Name: In vivo (in vivo) Dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Poznaj metodę wstrzyknięcia doprzewodowego do komórek nabłonka sutka myszy przy użyciu wektorów wirusowych. Technika ta umożliwia kontrolowane dostarczanie materiału genetycznego, poprawiając modelowanie naturalnej genezy nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Gary'emu Chamnessowi za jego pomocne komentarze na temat tego manuskryptu. Prace te były wspierane przez Departament Obrony (DOD), CDMRP BC191649 (YL) i BC191646 (YL), a także National Institutes of Health (NIH) CA271498 (YL). Autorzy chcieliby podziękować Breast Center Pathology Core Facility wspieranemu przez SPORE P50CA186784 oraz Cytometry and Cell Sorting Core wspieranemu przez CPRIT-RP180672, NIH CA125123 i RR024574 z pomocą Joela M. Sederstroma.

Wszystkie procedury z użyciem myszy zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Committee protokołem dla zwierząt. W niniejszym badaniu wykorzystano 9-12-tygodniowe samice myszy FVB/N lub MMTV-tva. Myszy zostały pozyskane komercyjnie lub samodzielnie wykonane (patrz tabela materiałów). Wykorzystano wirusy Lenti-EGFP (FUCGW) i RCAS-Erbb2 (Neu). Przygotowanie wirusa i określenie miana przeprowadzono zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami10,12.
1. Przygotowanie strzykawki
<ol>
	<li>Przytnij metalowe igły piasty 33 G (patrz Tabela materiałów) na około 1 cm długości. Po autoklawowaniu należy przechowywać igły i strzykawkę o pojemności 50 μl w 70% alkoholu.</li>
	<li>Wyjmij strzykawki i igły z alkoholu. Wypchnąć pozostały alkohol ze strzykawki i igły. Zdemontować strzykawkę w celu wysuszenia na powietrzu na autoklawowanej chłonnej podkładce stołowej.</li>
	<li>Zmontować strzykawkę po wyschnięciu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wirusa
<ol>
	<li>W razie potrzeby wyjąć jedną lub kilka probówek z wirusem z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić wirusa na lodzie. 
	UWAGA: W zależności od liczby komórek, które mają zostać zainfekowane, wirus może wymagać rozcieńczenia do zamierzonych mian przy użyciu 1x PBS w tym czasie.</li>
	<li>Dodać błękit bromofenolowy, zanurzając końcówkę pipety na głębokość 1 cm w proszku błękitu bromofenolowego (patrz tabela materiałów). Następnie wprowadzić dołączoną śladową ilość błękitu bromofenolowego do zawiesiny wirusa. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu zapas wirusa wynosi zwykle 200 μl na probówkę, więc końcowe stężenie barwnika wynosi około 0,2% (0,2 μg/100 μL). Błękit bromofenolowy należy sterylizować promieniowaniem mikrofalowym przez 45 sekund przy dużej mocy 1250 W (patrz Tabela Materiałów). Upewnij się, że cała procedura odbywa się w sterylnym środowisku.</li>
	<li>Zmieszać błękit bromofenolowy z roztworem wirusa, pipetując 10 razy w górę i w dół.</li>
	<li>Umieść wirusa na lodzie i przynieś wiaderko z lodem do wiwarium.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Znieczulić samicę myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 2 μl/g środka znieczulającego (37,6 mg/ml ketaminy, 1,92 mg/ml ksylazyny i 0,38 mg/ml acepromazyny, patrz tabela materiałów). Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą szczypania palca u nogi. Nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. 
	UWAGA: Mysz nie może reagować na szczypanie palców u nóg w dobrym znieczuleniu. Izofluran może być również stosowany do znieczulania myszy.</li>
	<li>Połóż mysz w pozycji leżącej na ciepłej podkładce i przymocuj wszystkie cztery kończyny do ławki za pomocą taśmy klejącej.</li>
	<li>Zidentyfikuj jeden sutek (lub więcej) do wstrzyknięcia (w niniejszym badaniu preferowany jest numer 4). Odsłoń go, przycinając otaczające włosy za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Nałóż 70% waciki nasączone alkoholem i jodoforem na obszar sutka w trzech rundach, aby oczyścić i odsłonić sutek.</li>
</ol>
4. Wewnętrzna iniekcja wirusa
UWAGA: Lampa powiększająca może być użyta do wizualizacji otworu sutkowego.
<ol>
	<li>Przeciąć dystalną końcówkę brodawki sutkowej za pomocą sterylnych nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji, aż pod lampą powiększającą będzie widoczny mały centralny otwór kanałowy (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Do strzykawki wsypać 10 μl mieszaniny wirusa/błękitu bromofenolowego. 
	UWAGA: W tej demonstracji używane są Lenti-EGFP (FUCGW) i RCAS-Erbb2 (Neu).</li>
	<li>Ostrożnie włóż igłę do otworu sutka za pomocą lampy powiększającej. Orientacja igły jest nieznacznie regulowana od przyśrodkowej do bocznej, aby wyrównać się z głównym kanałem.</li>
	<li>Wstrzyknąć całe 10 μl wirusa do drzewa kanałowego. 
	UWAGA: Kanaliki pod skórą powinny zmienić kolor na niebieski, jeśli wstrzyknięcie się powiedzie. Wszelki opór lub pojawienie się miejscowej zmiany koloru wskazuje na niepowodzenie iniekcji.</li>
	<li>Umieść mysz na podgrzewaczu do slajdów ustawionym na 45 °C, aż mysz całkowicie się wybudzi (~30-60 min).</li>
</ol>
5. Wykrywanie zainfekowanych komórek za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego
<ol>
	<li>Trzy do pięciu dni po wstrzyknięciu wirusa przenoszącego GFP lub inne geny fluorescencyjne należy poddać mysz eutanazji poprzez nadmierne dawkowanie 4 μl/g środka znieczulającego (37,6 mg/ml ketaminy, 1,92 mg/ml ksylazyny i 0,38 mg/ml acepromazyny).</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową. Przetnij skórę wzdłuż brzusznej linii środkowej oraz wzdłuż kończyn górnych i dolnych za pomocą nożyczek. Podnieś skórę i odsłoń gruczoły sutkowe.</li>
	<li>Usunąć wstrzyknięty gruczoł sutkowy ze skóry za pomocą kleszczy i nożyczek. Należy również usunąć niewstrzyknięty gruczoł jako kontrolę.</li>
	<li>Umieść gruczoły sutkowe na szklanych szkiełkach i rozprowadź gruczoły do ich pierwotnego kształtu.</li>
	<li>Obserwuj i obrazuj gruczoły pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.</li>
</ol>

