Name: Mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem Wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Poznaj technikę mikrodysekcji splotu naczyniówkowego z komórek mózgu myszy oraz skaningową mikroskopię elektronową do analizy struktury komórkowej. Ta metoda umożliwia badanie zmian morfologicznych w chorobach neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Belgijską Fundację Badań nad Chorobą Alzheimera (SAO; numer projektu: 20200032), Fundację Badawczą Flandrii (FWO Vlaanderen; numery projektów: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) oraz Baillet Latour Fund. Dziękujemy VIB BioImaging Core za szkolenie, wsparcie i dostęp do parku instrumentów.

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach opisane w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z prawem krajowym (belgijskie prawo 14/08/1986 i 22/12/2003, belgijski dekret królewski 06/04/2010) i europejskim (dyrektywy UE 2010/63/UE, 86/609/EWG). Wszystkie eksperymenty na myszach i zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu w Gandawie (zezwolenia o numerach LA1400091 i WE 2017-026).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Środki znieczulające: Przygotuj znieczulenie końcowe. Na przykład można przygotować roztwór pentobarbitalu sodu (≥100 mg/kg) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).</li>
	<li>Roztwór perfuzyjny przezsercowy: Przygotować 10 ml (na mysz) roztworu PBS/heparyny (zawierającego 0,2% heparyny) uzupełnionego 0,5% błękitu bromofenolowego. 
	UWAGA: Jeśli pozwalają na to dalsze etapy przetwarzania (np. w przypadku analizy RNA i białek), splot naczyniówkowy (CP) można uwidocznić za pomocą perfuzji przezsercowej z błękitem bromofenolowym. Jeśli błękit bromofenolowy nie jest kompatybilny z dalszymi etapami przetwarzania (np. do obrazowania), należy użyć PBS/heparyny do perfuzji.</li>
	<li>Przygotuj rozwiązania wymagane do analizy SEM.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,1 M bufor Na-kakodylanu (pH 7,4). Przygotować roztwór 2% paraformaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze Na-kakodylowym. Przygotować 20 ml tego roztworu na próbkę.</li>
		<li>Przygotować 2% tetratlenek osmu w 0,1 M buforze Na-kakodylanu (5 ml na próbkę).</li>
		<li>Przygotuj 50%, 70%, 85% i 100% roztwory EtOH. Przygotować 5 ml każdego roztworu EtOH na próbkę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mikrodysekcja splotu naczyniówkowego z komory bocznej i czwartej
UWAGA: W tym badaniu użyto żeńskich, 9-tygodniowych myszy C57BL/6. Jednak opisana technika izolacji jest niezależna od szczepu, płci i wieku dorosłej myszy.
<ol>
	<li>Odizoluj mózg myszy.
	<ol>
		<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć śmiertelną dawkę krótko działającego barbituranu (>100 mg/kg, przygotowanego w kroku 1.1) za pomocą igły 26G w celu ostatecznego znieczulenia myszy. Sprawdź odruch stopy myszy, ściskając jej tylną łapę kleszczami.</li>
		<li>Gdy nie ma odruchu stopy, umieść nieuleczalnie znieczulone zwierzę w pozycji odleżynowej grzbietowej i unieruchamiaj mysz, przypinając kończyny do talerza. 
		UWAGA: Jeśli perfuzja przezsercowa myszy nie jest potrzebna, w zależności od dalszej metody analizy (np. do obrazowania SEM), przejdź do kroku 2.1.7. Jeśli jednak perfuzja jest potrzebna do usunięcia komórek krwi lub innych składników krwi, CP można uwidocznić jako niebieską strukturę unoszącą się w komorach mózgu poprzez perfuzję z błękitem bromofenolowym.</li>
		<li>Zdezynfekuj klatkę piersiową, rozpylając 70% etanolu. Umieść sterylną serwetę wokół obszaru operacyjnego. Wykonaj nacięcie o długości ~4 cm tuż pod przeponą za pomocą ostrza chirurgicznego ze stali węglowej (patrz Tabela Materiałów).</li>
		<li>Otwórz skórę i odsłoń klatkę piersiową za pomocą nożyczek chirurgicznych. Całkowicie rozetnij membranę.</li>
		<li>Oddziel klatkę piersiową, aby odsłonić płuca i bijące serce.</li>
		<li>Perfuzję przezsercową myszy należy podać 10 ml roztworu perfuzyjnego z szybkością 4,5 ml / min, używając pompy perfuzyjnej (patrz Tabela materiałów). Perfuzja potrwa ~2 min. Wprowadzić igłę 26G do lewej komory, aby przepompować roztwór do obwodu ogólnoustrojowego. Ponadto wykonaj cięcie nożyczkami chirurgicznymi w prawym przedsionku, aby krew mogła wydostać się z krążenia. 
		UWAGA: Pompa perfuzyjna jest lepsza niż ręczne podawanie płynu, ponieważ dostarcza płyny z precyzyjnie zaprogramowaną szybkością i zapewnia, że siły ścinające spowodowane perfuzją nie są zbyt duże. Nadmierne siły ścinające zagrozi żywotności i strukturze komórek w CP. Ponadto zalecana tutaj szybkość przepływu perfuzyjnego jest optymalna do perfuzji dorosłych myszy od 7 tygodnia życia. Jeśli używane są młodsze myszy, należy zastosować mniejsze natężenie przepływu. Ważne jest również, aby usunąć krew, która wydostaje się z prawego przedsionka, aby zachować czyste miejsce operacji.</li>
		<li>Odetnij głowę myszy. 
		UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby odciąć głowę jak najniżej do ramienia, aby zachować strukturę mózgu. Jeśli cięcie jest zbyt wysokie, móżdżek może zostać uszkodzony.</li>
