząt.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów chirurgicznych i obrazowych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych białek docelowych poprzez dobór wektora wirusowego i promotora.
- Staranna technika chirurgiczna jest kluczowa, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej i zapewnić wysoką jakość danych.
