Name: Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj metodę obrazowania odpowiedzi neuronów na uraz mózgu u myszy z okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Technika umożliwia śledzenie ekspresji białek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Miguelowi Sena-Esteves z University of Massachusetts Chan Medical School za podarowanie wirusa AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, oraz Debrze Cameron z University of Massachusetts Chan Medical School za narysowanie szkicu czaszki myszy. Dziękujemy również obecnym i byłym członkom laboratoriów Bosco, Schafer i Henninger za ich sugestie i wsparcie. Praca ta została sfinansowana przez Departament Obrony (W81XWH202071/PRARP) dla DAB, DS i NH.

<ol><li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research%3A+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences%2C+Engineering%2C+and+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li>
<li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Traumatic+Brain+Injury%3A+A+Roadmap+for+Accelerating+Progress%22">Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress</a>. , The National Academies Press. (2022).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60(2021).</li>
<li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li>
<li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li>
<li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+NINDS%2FNIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li>
<li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li>
<li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins%3A+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li>
<li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646(2013).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li>
<li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li>
<li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060(2021).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li>
<li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742(2014).</li>
<li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li>
<li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li>
<li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li>
<li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633(2021).</li>
<li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II%3A+Morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li>
<li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Through-Intact-Skull+%28TIS%29+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLight%22%5BJournal%5D)">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li>
<li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559(2014).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210(2020).</li>
<li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury%3A+A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine%22%5BJournal%5D)">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601(2020).</li>
<li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain%3B+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Los+Angeles+Neurological+Society%22%5BJournal%5D)">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li>
<li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contrecoup-coup+phenomenon%3A+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocritical+Care%22%5BJournal%5D)">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li>
</ol>

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

W tym badaniu wstrzyknięcie AAV, podanie TBI i słupek głowy z implantacją okna czaszkowego połączono w celu analizy obrazowania podłużnego neuronów znakowanych EGFP w korze mózgowej myszy (warstwy IV i V) w celu zaobserwowania wpływu TBI na neurony korowe. W badaniu tym zauważono, że wybrane tutaj miejsce TBI, powyżej hipokampa, zapewnia stosunkowo płaską i szeroką powierzchnię do implantacji okna czaszki. I odwrotnie, czaszka jest stosunkowo wąska z przodu w stosunku do tego miejsca, dlatego trudno jest zapewnić, że słu...