		<li>Po ścięciu głowy należy rozciąć skórę głowy, wykonując nacięcie od strony między uszami do górnej części oczu. Pociągnij skórę na boki, aby odsłonić czaszkę. Następnie rozetnij czaszkę, podążając za szwami łuskowymi, w kierunku części nosowej. 
		UWAGA: Ważne jest, aby delikatnie usunąć czaszkę, aby zachować integralność mózgu.</li>
		<li>Umieść mózg na lodowatej szalce Petriego i dodaj 1 ml lodowatej płytki 1x PBS na tkankę mózgową. 
		UWAGA: Powlekanie naczynia nie jest potrzebne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odizoluj CP unoszący się w czwartej komorze.
	<ol>
		<li>Delikatnie odetnij móżdżek od mózgu skalpelem. Mózg jest największą częścią mózgu, podczas gdy móżdżek jest znacznie mniejszą częścią z tyłu mózgu. W razie potrzeby usuń pozostałe części tkanki pnia mózgu z móżdżku.</li>
		<li>Obróć mózg tak, aby linia cięcia była skierowana do góry. Upewnij się, że jama czwartej komory jest teraz widoczna w środku sekcji, a CP unosi się w miejscu grzbietowym. W razie potrzeby otwórz nieco komorę, rozciągając tkankę łączną ostrymi kleszczami. W ten sposób punkt kontrolny będzie bardziej widoczny i łatwiej do niego dotrzeć.</li>
		<li>Delikatnie oderwij CP od ściany komory za pomocą maleńkich ostrych kleszczyków. 
		UWAGA: Ważne jest, aby na tym etapie dotykać i wyjmować CP tylko wtedy, aby nie zanieczyścić próbki otaczającą tkanką. Otwarcie komór zgodnie z opisem w kroku 2.2.2 ułatwi wykonanie kroku 2.2.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odizoluj CP wystający z komory bocznej.
	<ol>
		<li>Użyj maleńkich ostrych kleszczy, aby strzałkowo przeciąć mózg na dwie półkule.</li>
		<li>Obróć mózg tak, aby linia cięcia była skierowana do góry. Aby odsłonić komorę boczną, delikatnie odciągnij korę od wzgórza.</li>
		<li>Cofnij hipokamp do środkowej linii cięcia. Komora boczna jest teraz widoczna, a CP leży na dnie komory. W razie potrzeby otwórz nieco komorę, rozciągając tkankę łączną ostrymi kleszczami. W ten sposób punkt kontrolny będzie bardziej widoczny i łatwiej do niego dotrzeć.</li>
		<li>Użyj maleńkich ostrych kleszczy, aby delikatnie wyrwać CP ze ściany komory. 
		UWAGA: Ważne jest, aby na tym etapie dotykać i wyjmować CP tylko wtedy, aby nie zanieczyścić próbki otaczającą tkanką. Otwarcie komór zgodnie z opisem w kroku 2.3.4 ułatwi wykonanie kroku 2.3.5. Na tym etapie należy zachować niezbędną ostrożność, aby w jak największym stopniu zachować strukturę CP. Najłatwiej jest zacząć ciągnąć CP w kierunku rostralnym do ogonowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza morfologiczna tkanki CP za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)
UWAGA: Toksyczne roztwory są używane w następujących etapach przetwarzania. Zaleca się przygotowanie próbki w dygestorium.
<ol>
	<li>Wykonaj przygotowanie próbki do SEM zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Przenieść świeżo wyizolowany CP do świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego zawierającego 2% paraformaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze Na-kakodylanu (pH 7,4). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Ponieważ tkanka CP jest bardzo delikatna i cienka, tkankę należy umieścić w małych koszyczkach na próbki (patrz Tabela materiałów), aby przenieść ją między. W ten sposób struktura tkanki zostanie lepiej zachowana. Utrwalacz na bazie kakodylatu jest stosowany zamiast utrwalacza na bazie PBS, ponieważ silny bufor kakodylowy może przeciwdziałać niskiemu pH aldehydu glutarowego w utrwalaczu EM.</li>
		<li>Przemyć próbkę 3x przez 5 minut każdy, 3-5 ml 0,1 M buforu Na-kakodylanu (pH 7,4).</li>
		<li>Po utrwaleniu próbek w 3-5 ml 2% tetratlenku osmu w 0,1 M buforze Na-kakodylanu przez 30 minut. Próbki należy przemywać 3 razy przez 5 minut każda 3-5 ml ultraczystej wody.</li>
		<li>Odwodnić próbki w serii lodowatych roztworów o rosnących stężeniach EtOH (50%, 70%, 85%, 100%) przez 15 minut na roztwór EtOH. Użyj osuszacza do punktu krytycznego, aby prawidłowo wysuszyć próbkę punktowo. 
		UWAGA Przejście z fazy ciekłej na gazową wpływa na napięcie powierzchniowe, powodując uszkodzenie struktury powierzchni. Etap suszenia w punkcie krytycznym pozwala na zachowanie struktury powierzchni.</li>
		<li>Ostrożnie umieść sample na uchwycie próbki dostarczonym z naklejką węglową (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Próbki należy pokryć cienką warstwą (2-5 nm) platyny. W tym celu należy zamontować źródło platyny w układzie próżniowym między dwoma wysokoprądowymi zaciskami elektrycznymi i podgrzać platynę do temperatury parowania. Drobny strumień platyny osadza się na próbce. 
		UWAGA: Bardziej szczegółowy protokół dla tego kroku znajduje się w reference30. Oprócz platyny można również użyć złota lub złota/palladu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja próbek CP za pomocą SEM (patrz tabela materiałów). Procedura wizualizacji tkanki CP za pomocą SEM jest podobna do procedury innych typów tkanek i zależy od zastosowanego oprogramowania i instrumentów. Protokół SEM krok po kroku wraz z towarzyszącym filmem wideo jest dostępny w reference31 lub reference30.</li>
</ol>