<ol><li>Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen%2C+D-A+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer+Research.+Eds+Margot%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot</a>. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).</li>
<li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li>
<li>Costantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+a+rabbit+beta-globin+gene+into+the+mouse+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line.</a> Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).</li>
<li>Brinster, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+expression+of+herpes+thymidine+kinase+in+mice+following+injection+of+a+fusion+gene+into+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs.</a> Cell. 27 (1), 223-231 (1981).</li>
<li>Du, Z., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RCAS-TVA+in+the+mammary+gland%3A+an+in+vivo+oncogene+screen+and+a+high+fidelity+model+for+breast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation.</a> Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).</li>
<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+precancerous+stem+and+non-stem+cells+evolve+into+cancers+of+distinct+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes.</a> Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).</li>
<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+6a+marks+mammary+bipotential+progenitor+cells+that+can+give+rise+to+a+unique+tumor+model+resembling+human+normal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer.</a> Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).</li>
<li>Haricharan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+an+alveolar+cell+of+origin+to+the+high-grade+malignant+phenotype+of+pregnancy-associated+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer.</a> Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).</li>
<li>Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+cells+with+active+Wnt+signaling+resist+ErbB2-induced+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis.</a> PLoS One. 8 (11), 78720(2013).</li>
<li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+oncogenes+into+mammary+glands+in+vivo+with+an+avian+retroviral+vector+initiates+and+promotes+carcinogenesis+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).</li>
<li>Siwko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-mediated+oncogene+introduction+into+mammary+cells+in+vivo+induces+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors.</a> Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).</li>
<li>Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+mammary+epithelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).</li>
<li>Russell, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+the+mammary+epithelium+with+adenovirus+vectors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo.</a> Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).</li>
<li>Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated-virus-mediated+transduction+of+the+mammary+gland+enables+sustained+production+of+recombinant+proteins+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk.</a> Scientific Reports. 5, 15115(2015).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li>
<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Mitani, K., Kubo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+as+an+integrating+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adenovirus as an integrating vector.</a> Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).</li>
<li>McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+and+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors.</a> Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).</li>
<li>Bu, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+of+lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+rat+mammary+epithelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+individual+somatic+mammary+cells+in+vivo+reveals+a+master+role+of+STAT5a+in+inducing+alveolar+fate+commitment+and+lactogenesis+even+in+the+absence+of+ovarian+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones.</a> Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).</li>
<li>Haricharan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+preclinical+prevention+of+increased+breast+cancer+risk+caused+by+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy.</a> eLife. 2, 00996(2013).</li>
<li>Reddy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+ATM-mediated+barrier+to+tumorigenesis+in+somatic+mammary+cells+following+ErbB2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PR+status+of+the+originating+cell+of+ER%2FPR-negative+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors.</a> Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).</li>
<li>Young, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+pro-survival+protein+BCL-2+to+prevent+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prevention+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer.</a> Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).</li>
<li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+lentiviral+vector+exposures+and+prevention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+and+Environmental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li>
<li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krt6a-positive+mammary+epithelial+progenitors+are+not+at+increased+vulnerability+to+tumorigenesis+initiated+by+ErbB2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2.</a> PLoS One. 10 (1), 0117239(2015).</li>
<li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+into+a+defined+subset+of+mammary+cells+demonstrates+that+the+initiating+oncogenic+mutation+defines+the+resulting+tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype.</a> International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).</li>
<li>Hein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+epithelial+cells+within+the+mammary+gland+can+produce+basal+cells+upon+oncogenic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress.</a> Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).</li>
<li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+CRISPR-Cas9+base+editing+for+the+development+of+genetically+engineered+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer.</a> EMBO Journal. 39 (5), 102169(2020).</li>
<li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+invasive+lobular+breast+carcinoma+by+CRISPR%2FCas9-mediated+somatic+genome+editing+of+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland.</a> Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).</li>
</ol>