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI), które może wynikać z urazów sportowych, kolizji samochodowych i walk wojskowych, jest ogólnoświatowym problemem zdrowotnym. TBI może prowadzić do deficytów fizjologicznych, poznawczych i behawioralnych oraz niepełnosprawności lub śmiertelności na całe życie1,2. Nasilenie TBI można sklasyfikować jako łagodne, umiarkowane i ciężkie, przy czym zdecydowana większość to łagodne TBI (75%-90%)3. Coraz częściej uznaje się, że TBI, a zwłaszcza powtarzające się wystąpienia TBI, mogą sprzyjać zwyrodnieniu neuronów i służyć jako czynniki ryzyka kilku chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD), stwardnienia zanikowego bocznego (ALS), otępienia czołowo-skroniowego (FTD) i przewlekłej encefalopatii pourazowej (CTE)4,5,6. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw neurodegeneracji wywołanej TBI pozostają niejasne, a zatem stanowią aktywny obszar badań. Aby uzyskać wgląd w to, jak neurony reagują na TBI i regenerują się po TBI, opisano metodę monitorowania fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania, szczególnie w neuronach, za pomocą podłużnego obrazowania przyżyciowego u myszy po TBI.
W tym celu, to badanie pokazuje, jak połączyć procedurę chirurgiczną podawania TBI z zamkniętą czaszką, która jest podobna do tego, co zostało zgłoszone wcześniej7,8, wraz z procedurą chirurgiczną polegającą na wszczepieniu okna czaszkowego do dalszego obrazowania przyżyciowego, zgodnie z opisem Goldey et al9. Warto zauważyć, że nie jest możliwe wszczepienie najpierw okna czaszkowego, a następnie wykonanie TBI w tym samym obszarze, ponieważ wpływ spadku wagi, który wywołuje TBI, może uszkodzić okno i spowodować nieodwracalne szkody dla myszy. Dlatego protokół ten został opracowany tak, aby podać TBI, a następnie wszczepić okno czaszkowe bezpośrednio w miejscu uderzenia, a wszystko to w ramach tej samej sesji chirurgicznej. Zaletą połączenia zarówno TBI, jak i implantacji okna czaszkowego podczas jednej sesji chirurgicznej jest zmniejszenie liczby operacji poddawanych myszy. Co więcej, pozwala monitorować natychmiastową odpowiedź (tj. w skali godzin) na TBI, w przeciwieństwie do wszczepienia okienka podczas późniejszej sesji chirurgicznej (tj. początkowego obrazowania rozpoczynającego się w skali czasowej dni po TBI). Okno czaszkowe i platforma obrazowania przyżyciowego oferują również przewagę nad monitorowaniem białek neuronalnych za pomocą konwencjonalnych metod, takich jak barwienie immunologiczne utrwalonych tkanek. Na przykład do obrazowania przyżyciowego potrzeba mniej myszy, ponieważ ta sama mysz może być badana w wielu punktach czasowych, w przeciwieństwie do oddzielnych kohort myszy potrzebnych do dyskretnych punktów czasowych. Co więcej, te same neurony mogą być monitorowane w czasie, co pozwala śledzić określone zdarzenia biologiczne lub patologiczne w tej samej komórce.
Jako dowód koncepcji, tutaj pokazano specyficzną dla neuronów ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) pod promotorem synapsyny10. Podejście to można rozszerzyć na 1) różne typy komórek mózgowych poprzez wykorzystanie innych promotorów specyficznych dla typu komórki, takich jak promotor podstawowego białka mielinowego (MBP) dla oligodendrocytów i promotor kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) dla astrocytów11 , 2) różne białka docelowe będące przedmiotem zainteresowania poprzez fuzję ich genów z genem EGFP oraz 3) koekspresja wielu białek połączonych z różnymi fluoroforami. W tym przypadku EGFP jest pakowany i wyrażany poprzez dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem (AAV) poprzez wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe. TBI z zamkniętą czaszką podaje się za pomocą urządzenia do zmniejszania wagi, a następnie wszczepia się okno czaszki. Wizualizację neuronalnego EGFP uzyskuje się przez okno czaszkowe, przy użyciu mikroskopii dwufotonowej do wykrywania fluorescencji EGFP in vivo. Dzięki laserowi dwufotonowemu możliwe jest wniknięcie głębiej w tkankę korową przy minimalnym fotouszkodzeniu, co pozwala na wielokrotne obrazowanie podłużne tych samych obszarów korowych u pojedynczej myszy przez dni i do miesięcy12,13,14,15. Podsumowując, to podejście polegające na połączeniu operacji TBI z obrazowaniem przyżyciowym ma na celu pogłębienie wiedzy na temat zdarzeń molekularnych, które przyczyniają się do patologii choroby wywołanej przez TBI16,17.