<ol><li>Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hidden+epithelial+barrier+in+the+brain+with+a+central+role+in+regulating+brain+homeostasis.+Implications+for+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging.</a> Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).</li>
<li>Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEngelhardt%2C+B+%22Seminars+in+Immunopathology%22">Seminars in Immunopathology</a>. 31 (4), Springer-Verlag. 497-511 (2009).</li>
<li>Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+choroid+plexus+in+central+nervous+system+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation.</a> Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).</li>
<li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces%3A+a+role+for+connexins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li>
<li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).</li>
<li>Redzic, Z. B., Segal, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+choroid+plexus+and+the+physiology+of+the+choroid+plexus+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).</li>
<li>Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+anatomy+and+functions+of+the+choroid+plexus+in+healthy+and+diseased+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430(2020).</li>
<li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+leukocyte+infiltration+at+the+choroid+plexus+in+%28neuro%29inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders.</a> Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).</li>
<li>Brkic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2oligomers+disrupt+blood-CSF+barrier+integrity+by+activating+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Amyloid βoligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases.</a> Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).</li>
<li>Vandenbroucke, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloprotease+8-dependent+extracellular+matrix+cleavage+at+the+blood-CSF+barrier+contributes+to+lethality+during+systemic+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases.</a> Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).</li>
<li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+response+to+a+repeated+peripheral+inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus.</a> BMC Neuroscience. 10, 135(2009).</li>
<li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease%3A+dialogues+into+and+out+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li>
<li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li>
<li>Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+balanced+view+of+choroid+plexus+structure+and+function%3A+Focus+on+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans.</a> Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).</li>
<li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+and+cerebrospinal+fluid%3A+emerging+roles+in+development%2C+disease%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy.</a> Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).</li>
<li>Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+Alzheimer%27s+disease%3A+more+than+just+a+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier.</a> Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).</li>
<li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+implications+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).</li>
<li>Simon, M. J., Iliff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cerebrospinal+fluid+%28CSF%29+flow+in+neurodegenerative%2C+neurovascular+and+neuroinflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).</li>
<li>Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+role+for+CSF+turnover+and+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+late+onset+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).</li>
<li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+iron+metabolism+is+part+of+the+choroid+plexus+response+to+peripheral+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation.</a> Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).</li>
<li>Thouvenot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteomic+analysis+of+mouse+choroid+plexus+secretome+reveals+a+high+protein+secretion+capacity+of+choroidal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells.</a> Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).</li>
<li>Vandendriessche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+extracellular+vesicle+secretion+at+the+blood-cerebrospinal+fluid+interface+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143(2021).</li>
<li>Bowyer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+description+of+the+dissection+of+the+cerebral+surface+vasculature+and+associated+meninges+and+the+choroid+plexus+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4285(2012).</li>
<li>Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+the+ciliary+movement+of+choroid+plexus+epithelial+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52991(2015).</li>
<li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li>
<li>Carloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+choroid+plexus+vascular+barrier+closing+during+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation.</a> Science. 374 (6566), 439-448 (2021).</li>
<li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+Niemann-Pick+disease+type%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Frontiers+in+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type.</a> C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482(2021).</li>
<li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li>
<li>Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+studies+using+serial+block+face+and+focused+ion+beam+scan+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59480(2019).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Electron+Microscopy+%28SEM%29%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Scanning Electron Microscopy (SEM).</a> JoVE Science Education Database. , https://www.jove.com/v/5656/scanning-electron-microscopy-sem (2022).</li>
<li>Pauwels, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+derived+extracelular+vesicles+exhibit+brain+targeting+characteristics%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics).</a> Biomaterials. 290, 121830(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisano metodę izolowania splotu naczyniówkowego (CP) z komory bocznej i czwartej komory mózgu myszy. Cała ta metoda montażu CP ułatwia dalszą analizę przy użyciu repertuaru technik, aby uzyskać pełny obraz morfologii CP, składu komórkowego, transkryptomu, proteomu i sekretomu. Takie analizy są kluczowe, aby lepiej zrozumieć tę niezwykłą strukturę wystającą z komór mózgu. Wiedza ta ma ogromne znaczenie badawcze, ponieważ staje się coraz bardziej oczywiste, że CP odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie<su...