Obaj autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W artykule przedstawiono technikę iniekcji doprzewodowej wirusa w celu wprowadzenia genów do komórek nabłonka sutka myszy w celu modelowania sporadycznego raka piersi. Zwykle wstrzykuje się myszom w wieku co najmniej 5 tygodni lub starszym, aby proces onkogenny rozpoczął się po rozwinięciu gruczołu sutkowego. Poza tym otwór sutkowy u myszy w wieku poniżej 5 tygodni jest często zbyt mały do wstrzyknięcia. Z drugiej strony, sutki bardzo starych myszy są czasami zdegenerowane, a przecięcie może nie ujawnić otworu przewodowe...

Komórki nabłonkowe gruczołów sutkowych odgrywają główną rolę w funkcjonowaniu tych gruczołów i są główną komórką pochodzenia raka piersi. Badania nad biologią gruczołu sutkowego i nowotworzeniem często wymagają dostarczenia genów będących przedmiotem zainteresowania do tych komórek. Każdy gruczoł sutkowy myszy składa się z drzewa przewodowego wyściełanego komórkami nabłonkowymi z pojedynczym otworem na końcu brodawki. Taka struktura sprawia, że komórki nabłonka sutka są łatwo dostępne dla wektorów wirusowych, które mogą być dostarczane do światła drzewa przewodowego poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe1.
Technika iniekcji doprzewodowej sutka była pierwotnie stosowana dla znacznie większych zwierząt, takich jak kozy, króliki i szczury1. W przypadku znacznie mniejszych zwierząt, takich jak myszy, wstrzyknięcie wewnątrzprzewodowe wymaga wielu delikatnych narzędzi i większej liczby ćwiczeń operatorów. Istnieją dwa podejścia do wstrzykiwania doprzewodowego u myszy. Jednym z nich jest wstrzyknięcie strzyka1. Innym jest bezpośrednie wstrzyknięcie do przewodu pierwotnego gruczołu sutkowego #3 lub #4 po ekspozycji chirurgicznej1. Ponieważ pierwsza z nich jest nieinwazyjna i szybsza, gdy operator jest dobrze przeszkolony, technika ta jest częściej stosowana i zostanie szczegółowo opisana w tym artykule.
W porównaniu do powszechnie stosowanych tradycyjnych transgenicznych modeli myszy, w których interesujący nas gen jest wprowadzany na etapie zapłodnienia jaj poprzez mikroiniekcję2,3,4, dostarczanie genów metodą wewnątrzprzewodowej iniekcji wirusa ma wiele zalet, w tym: (1) pozwala uniknąć czasochłonnego procesu tworzenia transgenicznej linii myszy dla każdego interesującego genu; (2) pozwala uniknąć potencjalnego upośledzenia normalnego rozwoju gruczołów mlecznych narzuconego przez gen będący przedmiotem zainteresowania; (3) wprowadza interesujący nas gen w dowolnym momencie po urodzeniu; (4) może z łatwością współwprowadzać więcej niż jeden gen będący przedmiotem zainteresowania; (5) lepiej naśladuje naturalny proces rakotwórczy, ponieważ zakażone, a tym samym przenoszące onkogeny komórki, są otoczone przez normalne komórki; oraz (6) w połączeniu z technologią TVA (wirus nowotworowy A, białko powierzchniowe komórek ptasich i receptor dla wektora RCAS retrowirusa)5, gen będący przedmiotem zainteresowania może zostać wprowadzony do określonej populacji komórek w celu zbadania pochodzenia komórek nowotworowych i przeprowadzenia testów śledzenia linii komórkowych w gruczołach sutkowych6,7,8, 9.