<table><tbody><tr><td>Regulowane precyzyjne szczotki aplikatora</td> Strzykawka insulinowa <td>Parkell</td><td>S379</td><td></td></tr><tr><td>BD</td><td>BD</td><td>NDC / HRI # 08290-3284-38</td><td>5/16 "x 31G</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue</td><td>NDC67618-151-17</td><td>w tym 7,5% jodu powidonu</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>PAR Farmaceutyczna</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>HIKMA Farmaceutyczny</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczne naczynie do mieszania</td><td>Parkell</td><td>SKU: S387</td><td>Do przygotowania cementu dentystycznego</td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>ZORO</td><td>catlog #: G9531702</td><td></td></tr><tr><td>Katalizator</td><td>Parkell</td><td>S371</td><td>pełna nazwa: "C" Uniwersalny katalizator TBB</td></tr><tr><td>Cement dentystyczny w proszku</td><td>Parkell</td><td>S396</td><td>Radionieprzepuszczalny L-proszek do C& B</td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td> Metabond <td>Foredom</td><td>H.MH-130</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler wierteł dentystycznych</td><td>Foredom</td><td>HP4-310</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-519-05</td><td></td></tr><tr><td>Frez z węglika spiekanego EF4</td><td></td><td>Microcopy Lot # C150113</td><td>Średnica głowicy / Lth / mm 1,0 / 4,2</td></tr><tr><td>Ethonal</td><td>Fisher Scientific</td><td>04355223EA</td><td>75%</td></tr> <tr><td>FG1/4 Wiertło z węglika spiekanego</td><td>Microcopy</td><td>Lot # C150413</td><td>Średnica głowicy / Lgth / mm 0,5 / 0,4</td></tr><tr><td>Frez z węglika spiekanego FG4</td><td>Microcopy</td><td>Lot # C150309</td><td>Średnica głowicy / Lgth / mm 1,4 / 1,1</td></tr><tr><td>Słupek główny</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY NIE DOTYCZY</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura grzewcza</td> na zamówienie <td>CWE</td><td>TC-1000 Mysz</td><td>wyposażona w instrument stereotaktyczny i używana podczas operacji</td></tr><tr><td>Koc grzewczy</td><td>Apteka CVS</td><td>E12107</td><td>dodatkowe urządzenie grzewcze i może być używane po operacji</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pivetal</td><td>NDC 46066-755-03</td><td></td></tr><tr><td>Komora indukcyjna izofluranu</td><td>Vetequip</td><td>89012-688</td><td>komora indukcyjna do krótkiej</td></tr><tr><td>maszyny do ulatniania izofluranu</td><td>Vetequip</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt maszyny do latania izofluranu</td><td>Vetequip</td><td>901801</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny Leica</td><td>Leica</td><td>10450243</td><td></td></tr><tr><td>Lubrykant maść okulistyczna</td><td>Picetal</td><td>NDC 46066-753-55</td><td></td></tr><tr><td>Marker</td><td>Delasco</td><td>SMP-BK</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td></td></tr><tr><td>Pompa mikroiniekcyjna i jej sterownik</td><td>World Precision Instruments</td><td>micro4 i UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka mikrolitrowa</td><td>Hamilton</td><td>Hamilton 80014</td><td>1701 RN, 10 &mu; Miernik L do strzykawki i miernik 32 do igły, 2 cale, styl punktowy 3</td></tr><tr><td>Kleszcze do komarów</td><td>CAROLINA</td><td>Pozycja #:625314</td><td>Stal nierdzewna, zakrzywiona, 5 cali</td></tr><tr><td>Środek do depilacji</td><td>McKesson Corporation</td><td>N/A</td><td>Nair Hair Aloe & Balsam do depilacji lanoliną</td></tr><tr><td>Mikroskop 1</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Mikroskop Nikon do przygotowania okien czaszkowych</td></tr><tr><td>Mikroskop 2</td><td>Mikroskop dwufotonowy</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7 MP</td></tr><tr><td>Laser wielofotonowy</td><td>Koherentny</td><td>kameleon Ultra II, Model: MRU X1, laser VERDI 18W</td><td>do mikroskopii dwufotonowej</td></tr><tr><td>Niewchłanialny szew chirurgiczny</td><td>Aparat Harvarda</td><td>catlog# 59-6860</td><td>6-0, z okrągłą igłą</td></tr><tr><td>Klej optyczny Norland 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>No-Snag Uchwyt na igłę</td><td>CAROLINA</td><td>Pozycja #: 567912</td><td></td></tr><tr><td>Szybka baza płynu</td><td>Parkell</td><td>S398</td><td>"B" Szybka baza do C & B Metabond</td></tr><tr><td>Nożyczki zwykłe 1</td><td>Eurostat</td><td>eurostat es5-300</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki zwykłe 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>nr 501759-G</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szkło osłonowe 1</td><td>Instrumenty Warner</td><td>CS-5R Cat# 64-0700</td><td>do średnicy 5 mm</td></tr><tr><td>Okrągłe szkło osłonowe 2</td><td>instrumenty Warner</td><td>CS-3R Cat# 64-0720</td><td>o średnicy 3 mm</td></tr><tr><td>Pierścienie gumowe</td><td>Orings-Online</td><td>Pozycja # OO-014-70-50</td><td>O-ringi</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Bioworld</td><td>L19102411PR</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe 1</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nr 91500-09</td><td>końcówka prosta</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>nr 91501-09</td><td>końcówka zakrzywiona</td></tr><tr><td>Platforma stereotaktyczna</td><td>KOPF</td><td>Model 900LS</td><td></td></tr><tr><td>Super klej</td><td>Henkel</td><td>Pozycja #: Światowa</td> suwmiarka chirurgiczna 1647358 <td></td></tr><tr><td></td><td>Instrumenty precyzyjne</td><td>nr 501200</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne 1</td><td>MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA NAUKI</td><td>Catlog # 0508-5 / 45-PO</td><td>styl 5/45, zakrzywiony</td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne 2</td><td>NAUKI O MIKROSKOPII ELEKTRONOWEJ</td><td>catlog # 0103-5-PO</td><td>styl 5, prosty</td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne 3</td><td>NAUKI</td> <td>O MIKROSKOPII ELEKTRONOWEJcatlog# 72912</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne 4</td><td>NAUKI MIKROSKOPII ELEKTRONOWEJ</td><td>Catlog# 0508-5/45-PO</td><td>styl 5/45, zakrzywiony</td></tr><tr><td>Gaza chirurgiczna</td><td>ZORO</td><td>catlog #: G0593801</td><td></td></tr><tr><td>Lampa chirurgiczna</td><td>Leica</td><td>Leica KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>UV box</td><td>Spectrolinker</td><td>XL-1000</td><td>zwany również sieciownikiem UV</td></tr><tr><td>Vaporguard</td><td>Vetequip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Klej tkankowy Vetbond</td><td>3M Animal Care</td><td>Numer części:014006</td><td></td></tr></tbody></table>

przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak podłużnie wizualizować ekspresję i lokalizację interesującego białka w określonych typach komórek mózgu zwierzęcia, po ekspozycji na bodźce egzogenne. W tym miejscu pokazano podawanie urazowego uszkodzenia mózgu w zamkniętej czaszce (TBI) i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego w celu późniejszego podłużnego obrazowania przyżyciowego u myszy. Myszom wstrzykuje się doczaszkowo wirusa związanego z adenowirusem (AAV) wykazującym ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) pod specyficznym dla neuronów promotorem. Po 2 do 4 tygodniach myszy są poddawane powtarzającemu się TBI za pomocą urządzenia do obniżania masy ciała w miejscu wstrzyknięcia AAV. W ramach tej samej sesji chirurgicznej myszom wszczepia się metalowy słupek na głowę, a następnie szklane okno czaszki nad miejscem uderzenia TBI. Ekspresję i lokalizację komórkową EGFP bada się za pomocą mikroskopu dwufotonowego w tym samym obszarze mózgu narażonym na uraz w ciągu kilku miesięcy.

Jako dowód koncepcji dla niniejszego protokołu, cząstki wirusowe wykazujące AAV-Syn1-EGFP zostały wstrzyknięte do kory mózgu samców myszy TDP-43Q331K/Q331K (tło C57BL/6J)19 w wieku 3 miesięcy. Należy zauważyć, że można również użyć zwierząt typu dzikiego C57BL/6J, jednak badanie to zostało przeprowadzone na myszach TDP-43Q331K/Q331K, ponieważ laboratorium koncentruje się na badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Operację TBI przeprowadzono 4 tygodnie po wstrzyknięciu A...