Szczelne bariery oddzielają ośrodkowy układ nerwowy (OUN) od obwodu, w tym bariera krew-mózg (BKM) oraz bariera krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (PMR). Bariery te chronią OUN przed zewnętrznymi czynnikami szkodliwymi i zapewniają zrównoważone oraz kontrolowane mikrośrodowisko1,2,3. Podczas gdy BKM była przedmiotem intensywnych badań przez długi czas, bariera krew-PMR znajdująca się w splotach naczyniowych (CP) zyskała rosnące zainteresowanie badawcze dopiero w ciągu ostatniej dekady. Tę drugą barierę można znaleźć w czterech komorach mózgu (Rysunek 1A, B) i charakteryzuje się ona pojedynczą warstwą komórek nabłonkowych splotu naczyniowego (CPE), otaczających centralne stroma, nieszczelne kapilary, fibroblasty oraz populację komórek limfoidalnych i mieloidalnych (Rysunek 1C)4,5,6. Komórki CPE są ściśle połączone za pomocą połączeń ścisłych, co zapobiega przeciekaniu z leżących poniżej okienkowatych kapilar krwi do PMR i mózgu. Ponadto transport przez komórki CPE jest regulowany przez szereg systemów transportu dośrodkowego i odśrodkowego, które zarządzają napływem korzystnych związków (np. składników odżywczych i hormonów) z krwi do PMR oraz odpływem szkodliwych cząsteczek (np. odpadów metabolicznych, nadmiaru neuroprzekaźników) w przeciwnym kierunku1,6. Aby móc pełnić funkcję transportu aktywnego, komórki CPE zawierają w swojej cytoplazmie liczne mitochondria7. Co więcej, CP jest głównym źródłem PMR i pełni rolę strażnika mózgu dzięki obecności rezydentnych komórek zapalnych1. Ze względu na swoje wyjątkowe położenie pomiędzy krwią a mózgiem, CP znajduje się również w idealnej pozycji do prowadzenia nadzoru immunologicznego8.
<img alt="Schematy splotów naczyniowych; komory mózgu i produkcja CSF, opisowana ilustracja strukturalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przegląd lokalizacji i składu splotów naczyniowych (CP). (A,B) Tkanka CP znajduje się w dwóch komorach bocznych, trzeciej oraz czwartej komorze mózgu (A) człowieka i (B) myszy. (C) Tkanka CP składa się z pojedynczej warstwy ściśle połączonych sześciennych komórek nabłonka splotów naczyniowych (CPE) otaczających naczynia włosowate z oknami, luźnej tkanki łącznej oraz komórek limfoidalnych i mieloidalnych, i tworzy barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (zaadaptowano i zmodyfikowano z referencji23). Rycina stworzona za pomocą Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
W ciągu ostatniej dekady coraz więcej dowodów, w tym kilka raportów naszej grupy badawczej, ujawniło, że splot naczyniowy (CP) odgrywa centralną rolę w zdrowiu i chorobach9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Na przykład wiadomo, że starzejąca się bariera krew-płyn mózgowo-rdzeniowy wykazuje zmiany morfologiczne m.in. w jądrach komórkowych, mikrokosmkach oraz błonie podstawnej1,19. Dodatkowo, w kontekście choroby Alzheimera, ogólna integralność bariery zostaje naruszona, a wszystkie te zmiany związane z wiekiem wydają się być jeszcze bardziej wyraźne1,8,20. Oprócz zmian morfologicznych, w przebiegu choroby ulega zmianie transkryptom, proteom i sekretom CP12,21,22,23. Zatem zaawansowana wiedza na temat CP jest niezbędna do lepszego zrozumienia jego roli w chorobach neurologicznych i potencjalnego opracowania nowych strategii terapeutycznych.
Wydajna metoda dokładnej mikrodyssekcji CP z komór mózgu jest pierwszym nieocenionym krokiem umożliwiającym właściwe badanie tej niewielkiej struktury mózgu. Ze względu na silne unaczynienie (Rysunek 2B), CP unoszące się w jamach komór mózgu można zidentyfikować przy użyciu mikroskopu binokularnego. Jednakże do późniejszych analiz często wymagana jest perfuzja transkardialna, co komplikuje prawidłową identyfikację i izolację tkanki CP (Rysunek 2C). Jeśli dalsze etapy przetwarzania na to pozwalają (np. w przypadku analizy RNA i białek), CP można zwizualizować poprzez perfuzję transkardialną błękitem bromofenolowym (Rysunek 2A). W kilku publikacjach opisano już izolację CP z mózgów szczurów24 i myszy noworodków25. W niniejszej pracy opisano technikę izolacji metodą mikrodyssekcji w celu wyodrębnienia CP z dorosłych myszy. Co istotne, technika izolacji ta zachowuje żywotność, funkcję i strukturę komórek w obrębie CP. Opisano tutaj izolację CP unoszącego się w czwartej i komorach bocznych. W skrócie, myszy zostają poddane znieczuleniu terminalnemu i, jeśli jest to konieczne, perfuzji transkardialnej. Należy jednak zauważyć, że perfuzja może uszkodzić strukturę komórek w obrębie CP. W konsekwencji, jeśli próbka ma być analizowana przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej powierzchni bloków (SBF-SEM) lub skaningowej mikroskopii elektronowej z wiązką jonów skupionych (FIB-SEM), perfuzji nie należy przeprowadzać. Następnie izoluje się cały mózg i za pomocą pęsety wykonuje przecięcie strzałkowe mózgu na pół. Na tym etapie można zidentyfikować i wyciąć CP unoszące się w komorach bocznych, natomiast CP z czwartej komory można wyizolować od strony móżdżku.
<img alt="Wpływ perfuzji na komory mózgu myszy; błękit bromofenolowy, PBS/heparyna, schemat bez perfuzji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wizualizacja splotów naczyniowych (CP) (A-C) czwartej oraz (D-F) komór bocznych po (A,D) perfuzji błękitem bromofenolowym, (B,E) braku perfuzji oraz (C,F) perfuzji PBS/heparyną. Zdjęcia wykonano za pomocą stereomikroskopu (powiększenie 8x-32x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Po prawidłowym wypreparowaniu ciała naczyniówkowego (CP) z komór mózgu można zastosować szereg technik w celu pogłębienia wiedzy na temat funkcji tej struktury. Na przykład można przeprowadzić cytometrię przepływową lub sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek, aby ilościowo i fenotypowo przeanalizować naciekające komórki zapalne w określonych stanach chorobowych.26,27Oprócz składu komórkowego można przeanalizować skład molekularny CP w celu oceny obecności cytokin i chemokin poprzez test immunoenzymatyczny (ELISA), immunoblot lub poprzez jednoczesną analizę wielu cytokin z wykorzystaniem macierzy koralików cytokinowych (cytokine bead array)28Ponadto w mikrodysekowanych eksplantach CP można przeprowadzić analizy transkryptomu, naczyń krwionośnych, histologii komórek odpornościowych oraz sekretomu.29W tym przypadku zastosowano skaningową mikroskopię elektronową (SEM) preparatów CP w całości, aby uzyskać ogólny obraz struktury CP. SEM wykorzystuje wiązkę skupionych elektronów do skanowania powierzchni i tworzenia obrazu jej topografii oraz składu. Ponieważ długość fali elektronów jest znacznie mniejsza niż światła, rozdzielczość SEM mieści się w zakresie nanometrów i jest wyższa niż w przypadku mikroskopu świetlnego. W konsekwencji możliwe jest przeprowadzenie badań morfologicznych na poziomie subkomórkowym. poprzez SEM. W skrócie: wypreparowane CP bezzwłocznie przenosi się do utrwalacza zawierającego glutaraldehyd w celu utrwalenia przez noc, po czym przeprowadza się osmikację i barwienie octanem uranylu. Próbki są następnie traktowane barwnikiem z aspartanem ołowiu, odwadniane, a na koniec zatapiane w celu obrazowania.
W ten sposób niniejszy protokół umożliwia efektywną izolację CP z komór mózgu myszy, które mogą zostać poddane dalszej analizie z wykorzystaniem różnych technik analitycznych w celu zbadania ich struktury i funkcji.

