In vivo (in vivo) Dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka

Metoda ta dostarcza materiał genetyczny do komórek nabłonka gruczołu sutkowego w sposób specjalny, tymczasowy i możliwy do kontrolowania ilościowego. Ponieważ dostarczanie materiału genetycznego do komórek nabłonka sutka jest specjalne, tymczasowo i ilościowo kontrolowane, modele sutka wygenerowane tą metodą lepiej naśladują naturalną genezę guza. Przygotowanie strzykawki należy rozpocząć od przecięcia metalowych igieł piasty o rozmiarze 33 do długości około jednego centymetra i umieszczenia ich w alkoholu.

Wyjąć strzykawki i igły z alkoholu, a pozostały alkohol wypchnąć ze strzykawki i igieł. Następnie zdemontować strzykawkę w celu wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu zmontować strzykawkę.

Wyjmij probówki z wirusem z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i rozmroź je na lodzie. Aby dodać błękit bromofenolowy, zanurz końcówkę pipety na głębokość jednego centymetra w proszku błękitu bromofenolowego. Następnie wprowadzić dołączoną śladową ilość błękitu bromofenolowego do zawiesiny wirusa.

Zmieszać błękit bromofenolowy z roztworem wirusa, pipetując w górę i w dół 10 razy, przed umieszczeniem wirusa na lodzie. Sprawdź głębokość znieczulenia, szczypiąc palec u nogi znieczulonej samicy myszy. Nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu, gdy zwierzę jest pod narkozą.

Połóż mysz w pozycji leżącej na ciepłej podkładce i przymocuj wszystkie cztery kończyny do ławki za pomocą taśmy klejącej. Zidentyfikuj sutek do wstrzyknięcia i odsłoń go, przycinając otaczające włosy nożyczkami. Nałóż 70% alkohol i jotę cztery waciki w trzech naprzemiennych rundach na obszar brodawki, aby oczyścić i odsłonić sutek.

Przetnij dystalną końcówkę sutka za pomocą pary wysterylizowanych nożyczek sprężynowych do mikropreparacji, aż pod lampą powiększającą będzie widoczny mały centralny otwór kanałowy. Następnie załaduj 10 mikrolitrów mieszaniny błękitu bromofenolowego wirusa do strzykawki i ostrożnie włóż igłę do otworu sutka za pomocą lampy powiększającej. Wstrzyknij całe 10 mikrolitrów wirusa do drzewa kanałowego i umieść mysz na podgrzewaczu do szkiełka ustawionym na 45 stopni Celsjusza, aż mysz całkowicie się obudzi.

Otwórz klatkę piersiową trzy do pięciu dni po wstrzyknięciu wirusa. Przetnij skórę wzdłuż brzusznej linii środkowej oraz kończyn górnych i dolnych za pomocą nożyczek. Podnieś skórę i odsłoń gruczoły sutkowe.

Usunąć wstrzyknięty gruczoł sutkowy ze skóry i gruczoł bez wstrzyknięcia jako kontrolę za pomocą kleszczy i nożyczek. Po zakończeniu umieść gruczoł sutkowy na szklanym szkiełku i rozprowadź gruczoł do pierwotnego kształtu, a następnie obserwuj i obrazuj go pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Powodzenie iniekcji doprzewodowej zostało potwierdzone poprzez odsłonięcie gruczołu sutkowego i obserwację niebieskiego drzewa przewodowego.

Po dwóch do pięciu dniach od wstrzyknięcia wirusa lenti-EGFPFUCGW oceniano zakażenie komórek nabłonka sutka, obserwując cały preparat mount pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Do analizy cytometrii przepływowej białek fluorescencyjnych lub markerów powierzchniowych komórek wytwarzanych przez wirusa, niezakażone gruczoły i zakażone gruczoły zebrano i przetworzono na zawiesinę pojedynczej komórki w celu oszacowania szybkości infekcji wirusowej. Aktywowany ERBBB2 doprowadził do zmian przedrakowych w ciągu kilku tygodni i guzów w ciągu kilku miesięcy.

Wielkość sutków może się znacznie różnić ze względu na różnice w masie, wieku, masie ciała i sile u poszczególnych myszy. Prawidłowe przycięcie końcówki brodawki sutkowej w celu odsłonięcia otworu przewodu sutkowego i dopasowania igły jest ważnym krokiem do skutecznego wstrzyknięcia wirusa.