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Nasz protokół zapewnia sposób wizualizacji reakcji neuronalnej na stres mechaniczny u żywej myszy, co może dostarczyć bezpośrednich dowodów na to, jak urazowe uszkodzenie mózgu wpływa na mózg. Technika ta może monitorować białko docelowe w tym samym miejscu mózgu u tego samego zwierzęcia zarówno w ostrej, jak i przewlekłej fazie po urazowym uszkodzeniu mózgu. Interesujący nas gen i promotor wirusa mogą być odpowiednio zmienione w celu zbadania innych białek w określonych typach komórek w mózgu.Na początek nałóż maść okulistyczną na znieczulone oczy myszy. Usuń włosy z czubka głowy, przycinając je zwykłymi nożyczkami. Po ustanowieniu nacięcia linii środkowej o długości od 12 do 15 milimetrów, wytnij skórę nad lewą i prawą półkulą czaszki za pomocą nożyczek sprężynowych z zakrzywioną końcówką.Po odsłonięciu czaszki usuń okostną, delikatnie pocierając ją sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką i spłukując sterylną solą fizjologiczną. Po wysuszeniu obszaru czaszki zaznacz miejsce uderzenia Traumatic Brain Injury (TBI) we współrzędnych 2,5 milimetra za bregmą i dwa milimetry w bok od szwu strzałkowego w prawo. Szybko wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i połóż głowę na poduszce buforowej pod urządzeniem TBI.Dopasuj końcówkę impaktora do zaznaczonego miejsca uderzenia. Podnieś metalową kolumnę, ciągnąc nylonowy sznurek na uwięzi 15 centymetrów nad głową myszy, a następnie zwolnij go, pozwalając ciężarkowi swobodnie opaść na pręt przetwornika, który styka się z górną częścią czaszki w miejscu TBI. Umieść znieczuloną głowę myszy na stereotaktycznej ramie trzymanej pod mikroskopem operacyjnym.Delikatnie i powoli nawiercić powierzchnię czaszki za pomocą wiertła z węglika spiekanego FG4 przy niskiej prędkości wirnika, aby usunąć pozostałą okostną i stworzyć szorstką powierzchnię czaszki, tak aby cement dentystyczny bezpiecznie wiązał się z czaszką. Użyj soli fizjologicznej, aby przepłukać i usunąć pył kostny z powierzchni czaszki. Aby oddzielić mięśnie boczne od czaszki, około pięciu milimetrów za okiem, gdzie znajduje się szew łączący czaszkę ciemieniową i skroniową, delikatnie włóż cienkie zamknięte końcówki i delikatnie przesuwaj zamknięte końcówki w kierunku tylnym, aż do szwu lambdoidalnego.Oddziel mięśnie boczne po stronie, po której nastąpi implantacja okna czaszki. Zmyj zanieczyszczenia z pola operacyjnego za pomocą soli fizjologicznej i osusz obszar gazą. Aby wszczepić słupek głowy, zaznacz punkt środkowy 2,5 milimetra za bregmą i 1,5 milimetra od szwu strzałkowego na prawej półkuli za pomocą markera i suwmiarki chirurgicznej.Następnie odrysuj obwód kraniotomii na czystej i suchej czaszce. Poluzuj nausznik i obróć głowę tak, aby płaszczyzna kraniotomii była idealnie pozioma, a następnie ponownie dokręć nausznik. Użyj drewnianego patyczka aplikatora z bawełnianą końcówką, aby dodać dwie małe krople superglue do przedniej i tylnej krawędzi słupka głównego.Umieść tytanowy słupek głowy nad środkiem kraniotomii i szybko wyreguluj go tak, aby spoczywał w tej samej płaszczyźnie, w której zostanie wszczepione okno czaszki. Lekko dociśnij, aż superglue wyschnie, co zwykle trwa około 30 sekund. Przygotuj cement dentystyczny we wstępnie schłodzonym naczyniu ceramicznym, dokładnie mieszając 300 miligramów proszku cementowego, sześć kropli płynu QuickBase i jedną kroplę katalizatora.Szybko nałóż dużą ilość mieszanki cementu dentystycznego na zewnętrzny obwód wyznaczonego obwodu i przykryj odsłoniętą powierzchnię kości. Nie należy jednak zakrywać miejsca kraniotomii. Zwolnij pałąk na ucho i przymocuj słupek głowy do metalowej ramy, aby upewnić się, że głowa jest stabilna do precyzyjnego wiercenia wzdłuż zaznaczonego obwodu kraniotomii.Aby wykonać kraniotomię, użyj suwmiarki chirurgicznej, aby sprawdzić średnicę zaznaczonego koła, jak pokazano wcześniej, i wyreguluj w razie potrzeby, tak aby okienko czaszki ściśle przylegało do kraniotomii. Za pomocą elektrycznej wiertarki dentystycznej wytrawić i rozcieńczyć czaszkę wzdłuż zewnętrznej strony zaznaczonego okręgu za pomocą wiertła z węglika spiekanego FG4, które tworzy ścieżkę, w której można przerzedzić czaszkę. Przepłukać obszar solą fizjologiczną, aby zmyć pył kostny.Kontynuuj rozrzedzanie czaszki za pomocą wiertła z węglika spiekanego FG 1/4, aż czaszka stanie się cienka jak papier i przezroczysta. Okresowo przerywaj wiercenie i ponownie przepłucz cały obszar sterylną solą fizjologiczną, aby zmniejszyć nagrzewanie się wiertła i zmyć pył kostny. Zakończ przerzedzanie czaszki za pomocą wiertła z węglika spiekanego EF4 i kontynuuj przerzedzanie i wiercenie w pozostałej części czaszki wzdłuż toru.Włóż kleszczyki o grubości 0,5 milimetra z cienką końcówką przez pęknięte miejsce i delikatnie podnieś płat kostny do góry, nie wciskając leżącego pod spodem mózgu. Po usunięciu płata kostnego należy przepłukać obszar kraniotomii solą fizjologiczną. Za pomocą zakrzywionych kleszczy chirurgicznych delikatnie usuń widoczną pajęczynówkę.Użyj kleszczy chirurgicznych z prostą końcówką, aby podnieść sterylne szklane okienko z trzymilimetrową szklaną szkiełkiem pokrywy skierowaną w dół. Umieść i wyreguluj szklane okienko nad miejscem kraniotomii, aby upewnić się, że okienko może ściśle przylegać do krawędzi kraniotomii. Pięciomilimetrowe szklane szkiełko nakrywkowe znajduje się na górze.Przygotuj cement dentystyczny, jak pokazano wcześniej, i odczekaj około sześciu minut, aż cement stanie się pastowaty i gęsty. Czekając, aż cement stanie się pastowaty i gęsty, przyłóż odpowiednią siłę nacisku na okno za pomocą manipulatora stereotaktycznego, aby sprawdzić, czy czaszka może bezpiecznie i szczelnie zetknąć się ze szklaną szybą. Użyj regulowanego, precyzyjnego pędzelka z aplikatorem, aby dodać niewielką ilość cementu wzdłuż krawędzi okna, aby uszczelnić szklane okno czaszką.Odczekaj około 10 minut, aby cement całkowicie wyschł, a następnie delikatnie zwolnij i wyjmij manipulator nad oknem. Zakończ, przycinając cement dentystyczny za pomocą wiertła dentystycznego z wiertłem z węglika spiekanego FG4, jeśli nadmiar cementu zakrywa okno. Po około czterech godzinach od operacji przeprowadzono obrazowanie dwufotonowe, w którym na powierzchownym poziomie naczyń krwionośnych wydawała się, a na głębokim poziomie około 400 mikrometrów ekspresja białka EGFP była rozprowadzona po całym ciele komórki.Po tygodniu i czterech miesiącach od TBI, wzorzec unaczynienia zaobserwowany w punkcie czasu zero dnia został wykorzystany jako odniesienie do zlokalizowania tego samego regionu obrazowania. Wzorzec unaczynienia jest podobny do tego w dniu zero. Podobnie, ekspresję EGFP wykryto w całym ciele komórki.Intensywność fluorescencji w dniu zero i po czterech miesiącach była podobna zarówno na poziomie powierzchownym, jak i głębszym. Jednak intensywność fluorescencji po jednym tygodniu była niższa niż w dniu zero i czterech miesiącach, prawdopodobnie z powodu represji translacyjnej zgłoszonej dla innych modeli TBI. Bardzo ważne jest, aby zachować najwyższą ostrożność podczas wykonywania etapu kraniotomii, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.Nie wkładaj końcówki wiertła do mózgu. Korzystając z tej techniki, naukowcy mogą wizualizować różne białka będące przedmiotem zainteresowania w tej samej komórce wzdłużnie w różnych fazach po TBI, dostarczając informacji na temat lokalizacji, ekspresji i rozpuszczalności tego białka w mózgu ssaków po urazie.