Dowolne wektory pochodzące z retrowirusa10, lentivirus11,12, adenovirus13, oraz wirus związany z adenowirusem (AAV)14 mogą być używane do wewnątrzprzewodowego dostarczania materiałów genetycznych. Wektory retrowirusowe i lentiwirusowe trwale integrują się z genomem gospodarza; W ten sposób stabilnie wprowadzają interesujące geny do komórek nabłonka sutka. Podczas gdy lentiwirus może zintegrować się z genomem każdej napotkanej komórki15, efektywna integracja genomowa retrowirusa wymaga proliferacji komórek docelowych16. Wektory adenowirusowe i AAV nie integrują się z genomem zakażonych komórek, a zatem tylko przejściowo wyrażają gen będący przedmiotem zainteresowania17,18. Ta cecha może być zaletą, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania musi być wyrażany tylko przez krótki czas, taki jak Cre, w celu usunięcia genu supresorowego z floksem.
Lentiwirus, adenowirus i AAV infekują wszelkie napotkane komórki myszy. Ale ponieważ nabłonek światła jest w dużej mierze izolowany od leżącej poniżej warstwy podstawnej, która jest dodatkowo oddzielona od zrębu błoną podstawną, wstrzyknięcie wewnątrzprzewodowe ogranicza infekcję głównie do komórek nabłonka światła, głównej komórki pochodzenia raka piersi. W tej warstwie nabłonka świetlnego istnieją również odrębne podtypy komórek, w tym komórki macierzyste, komórki progenitorowe i kilka grup komórek zróżnicowanych. Do infekowania określonych podzbiorów komórek w populacji komórek luminalnych można zastosować technologię TVA, za pomocą której wektory RCAS pochodzące z wirusa ptasiej białaczki5,10 lub pseudotypowane wektory lentiwirusowe11 selektywnie infekują komórki wyrażające TVA u myszy, które są nosicielami transgenu TVA pod kontrolą promotora specyficznego dla typu komórki, takiego jak promotor, który jest aktywny tylko w komórkach macierzystych6 lub niektóre komórki progenitorowe6,7 lub komórki pęcherzykowe 8 lub aktywne komórki szlaku Wnt9.
Ten protokół przedstawia technikę wprowadzania interesujących genów do komórek nabłonka sutka poprzez doprzewodową iniekcję wektora wirusowego. Następnie demonstruje się wykrywanie ekspresji wprowadzonych genów i wynikających z nich zmian hiperplastycznych i nowotworów.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-HA</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>Rozcieńczenie: 1 : 1000</td></tr><tr><td>Sztuczne łzy</td><td>Covetrus</td><td>NDC 11695-0832-1</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma</td><td>B5525</td><td>promieniowanie mikrofalowe przez 45 sekund przy wysokiej mocy 1250 W kuchenka mikrofalowa</td></tr><tr><td>FACSCantoII</td><td>BD Biosciences</td><td>V96100899</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZ16 FA</td><td></td></tr><tr><td>FUCGW lenti-virus</td><td>Własnoręcznie wykonana</td><td>N/A</td><td>Zobacz odniesienie # 12</td></tr><tr><td>FVB/N</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:001800</td><td></td></tr><tr><td>Igła Hamiltona</td><td>Hamilton</td><td>91033</td><td>autoklawizowana</td></tr><tr><td>strzykawka Hamilton</td><td></td><td>201000</td><td>autoklawizowana</td></tr><tr><td>lampa powiększająca LED</td><td>Intertek</td><td>3165273</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe do mikropreparacji</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td>autoklawizowany</td></tr><tr><td>MMTV-tva</td><td>Własnej produkcji</td><td></td><td>Zobacz referencje # 10</td></tr><tr><td>RCAS-Neu (HA)</td><td>Samodzielnie wykonany</td><td>Nie dotyczy</td><td>Zobacz odniesienie # 10</td></tr><tr><td>Gryzonie Comboanesthetic III</td><td>Apteka weterynaryjna</td><td>Recepta weterynaryjna</td><td>37,6 mg/ml ketaminy, 1,92 mg/ml ksylazyny i 0,38 mg/ml acepromazyny</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

