Mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem Wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy
December 16th, 2022
Splot naczyniówkowy (CP), niedostatecznie zbadana tkanka w neurobiologii, odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje technikę mikrodysekcji w celu wyizolowania CP i zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej w celu uzyskania ogólnego obrazu jego struktury komórkowej.
Aby uzyskać lepszy wgląd w skład i strukturę splotu naczyniówkowego, pierwszą nieocenioną metodą jest skuteczna metoda izolowania splotu naczyniówkowego z komór mózgowych. Dzięki tej technice mikrodysekcji możliwe jest wypreparowanie splotu naczyniówkowego z komór mózgu, zachowując jego funkcję, żywotność i strukturę bez zanieczyszczania splotu naczyniówkowego otaczającą tkanką. Istotną przeszkodą w izolacji splotu naczyniówkowego jest zidentyfikowanie struktury, która nadal unosi się w komorach mózgu.
Zabarwienie splotu naczyniówkowego błękitem bromofenolowym ułatwia izolację. Procedurę zademonstruje Elien Van Wonterghem, kierownik naszego laboratorium. Zacznij od przygotowania końcowego środka znieczulającego, roztworu perfuzyjnego przezsercowego oraz roztworu wymaganego do skaningowej mikroskopii elektronowej lub SEM oraz innych roztworów, jak wspomniano w tekście.
Aby wyizolować mózg myszy, umieść nieuleczalnie znieczulone zwierzę w grzbietowej pozycji odleżynowej i unieruchamiaj mysz, przypinając kończyny do płytki. Zdezynfekuj klatkę piersiową, rozpylając 70% etanolu, a następnie wykonaj nacięcie o długości około czterech centymetrów tuż pod przeponą za pomocą ostrza chirurgicznego ze stali węglowej. Otwórz skórę i odsłoń klatkę piersiową za pomocą nożyczek chirurgicznych.
Całkowicie rozetnij przeponę i oddziel klatkę piersiową, aby odsłonić płuca i bijące serce. Za pomocą pompy perfuzyjnej przekrwić skórę przezskórnie 10 mililitrami roztworu perfuzyjnego z szybkością 4,5 mililitra na minutę. Wprowadzić igłę o rozmiarze 26 G do lewej komory, aby przepompować roztwór do obwodu ogólnoustrojowego.
Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij prawe przedsionek, aby krew wydostała się z krążenia. Po ścięciu głowy myszy rozcięto skórę głowy, wykonując nacięcie zaczynające się między uszami do górnego nad oczami. Pociągnij skórę na boki, aby odsłonić czaszkę.
Następnie rozetnij czaszkę, podążając za szwami łuskowymi w kierunku części nosowej. Po zakończeniu umieść mózg na lodowatej szalce Petriego i dodaj jeden mililitr lodowatego PBS do tkanki mózgowej. Aby wyizolować splot naczyniówkowy unoszący się w czwartej komorze, delikatnie odetnij móżdżek od mózgu za pomocą skalpela.
Usuń pozostałe części tkanki pnia mózgu z móżdżku. Obróć mózg tak, aby linia cięcia była skierowana do góry, upewniając się, że jama czwartej komory jest widoczna pośrodku odcinka ze splotem naczyniówkowym leżącym w miejscu grzbietowym. W razie potrzeby otwórz komorę, ciągnąc tkankę łączną ostrymi kleszczami.
Delikatnie oderwij splot naczyniówkowy od ściany komory za pomocą maleńkich ostrych kleszczy. Aby odizolować splot naczyniówkowy od komory bocznej, strzałkowo przeciął mózg na dwie półkule za pomocą maleńkich ostrych kleszczy. Obróć jedną półkulę mózgu tak, aby linia cięcia była skierowana do góry.
Aby odsłonić komorę boczną, delikatnie odciągnij korę od wzgórza. Cofnij hipokamp do środkowej strzałkowej linii cięcia. Komora boczna jest teraz widoczna, a splot naczyniówkowy leży na dnie komory.
W razie potrzeby otwórz nieco komorę, rozciągając tkankę łączną ostrymi kleszczami. Użyj maleńkich ostrych kleszczy, aby delikatnie oderwać splot naczyniówkowy od ściany komory. Aby przygotować próbkę do SEM, przenieś świeżo wyizolowany splot naczyniówkowy do świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po zakończeniu przemyj próbkę trzy razy, używając od trzech do pięciu mililitrów 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu przez pięć minut każdy. Umieść próbki w trzech do pięciu mililitrach 2% tetratlenku osmu w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu przez 30 minut. Następnie umyj próbki trzy razy przez pięć minut każda, używając od trzech do pięciu mililitrów ultraczystej wody.
