Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Nasz protokół zapewnia sposób wizualizacji reakcji neuronalnej na stres mechaniczny u żywej myszy, co może dostarczyć bezpośrednich dowodów na to, jak urazowe uszkodzenie mózgu wpływa na mózg. Technika ta może monitorować białko docelowe w tym samym miejscu mózgu u tego samego zwierzęcia zarówno w ostrej, jak i przewlekłej fazie po urazowym uszkodzeniu mózgu. Interesujący nas gen i promotor wirusa mogą być odpowiednio zmienione w celu zbadania innych białek w określonych typach komórek w mózgu.

Na początek nałóż maść okulistyczną na znieczulone oczy myszy. Usuń włosy z czubka głowy, przycinając je zwykłymi nożyczkami. Po ustanowieniu nacięcia linii środkowej o długości od 12 do 15 milimetrów, wytnij skórę nad lewą i prawą półkulą czaszki za pomocą nożyczek sprężynowych z zakrzywioną końcówką.

Po odsłonięciu czaszki usuń okostną, delikatnie pocierając ją sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką i spłukując sterylną solą fizjologiczną. Po wysuszeniu obszaru czaszki zaznacz miejsce uderzenia Traumatic Brain Injury (TBI) we współrzędnych 2,5 milimetra za bregmą i dwa milimetry w bok od szwu strzałkowego w prawo. Szybko wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i połóż głowę na poduszce buforowej pod urządzeniem TBI.

Dopasuj końcówkę impaktora do zaznaczonego miejsca uderzenia. Podnieś metalową kolumnę, ciągnąc nylonowy sznurek na uwięzi 15 centymetrów nad głową myszy, a następnie zwolnij go, pozwalając ciężarkowi swobodnie opaść na pręt przetwornika, który styka się z górną częścią czaszki w miejscu TBI. Umieść znieczuloną głowę myszy na stereotaktycznej ramie trzymanej pod mikroskopem operacyjnym.

Delikatnie i powoli nawiercić powierzchnię czaszki za pomocą wiertła z węglika spiekanego FG4 przy niskiej prędkości wirnika, aby usunąć pozostałą okostną i stworzyć szorstką powierzchnię czaszki, tak aby cement dentystyczny bezpiecznie wiązał się z czaszką. Użyj soli fizjologicznej, aby przepłukać i usunąć pył kostny z powierzchni czaszki. Aby oddzielić mięśnie boczne od czaszki, około pięciu milimetrów za okiem, gdzie znajduje się szew łączący czaszkę ciemieniową i skroniową, delikatnie włóż cienkie zamknięte końcówki i delikatnie przesuwaj zamknięte końcówki w kierunku tylnym, aż do szwu lambdoidalnego.

Oddziel mięśnie boczne po stronie, po której nastąpi implantacja okna czaszki. Zmyj zanieczyszczenia z pola operacyjnego za pomocą soli fizjologicznej i osusz obszar gazą. Aby wszczepić słupek głowy, zaznacz punkt środkowy 2,5 milimetra za bregmą i 1,5 milimetra od szwu strzałkowego na prawej półkuli za pomocą markera i suwmiarki chirurgicznej.

Następnie odrysuj obwód kraniotomii na czystej i suchej czaszce. Poluzuj nausznik i obróć głowę tak, aby płaszczyzna kraniotomii była idealnie pozioma, a następnie ponownie dokręć nausznik. Użyj drewnianego patyczka aplikatora z bawełnianą końcówką, aby dodać dwie małe krople superglue do przedniej i tylnej krawędzi słupka głównego.

Umieść tytanowy słupek głowy nad środkiem kraniotomii i szybko wyreguluj go tak, aby spoczywał w tej samej płaszczyźnie, w której zostanie wszczepione okno czaszki. Lekko dociśnij, aż superglue wyschnie, co zwykle trwa około 30 sekund. Przygotuj cement dentystyczny we wstępnie schłodzonym naczyniu ceramicznym, dokładnie mieszając 300 miligramów proszku cementowego, sześć kropli płynu QuickBase i jedną kroplę katalizatora.

Szybko nałóż dużą ilość mieszanki cementu dentystycznego na zewnętrzny obwód wyznaczonego obwodu i przykryj odsłoniętą powierzchnię kości. Nie należy jednak zakrywać miejsca kraniotomii. Zwolnij pałąk na ucho i przymocuj słupek głowy do metalowej ramy, aby upewnić się, że głowa jest stabilna do precyzyjnego wiercenia wzdłuż zaznaczonego obwodu kraniotomii.