Mysie gruczoły sutkowe składają się z drzew przewodowych, które są wyściełane komórkami nabłonkowymi i mają jeden otwór na końcu każdego sutka. Komórki nabłonkowe odgrywają główną rolę w funkcjonowaniu gruczołu sutkowego i są źródłem większości nowotworów sutka. Wprowadzenie interesujących genów do komórek nabłonka sutka myszy jest kluczowym krokiem w ocenie funkcji genów w komórkach nabłonkowych i generowaniu mysich modeli guza sutka. Cel ten można osiągnąć poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie wektora wirusowego przenoszącego interesujące geny do mysiego drzewa przewodowego sutka. Wstrzyknięty wirus infekuje następnie komórki nabłonka sutka, wprowadzając interesujące geny. Wektor wirusowy może być lentiwirusowy, retrowirusowy, adenowirusowy lub wirusowy związany z adenowirusem (AAV). Badanie to pokazuje, w jaki sposób interesujący nas gen jest dostarczany do komórek nabłonka sutka poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie wektora wirusowego do sutka mysiego. Lentiwirus przenoszący GFP jest używany do wykazania stabilnej ekspresji dostarczonego genu, a retrowirus przenoszący Erbb2 (HER2 / Neu) jest używany do wykazania infekcjonowanych onkogenem atypowych zmian hiperplastycznych i guzów sutka.

W tym miejscu przedstawiono reprezentatywne dane, aby zademonstrować pomyślne wstrzyknięcie dokanałowe, skuteczną infekcję wirusową oraz wpływ dostarczonych genów na tumorigenezę gruczołów mlekowych. Ilość wstrzykiwanego wirusa musi być dostosowana do celu każdego eksperymentu. Aby zilustrować, jak szeroki obszar drzewa przewodowego gruczołu mlekowego można zainfekować, należy użyć dużej ilości wirusa niosącego geny umożliwiające obrazowanie, takie jak GFP. Z drugiej strony, aby naśladować naturalną spontaniczną tumorige...

Obecny protokół opisuje doprzewodową iniekcję wektorów wirusowych przez smoczek w celu dostarczenia interesujących genów do komórek nabłonka sutka.

In vivo (in vivo) Dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Metoda ta dostarcza materiał genetyczny do komórek nabłonka gruczołu sutkowego w sposób specjalny, tymczasowy i możliwy do kontrolowania ilościowego. Ponieważ dostarczanie materiału genetycznego do komórek nabłonka sutka jest specjalne, tymczasowo i ilościowo kontrolowane, modele sutka wygenerowane tą metodą lepiej naśladują naturalną genezę guza. Przygotowanie strzykawki należy rozpocząć od przecięcia metalowych igieł piasty o rozmiarze 33 do długości około jednego centymetra i umieszczenia ich w alkoholu.Wyjąć strzykawki i igły z alkoholu, a pozostały alkohol wypchnąć ze strzykawki i igieł. Następnie zdemontować strzykawkę w celu wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu zmontować strzykawkę.Wyjmij probówki z wirusem z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i rozmroź je na lodzie. Aby dodać błękit bromofenolowy, zanurz końcówkę pipety na głębokość jednego centymetra w proszku błękitu bromofenolowego. Następnie wprowadzić dołączoną śladową ilość błękitu bromofenolowego do zawiesiny wirusa.Zmieszać błękit bromofenolowy z roztworem wirusa, pipetując w górę i w dół 10 razy, przed umieszczeniem wirusa na lodzie. Sprawdź głębokość znieczulenia, szczypiąc palec u nogi zniecz

in-vivo-gene-delivery-into-mouse-mammary-epithelial-cells-through

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje technikę iniekcji wewnątrzprzewodowych, w której dostarczamy mieszankę iniekcyjną do przewodów mysich gruczołów sutkowych.