intravital-imaging-fluorescent-protein-expression-mice-with-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film pokazuje przebieg urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) u myszy. Po odsłonięciu czaszki zaznacza się miejsce TBI. Mysz jest następnie umieszczana pod urządzeniem TBI. Uderzenie odbywa się poprzez podniesienie metalowego pręta i umożliwienie mu swobodnego opadnięcia na impaktor, który styka się z czaszką.

Dostarczenie urazowego uszkodzenia mózgu do mózgu myszy

Źródło: Bisht, K., et al. Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne dynamiki neuroimmunologicznej u transgenicznej myszy z implantem czaszki. Stabilność naczyniowa i neuronalna jest obrazowana wraz z dynamicznymi zmianami mikrogleju, odzwierciedlającymi odpowiedzi immunologiczne na aktywność neuronów.

Obrazowanie fluorescencyjne dynamiki neuroimmunologicznej za pomocą implantu czaszki

Source: Nishimura, C.  Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego wirusem HIV. J. Vis. Exp. (2016). Ten film pokazuje wizualizację in vivo naczyń włosowatych kory mózgowej myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Przedstawiono w nim etapy wstrzykiwania barwnika fluorescencyjnego znieczulonej myszy z cienkim oknem korowym czaszki, przygotowywania zestawu do obrazowania i uzyskiwania szczegółowych obrazów struktur...

 Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania in vivo mikrokrążenia mózgu myszy 

Zależne od doświadczenia zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne.  Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Przezczaszkowe obrazowanie optyczne umożliwia szerokie obrazowanie transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w korze mózgowej żywych myszy przez nienaruszoną czaszkę.

Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Poznaj metodę obrazowania odpowiedzi neuronów na uraz mózgu u myszy z okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Technika umożliwia śledzenie ekspresji białek w czasie rzeczywistym.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego (Wideo) | JoVE Journal

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Przeglądaj więcej filmów