Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny
18 listopada 2022
W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.
Metoda ta pomaga odpowiedzieć na pytania dotyczące tego, czy stan zmienia integralność bariery jelitowej lub na pytania, czy potencjalne leczenie może utrzymać integralność bariery jelitowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje nieinwazyjną, nieobciążającą technikę oceny i ilościowego określania przepuszczalności jelit in vivo. Na początek pościć myszy przez cztery godziny, a następnie podać 200 mikrolitrów zawiesiny FITC-dekstranu przez zgłębnik doustny każdej myszy za pomocą 38-milimetrowej, wysterylizowanej zakrzywionej igły do zgłębnika.
Uruchom stoper po pierwszym zgłębniku i odczekaj od pięciu do 10 minut między każdym zgłębkiem, aby umożliwić pomiary in vivo, utrzymując godzinę po zgłębniku. Pozostałą zawiesinę FITC-dekstran należy zachować dla krzywej standardowej. Uruchom maszynę i oprogramowanie, klikając i przytrzymując przycisk start i poczekaj, aż system się rozgrzeje.
Kliknij Stan urządzenia i upewnij się, że wszystkie skonfigurowane urządzenia wyświetlają OK, zanim przejdziesz dalej. Następnie kliknij Nowy badanie i zapisz plik o żądanej nazwie. Następnie kliknij Opcje badania.
Wprowadź identyfikator próbki i wybierz odpowiedni laser i eksperyment. Następnie usuń sierść z okolicy brzucha za pomocą golarki elektrycznej i obficie nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Otwórz komorę obrazowania i umieść zwierzę grzbietowo na płytce skanującej.
Następnie zabezpiecz kończyny i ogon taśmą. Następnie wybierz obszar do zeskanowania za pomocą narzędzia Rysuj. Upewnij się, że obejmuje całą szerokość brzucha od tuż nad wątrobą do odbytnicy.
Następnie kliknij narzędzie Modyfikuj, aby dostosować obszar po narysowaniu. Ustaw rozdzielczość skanowania na 2,0 milimetra i kliknij Start, aby rozpocząć skanowanie. Następnie otwórz pliki obrazów, znajdując je pod wybraną nazwą pliku i jednocześnie otwórz wszystkie pliki z zsynchronizowanymi ustawieniami.
Korzystając z paska narzędzi ustawień obrazu, użyj przycisków Synchronizuj obraz i Skala synchronizacji, aby zsynchronizować ustawienia obrazu w celu dokładnego porównania. Następnie zapisz obrazy z dostosowanymi skalami. Porównaj fluorescencję jamy brzusznej każdego zwierzęcia i myszy kontrolnej na jednolicie skalowanych obrazach za pomocą oprogramowania powiązanego z systemem obrazowania.
Zbierz granulkę kału od każdej myszy w sterylnej probówce cztery godziny po zgłębniku. Następnie trzymaj rurki na lodzie i umieść je w ciemności. Następnie odwirować próbki krwi o masie 9,390 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie przenieś osocze do nowej sterylnej probówki i trzymaj ją na lodzie w ciemności. Rozcieńczyć 50 miligramów próbek kału w 200 mikrolitrach PBS i rozcieńczyć osocze PBS w stosunku jeden do dwóch. Umieść 100 mikrolitrów próbek i wzorców w nieprzezroczystej czarnej 96-dołkowej płytce.
Odczyt fluorescencji na czytniku płytek fluorescencyjnych ze wzbudzeniem na 485 nanometrach i absorpcją na 530 nanometrach. Na koniec należy określić stężenie dekstranu FITC-w próbce, porównując fluorescencję ze znanymi stężeniami krzywej wzorcowej. Analiza fluorescencji in vivo wykazała, że myszy, które otrzymywały tylko dietę kontrolną, miały wyższe spożycie FITC-dekstranu w wątrobie i wyższy poziom fluorescencji resztkowej w jamie brzusznej w porównaniu z myszami, które otrzymywały dietę uzupełnianą inuliną.
Myszy, które otrzymywały dietę uzupełnianą inuliną, miały znacznie niższy poziom dekstranu FITC w osoczu w porównaniu z myszami, które otrzymywały tylko dietę kontrolną. Zgodnie z tym, myszy, które otrzymywały dietę inulinową, miały znacznie wyższy poziom dekstranu FITC w kale niż myszy, które otrzymywały tylko dietę kontrolną. Niższe poziomy dekstranu FITC-dekstranu w kale kontrolowanych myszy wskazują, że przenikał on przez barierę jelitową do krążenia, a nie był odpowiednio wydalany.
Wysoki poziom dekstranu FITC-dekstranu w osoczu potwierdził to odkrycie. Czas jest niezbędny podczas próby tej procedury. Odczyt fluorescencji i pobranie próbki powinny nastąpić jak najbliżej jednej godziny i czterech godzin po zgłębniku dla każdej myszy z osobna.