<table><tbody><tr><td>Igła 26G x 1/2</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004512</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowe mocowania próbek</td><td>EM Sciences</td><td>75220</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kakodylowy</td><td>EM Sciences</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza chirurgiczne ze stali węglowej</td><td>Swann-Morton</td><td>0210</td><td>rozmiar: 0,45 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>Zakładki z kleju węglowego -12 mm</td><td>EM Sciences</td><td>77825-12</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka punktu krytycznego&nbsp;</td><td>Bal-Tec&nbsp;</td><td>CPD030</td><td></td></tr><tr><td>Belka poprzeczna 540</td><td>System SEM Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools GmbH&nbsp;</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>EM Sciences</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td></td></tr><tr><td>Ismatec Reglo ICC Cyfrowa pompa perystaltyczna 2-kanałowa</td><td>Metrohm Belgia NV</td><td>CPA-7800160</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu&nbsp;</td><td>EM Sciences</td><td>19170</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Platyna&nbsp;</td><td>Kworum&nbsp;</td><td>Q150T ES</td><td>PBS bez Ca++ Mg++ i czerwieni fenolowej; sterylnie filtrowany</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Kela NV</td><td>514</td><td></td></tr><tr><td>Kosz na próbki Stal nierdzewna</td><td>EM Sciences</td><td>70190-01</td><td></td></tr><tr><td>Stemi DV4 Mikroskop stereoskopowy</td> Nożyczki chirurgiczne <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools GmbH&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 91460-11</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy

Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

Splot naczyniówkowy (CP), wysoce unaczyniona struktura wystająca do komór mózgu, jest jedną z najbardziej niedostatecznie zbadanych tkanek w neurobiologii. Ponieważ staje się coraz bardziej oczywiste, że ta niewielka struktura odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego (OUN), niezwykle ważne jest, aby prawidłowo wypreparować CP z komór mózgowych w sposób, który umożliwia dalsze przetwarzanie, od analizy funkcjonalnej po strukturalną. W tym miejscu opisano izolację bocznej i czwartej komory mózgu myszy CP bez konieczności stosowania specjalistycznych narzędzi lub sprzętu. Ta technika izolacji zachowuje żywotność, funkcję i strukturę komórek w CP. Ze względu na wysokie unaczynienie, CP można uwidocznić unosząc się w jamach komorowych mózgu za pomocą mikroskopu dwuokularowego. Jednak perfuzja przezsercowa wymagana do dalszej analizy może skomplikować identyfikację tkanki CP. W zależności od dalszych etapów przetwarzania (np. analiza RNA i białek) można to rozwiązać, wizualizując CP za pomocą perfuzji przezsercowej z błękitem bromofenolowym. Po izolacji, CP może być przetwarzany przy użyciu kilku technik, w tym RNA, białka lub analizy pojedynczej komórki, aby uzyskać dalsze zrozumienie funkcji tej specjalnej struktury mózgu. W tym przypadku skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) na całym montażu CP jest używana do uzyskania ogólnego widoku struktury.