Iniekcja doprzewodowa: dostarczanie mieszanki iniekcyjnej do przewodów gruczołu sutkowego myszy

Opisano protokół nieinwazyjnego wewnątrzprzewodowego dostarczania wodnych odczynników do gruczołu sutkowego myszy. Metoda wykorzystuje miejscowe wstrzyknięcie do sutków gruczołów sutkowych, celując konkretnie w przewody sutkowe. Technika ta można dostosować do różnych związków, w tym siRNA, chemioterapeutyków i małych cząsteczek.

Wstrzyknięcie doprzewodowe w celu miejscowego dostarczania leku do mysiego gruczołu sutkowego

Aktywacja utajonych mutacji z adenowirusem-Cre w systemie przewodowym sutka powoduje klinicznie istotny przerzutowy rak piersi. Włączenie promotora YFP umożliwia śledzenie dystalnych komórek nowotworowych z przerzutami. Model ten jest przydatny do badania utajonych przerzutów, odporności przeciwnowotworowej oraz do projektowania nowych immunoterapii w leczeniu raka piersi.

Inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez celowanie w nabłonek przewodowy za pomocą Adenovirus-Cre: nowy transgeniczny mysi model raka piersi

Rak jest złożoną chorobą, na którą wpływ ma tkanka otaczająca guz, a także lokalne mediatory pro- i przeciwzapalne. Dlatego ortotropowe modele iniekcyjne, a nie modele podskórne, mogą być przydatne do badania progresji raka w sposób, który lepiej naśladuje ludzką patologię.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy w celu zbadania wzrostu guza.

Tutaj opisujemy technikę miejscowego dostarczania odczynników do gruczołu sutkowego królika poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe. Dodatkowo opisujemy protokół wizualizacji i potwierdzenia porodu za pomocą wysokorozdzielczego obrazowania ultrasonograficznego środków kontrastowych.

Dostarczanie wewnątrzprzewodowe do gruczołu sutkowego królika

Tutaj prezentujemy protokół wszczepiania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej w prosty, mniej inwazyjny i łatwy w obsłudze sposób, a ten mysi ortotopowy model raka piersi z odpowiednim środowiskiem poduszeczki tłuszczowej może być wykorzystany do badania różnych aspektów raka.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy

Celem tego protokołu jest opisanie nowego podejścia do modelowania raka piersi opartego na doprzewodowym wstrzykiwaniu adenowirusa z ekspresją Cre do mysich gruczołów sutkowych. Takie podejście pozwala na manipulowanie zdarzeniami onkogennymi zarówno w zależności od typu komórki, jak i narządu, w sposób kontrolowany czasowo.

Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego

Opisano metodę doprzewodowego wstrzykiwania odczynników do roztworu ablacyjnego na bazie etanolu do mysiego drzewa sutkowego do obrazowania in vivo i zapobiegania rakowi piersi. Wstrzyknięcie bezpośrednio do otworu brodawki sutkowej pozwala na celowanie w komórki nabłonka sutka przy minimalnym uszkodzeniu tkanek ubocznych.

Dostarczanie wewnątrzprzewodowe i wizualizacja rentgenowska roztworu ablacyjnego na bazie etanolu w profilaktyce i leczeniu miejscowym raka piersi w modelach mysich

Niniejszy protokół opisuje łatwą technikę obrazowania gruczołu sutkowego myszy w okresie laktacji za pomocą skaningu laserowego, mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej.

Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Ten protokół opisuje skalowalne podejście do wewnątrzkanalikowego przesiewania CRISPR, umożliwiające równoległe in vivo badania nad wyłączeniem genów i aktywacją w gruczołach piersiowych myszy.

Równoległe in vivo badanie wyłączania i aktywacji genów w gruczołach piersiowych myszy

Poznaj metodę wstrzyknięcia doprzewodowego do komórek nabłonka sutka myszy przy użyciu wektorów wirusowych. Technika ta umożliwia kontrolowane dostarczanie materiału genetycznego, poprawiając modelowanie naturalnej genezy nowotworów.

In vivo (in vivo) Dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka

Przeglądaj więcej filmów