Aby wykonać kraniotomię, użyj suwmiarki chirurgicznej, aby sprawdzić średnicę zaznaczonego koła, jak pokazano wcześniej, i wyreguluj w razie potrzeby, tak aby okienko czaszki ściśle przylegało do kraniotomii. Za pomocą elektrycznej wiertarki dentystycznej wytrawić i rozcieńczyć czaszkę wzdłuż zewnętrznej strony zaznaczonego okręgu za pomocą wiertła z węglika spiekanego FG4, które tworzy ścieżkę, w której można przerzedzić czaszkę. Przepłukać obszar solą fizjologiczną, aby zmyć pył kostny.

Kontynuuj rozrzedzanie czaszki za pomocą wiertła z węglika spiekanego FG 1/4, aż czaszka stanie się cienka jak papier i przezroczysta. Okresowo przerywaj wiercenie i ponownie przepłucz cały obszar sterylną solą fizjologiczną, aby zmniejszyć nagrzewanie się wiertła i zmyć pył kostny. Zakończ przerzedzanie czaszki za pomocą wiertła z węglika spiekanego EF4 i kontynuuj przerzedzanie i wiercenie w pozostałej części czaszki wzdłuż toru.

Włóż kleszczyki o grubości 0,5 milimetra z cienką końcówką przez pęknięte miejsce i delikatnie podnieś płat kostny do góry, nie wciskając leżącego pod spodem mózgu. Po usunięciu płata kostnego należy przepłukać obszar kraniotomii solą fizjologiczną. Za pomocą zakrzywionych kleszczy chirurgicznych delikatnie usuń widoczną pajęczynówkę.

Użyj kleszczy chirurgicznych z prostą końcówką, aby podnieść sterylne szklane okienko z trzymilimetrową szklaną szkiełkiem pokrywy skierowaną w dół. Umieść i wyreguluj szklane okienko nad miejscem kraniotomii, aby upewnić się, że okienko może ściśle przylegać do krawędzi kraniotomii. Pięciomilimetrowe szklane szkiełko nakrywkowe znajduje się na górze.

Przygotuj cement dentystyczny, jak pokazano wcześniej, i odczekaj około sześciu minut, aż cement stanie się pastowaty i gęsty. Czekając, aż cement stanie się pastowaty i gęsty, przyłóż odpowiednią siłę nacisku na okno za pomocą manipulatora stereotaktycznego, aby sprawdzić, czy czaszka może bezpiecznie i szczelnie zetknąć się ze szklaną szybą. Użyj regulowanego, precyzyjnego pędzelka z aplikatorem, aby dodać niewielką ilość cementu wzdłuż krawędzi okna, aby uszczelnić szklane okno czaszką.

Odczekaj około 10 minut, aby cement całkowicie wyschł, a następnie delikatnie zwolnij i wyjmij manipulator nad oknem. Zakończ, przycinając cement dentystyczny za pomocą wiertła dentystycznego z wiertłem z węglika spiekanego FG4, jeśli nadmiar cementu zakrywa okno. Po około czterech godzinach od operacji przeprowadzono obrazowanie dwufotonowe, w którym na powierzchownym poziomie naczyń krwionośnych wydawała się, a na głębokim poziomie około 400 mikrometrów ekspresja białka EGFP była rozprowadzona po całym ciele komórki.

Po tygodniu i czterech miesiącach od TBI, wzorzec unaczynienia zaobserwowany w punkcie czasu zero dnia został wykorzystany jako odniesienie do zlokalizowania tego samego regionu obrazowania. Wzorzec unaczynienia jest podobny do tego w dniu zero. Podobnie, ekspresję EGFP wykryto w całym ciele komórki.

Intensywność fluorescencji w dniu zero i po czterech miesiącach była podobna zarówno na poziomie powierzchownym, jak i głębszym. Jednak intensywność fluorescencji po jednym tygodniu była niższa niż w dniu zero i czterech miesiącach, prawdopodobnie z powodu represji translacyjnej zgłoszonej dla innych modeli TBI. Bardzo ważne jest, aby zachować najwyższą ostrożność podczas wykonywania etapu kraniotomii, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.

Nie wkładaj końcówki wiertła do mózgu. Korzystając z tej techniki, naukowcy mogą wizualizować różne białka będące przedmiotem zainteresowania w tej samej komórce wzdłużnie w różnych fazach po TBI, dostarczając informacji na temat lokalizacji, ekspresji i rozpuszczalności tego białka w mózgu ssaków po urazie.