Przegląd
W niniejszym badaniu oceniono przepuszczalność jelit u myszy z wykorzystaniem dekstranu znakowanego fluoresceinią izotiocyjanianem (FITC), podanego drogą zgłębnikową. Metoda ta umożliwia ocenę funkcji bariery jelitowej in vivo, co jest kluczowe dla zrozumienia różnych procesów chorobowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Integralność bariery jelitowej
- Badania na modelach zwierzęcych
- Nieinwazyjne techniki oceny
Wprowadzenie
- Przepuszczalność jelit jest często zmieniona w stanach chorobowych.
- Utrzymanie integralności bariery jelitowej ma krytyczne znaczenie dla zdrowia.
- W badaniach na zwierzętach preferowane są metody nieinwazyjne.
Zastosowane metody
- Podawanie FITC-dekstranu poprzez zgłębnik doustny
- Myszy jako eksperymentalny system biologiczny
- Fluorymetryczny czytnik płytek do kwantyfikacji
Główne wyniki
- Myszy na diecie kontrolnej wykazały wyższe poziomy fluorescencji w wątrobie w porównaniu z myszami na diecie uzupełnionej inuliną.
- Niższe poziomy FITC-dekstranu w osoczu zaobserwowano u myszy otrzymujących dietę z inuliną.
- Myszy z dodatkiem inuliny wykazały wyższe poziomy FITC-dekstranu w kałku, co wskazuje na skuteczne utrzymanie bariery jelitowej.
Wnioski
- Niniejsze badanie demonstruje niezawodną metodę oceny funkcji bariery jelitowej.
- Wyniki podkreślają znaczenie interwencji dietetycznych w utrzymaniu integralności jelit.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena integralności bariery jelitowej jest kluczowa dla minimalizacji ryzyka w programach we wczesnej fazie, ukierunkowanych na zdrowie jelit i zapalenia systemowe. Test z użyciem FITC-dekstranu zapewnia bezpośredni, w czasie rzeczywistym odczyt przepuszczalności jelit, umożliwiając wiarygodną ocenę interwencji terapeutycznych i modyfikacji dietetycznych w modelach przedklinicznych. Możliwość ta wspiera podejmowanie decyzji prognostycznych na styku biologii odkrywczej i badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią ocenę funkcji bariery jelitowej jako punktu końcowego w badaniach mechanistycznych.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka w przypadku celów terapeutycznych modulujących integralność błony śluzowej.
- Zwiększa pewność prognostyczną podczas wyboru kandydatów w odniesieniu do wskazań związanych z jelitami.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Zapewnia zwalidowany, ilościowy system pomiaru przepuszczalności jelitowej in vivo.
- Standaryzuje wyniki analizy w celu zapewnienia powtarzalności w badaniach przesiewowych związków i interwencji dietetycznych.
- Umożliwia skalowalną, nieinwazyjną ocenę modulatorów bariery jelitowej w modelach zwierzęcych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica przedkliniczne wyniki badań z istotnymi dla choroby biomarkerami zdrowia jelit.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrywania po przedkliniczną walidację terapii celowanych w barierę jelitową.
- Uzasadnia decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka i wyniki funkcjonalne bariery jelitowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten test z wykorzystaniem FITC-dekstranu wpisuje się w proces przechodzenia od etapu odkryć do badań przedklinicznych, stanowiąc pomost między badaniami nad mechanizmami a translacyjną walidacją biomarkerów funkcji bariery jelitowej.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie wpływu interwencji genetycznych, dietetycznych lub farmakologicznych na przepuszczalność śluzówki.
- Przesiewanie: Dostarczanie powtarzalnych, ilościowych wyników w celu porównania potencjalnych interwencji.
- Analityka: Zapewnienie pomiarów opartych na fluorescencji, umożliwiających statystyczne porównanie integralności bariery jelitowej w różnych grupach.
- Badania translacyjne: Zgodność ze strategiami biomarkerów klinicznych dla przepuszczalności jelitowej podczas rozwoju kandydatów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferowanie ustandaryzowanej, wielokrotnego użytku platformy do oceny bariery jelitowej w wielu programach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie modulacji bariery jelitowej i walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i przepustowość testów w procesach przedklinicznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez dostarczanie bezpośrednich odczytów funkcjonalnych dotyczących integralności bariery.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów ukierunkowanych na zdrowie jelit lub zapalenia układowe z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obchodzeniu się ze zwierzętami, podawaniu preparatów drogą gavage oraz obrazowaniu fluorescencyjnym.
- Wymagany jest dostęp do systemów obrazowania in vivo oraz czytników płytek fluorescencyjnych.
- W celu zapewnienia powtarzalności niezbędna jest standaryzacja czasu i przetwarzania próbek pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w różnych modelach interwencji dietetycznych, genetycznych lub farmakologicznych u myszy.
- Moment pobrania próbek ma kluczowe znaczenie dla dokładnej oceny przepuszczalności.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Administration of FITC-Dextran
1:09
In Vivo Fluorescence Measurement
2:44
Fluorescence Measurement in Fecal Samples and Plasma
3:50
Results: Dietary Supplementation with Inulin and the Translocation of FITC-Dextran
4:45
Conclusion