Opisany protokół umożliwia efektywną izolację splotów naczyniowych (CP) z komór bocznych (Rysunek 2A-C) oraz czwartej (Rysunek 2D-F) mózgu myszy. Po wyizolowaniu całego mózgu, za pomocą pęsety wykonuje się przeciecie strzałkowe mózgu na pół i identyfikuje sploty naczyniowe unoszące się w komorach bocznych. Splot naczyniowy z czwartej komory można wyizolować od strony móżdżku. W celu wizualizacji...

Splot naczyniówkowy (CP), niedostatecznie zbadana tkanka w neurobiologii, odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje technikę mikrodysekcji w celu wyizolowania CP i zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej w celu uzyskania ogólnego obrazu jego struktury komórkowej.

Mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem Wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

Aby uzyskać lepszy wgląd w skład i strukturę splotu naczyniówkowego, pierwszą nieocenioną metodą jest skuteczna metoda izolowania splotu naczyniówkowego z komór mózgowych. Dzięki tej technice mikrodysekcji możliwe jest wypreparowanie splotu naczyniówkowego z komór mózgu, zachowując jego funkcję, żywotność i strukturę bez zanieczyszczania splotu naczyniówkowego otaczającą tkanką. Istotną przeszkodą w izolacji splotu naczyniówkowego jest zidentyfikowanie struktury, która nadal unosi się w komorach mózgu.Zabarwienie splotu naczyniówkowego błękitem bromofenolowym ułatwia izolację. Procedurę zademonstruje Elien Van Wonterghem, kierownik naszego laboratorium. Zacznij od przygotowania końcowego środka znieczulającego, roztworu perfuzyjnego przezsercowego oraz roztworu wymaganego do skaningowej mikroskopii elektronowej lub SEM oraz innych roztworów, jak wspomniano w tekście.Aby wyizolować mózg myszy, umieść nieuleczalnie znieczulone zwierzę w grzbietowej pozycji odleżynowej i unieruchamiaj mysz, przypinając kończyny do płytki. Zdezynfekuj klatkę piersiową, rozpylając 70% etanolu, a następnie wykonaj nacięcie o długości około czterech centymetrów tuż pod przeponą za pomocą ostrza chirurgicznego ze stali węglowej. Otwórz skórę i odsłoń klatkę piersiową za pomocą nożyczek chirurgicznych.Całkowicie rozetnij przeponę i oddziel klatkę piersiową, aby odsłonić płuca i bijące serce. Za pomocą pompy perfuzyjnej przekrwić skórę przezskórnie 10 mililitrami roztworu perfuzyjnego z szybkością 4,5 mililitra na minutę. Wprowadzić igłę o rozmiarze 26 G do lewej komory, aby przepompować roztwór do obwodu ogólnoustrojowego.Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij prawe przedsionek, aby krew wydostała się z krążenia. Po ścięciu głowy myszy rozcięto skórę głowy, wykonując nacięcie zaczynające się między uszami do górnego nad oczami. Pociągnij skórę na boki, aby odsłonić czaszkę.Następnie rozetnij czaszkę, podążając za szwami łuskowymi w kierunku części nosowej. Po zakończeniu umieść mózg na lodowatej szalce Petriego i dodaj jeden mililitr lodowatego PBS do tkanki mózgowej. Aby wyizolować splot naczyniówkowy unoszący się w czwartej komorze, delikatnie odetnij móżdżek od mózgu za pomocą skalpela.Usuń pozostałe części tkanki pnia mózgu z móżdżku. Obróć mózg tak, aby linia cięcia była skierowana do góry, upewniając się, że jama czwartej komory jest widoczna pośrodku odcinka ze splotem naczyniówkowym leżącym w miejscu grzbietowym. W razie potrzeby otwórz komorę, ciągnąc tkankę łączną ostrymi kleszczami.Delikatnie oderwij splot naczyniówkowy od ściany komory za pomocą maleńkich ostrych kleszczy. Aby odizolować splot naczyniówkowy od komory bocznej, strzałkowo przeciął mózg na dwie półkule za pomocą maleńkich ostrych kleszczy. Obróć jedną półkulę mózgu tak, aby linia cięcia była skierowana do góry.Aby odsłonić komorę boczną, delikatnie odciągnij korę od wzgórza. Cofnij hipokamp do środkowej strzałkowej linii cięcia. Komora boczna jest teraz widoczna, a splot naczyniówkowy leży na dnie komory.W razie potrzeby otwórz nieco komorę, rozciągając tkankę łączną ostrymi kleszczami. Użyj maleńkich ostrych kleszczy, aby delikatnie oderwać splot naczyniówkowy od ściany komory. Aby przygotować próbkę do SEM, przenieś świeżo wyizolowany splot naczyniówkowy do świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po zakończeniu przemyj próbkę trzy razy, używając od trzech do pięciu mililitrów 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu przez pięć minut każdy. Umieść próbki w trzech do pięciu mililitrach 2% tetratlenku osmu w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu przez 30 minut. Następnie umyj próbki trzy razy przez pięć minut każda, używając od trzech do pięciu mililitrów ultraczystej wody.Następnie odwodnić próbki w rosnącej serii lodowatych stężeń alkoholu etylowego w ciągu 15 minut na roztwór alkoholu etylowego. Użyj osuszacza w punkcie krytycznym, aby prawidłowo wysuszyć próbkę. Ostrożnie umieść próbkę na mocowaniu próbki za pomocą naklejki węglowej i zwizualizuj próbki splotu naczyniówkowego za pomocą SEM.Prezentowany protokół umożliwił skuteczną izolację splotu naczyniówkowego od komory bocznej i czwartej mózgu myszy. Perfuzja z błękitem bromofenolowym spowodowała uwidocznienie splotu naczyniówkowego. Gdy błękit bromofenolowy nie był dopuszczony do dalszych etapów przetwarzania, perfuzja z PBS-heparyną lub nie przeprowadzano perfuzji w celu przetworzenia.Analiza morfologiczna SEM powierzchni komórek nabłonka splotu naczyniówkowego (CPE) wyraźnie pokazuje dwuramienną strukturę czwartej komory i typową formę w kształcie litery C bocznego splotu naczyniówkowego odizolowanego od komory bocznej. Większe powiększenie SEM ujawniło struktury przypominające pęcherzyki po stronie wierzchołkowej komórek CPE i mikrokosmków, co wskazuje, że zmiany morfologiczne komórek CPE w warunkach chorobowych można badać za pomocą SEM. Ważne jest, aby dotykać i wyjmować tylko tkankę splotu naczyniówkowego, aby nie zanieczyścić próbki otaczającą tkanką.Zachowaj niezbędną ostrożność, aby zachować strukturę splotu naczyniówkowego. Na izolowanym splocie naczyniówkowym można zastosować różne dalsze techniki w celu zbadania jego struktury i funkcji, począwszy od analizy mikroskopowej, poprzez analizę transkryptomu, aż po cytometrię przepływową. Mikropreparacja splotu naczyniówkowego z mózgu pozwala nam uzyskać lepszy wgląd w strukturę i funkcję tej maleńkiej tkanki mózgowej.Wiedza ta jest niezbędna, aby lepiej zrozumieć jego rolę w chorobach neurologicznych.

microdissection-whole-mount-scanning-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Źródło: Van Wonterghem, E., et al. Mikrodysekcja i wizualizacja skaningowej mikroskopii elektronowej myszy z całego mocowania. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia przygotowanie i obrazowanie tkanki splotu naczyniówkowego z mózgu myszy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Proces obejmuje utrwalanie, odwadnianie i powlekanie tkanki przewodzącą warstwą platyny w celu stabilizacji i przygotowania próbki do obrazowania. SEM rejestruje szczegółowe obrazy komórek nabłonka z...

Wizualizacja splotu naczyniówkowego mózgu myszy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

W tym badaniu, szczegółowa technika mikroskopii świetlnej została zoptymalizowana do obserwacji i analizy ruchu rzęsek CPEC w czasie rzeczywistym ex vivo wraz z metodą mikroskopii elektronowej do analizy ultrastrukturalnej.

Obserwacja ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

To badanie wykorzystuje cytometrię przepływową i dwie różne strategie bramkowania na izolowanych perfundowanych splotach naczyniówkowych mózgu myszy; ten protokół identyfikuje główne podzbiory komórek odpornościowych, które wypełniają tę strukturę mózgu.

Izolacja i charakterystyka komórek odpornościowych z mikropreparowanych splotów naczyniówkowych myszy

Obecne protokoły opisują nowatorskie obrazowanie całego mocowania do wizualizacji struktur peryferyjnych w soczewce oka z metodami kwantyfikacji obrazu. Protokoły te mogą być wykorzystywane w badaniach w celu lepszego zrozumienia związku między strukturami mikroskali soczewek a rozwojem/funkcją soczewki.

Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj technikę mikrodysekcji splotu naczyniówkowego z komórek mózgu myszy oraz skaningową mikroskopię elektronową do analizy struktury komórkowej. Ta metoda umożliwia badanie zmian morfologicznych w chorobach neurologicznych.

Mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem Wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy

Przeglądaj więcej filmów