Następnie odwodnić próbki w rosnącej serii lodowatych stężeń alkoholu etylowego w ciągu 15 minut na roztwór alkoholu etylowego. Użyj osuszacza w punkcie krytycznym, aby prawidłowo wysuszyć próbkę. Ostrożnie umieść próbkę na mocowaniu próbki za pomocą naklejki węglowej i zwizualizuj próbki splotu naczyniówkowego za pomocą SEM.
Prezentowany protokół umożliwił skuteczną izolację splotu naczyniówkowego od komory bocznej i czwartej mózgu myszy. Perfuzja z błękitem bromofenolowym spowodowała uwidocznienie splotu naczyniówkowego. Gdy błękit bromofenolowy nie był dopuszczony do dalszych etapów przetwarzania, perfuzja z PBS-heparyną lub nie przeprowadzano perfuzji w celu przetworzenia.
Analiza morfologiczna SEM powierzchni komórek nabłonka splotu naczyniówkowego (CPE) wyraźnie pokazuje dwuramienną strukturę czwartej komory i typową formę w kształcie litery C bocznego splotu naczyniówkowego odizolowanego od komory bocznej. Większe powiększenie SEM ujawniło struktury przypominające pęcherzyki po stronie wierzchołkowej komórek CPE i mikrokosmków, co wskazuje, że zmiany morfologiczne komórek CPE w warunkach chorobowych można badać za pomocą SEM. Ważne jest, aby dotykać i wyjmować tylko tkankę splotu naczyniówkowego, aby nie zanieczyścić próbki otaczającą tkanką.
Zachowaj niezbędną ostrożność, aby zachować strukturę splotu naczyniówkowego. Na izolowanym splocie naczyniówkowym można zastosować różne dalsze techniki w celu zbadania jego struktury i funkcji, począwszy od analizy mikroskopowej, poprzez analizę transkryptomu, aż po cytometrię przepływową. Mikropreparacja splotu naczyniówkowego z mózgu pozwala nam uzyskać lepszy wgląd w strukturę i funkcję tej maleńkiej tkanki mózgowej.
Wiedza ta jest niezbędna, aby lepiej zrozumieć jego rolę w chorobach neurologicznych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
W tym artykule szczegółowo opisano technikę mikrodissekcji do izolowania pleksusa choroidek (CP) z komór mózgu myszy, a także wykorzystanie skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) do badania jego struktury komórkowej. Zrozumienie architektury i funkcji CP jest niezbędne w neuronauce, szczególnie w odniesieniu do jego udziału w zdrowiu i chorobie układu nerwowego centralnego.
Kluczowe Składowe Badania
Dziedzina Nauki
- Neuroscience
- Neuroanatomia
- Biologia Komórkowa
Tło
- Pleksus choroidek to ważny, ale niedostatecznie zbadany tkanka.
- Odnaje gra znaczącą rolę w zdrowiu i patologii układu nerwowego centralnego.
- Wydajna izolacja i charakterystyka CP ma znaczenie dla zrozumienia chorób neurologicznych.
Cel Badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolowania pleksusa choroidek z komór mózgu myszy.
- Badanie struktury komórkowej pleksusa choroidek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.
- Zachowanie żywotności i integralności pleksusa choroidek podczas izolacji.
Wykorzystane Metody
- Badanie wykorzystuje techniki mikrodissekcji do izolowania pleksusa choroidek.
- Modele myszy są wykorzystywane podczas procesu izolacji, ze szczególnym naciskiem na czwarte i boczne komory.
- Metodologia obejmuje znieczulenie końcowe, zabiegi chirurgiczne i utrwalanie w celu analizy SEM.
- Kluczowe etapy obejmują stosowanie barwienia bromotymolowego niebieskiego w celu zwiększenia wizualizacji oraz skrupulatne obchodzenie się, aby uniknąć zanieczyszczenia.
Główne Wyniki
- Protokół skutecznie izolował pleksus choroidek, umożliwiając analizę morfologiczną za pomocą SEM.
- Obserwacje ujawniły zdefiniowane cechy strukturalne komórek nabłonkowych pleksusa choroidek, w tym mikrowilla i struktury przypominające pęcherzyki.
- Te wyniki umożliwiają dalsze badania nad zmianami związanymi z chorobami na poziomie komórkowym.
Wnioski
- Badanie to demonstruje usprawnione podejście do izolowania pleksusa choroidek w celu szczegółowej analizy strukturalnej.
- Uzyskane informacje mogą poprawić zrozumienie roli CP w zdrowiu i chorobie neurologicznej.
- Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta umożliwia znaczący postęp w badaniu tego ważnego, choć często pomijanego składnika mózgu.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Efficient microdissection and SEM visualization of the mouse choroid plexus (CP) enable high-fidelity structural and functional analysis of this critical CNS interface. This workflow supports early discovery efforts by providing uncontaminated, viable CP tissue for downstream molecular and morphological studies, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in neurobiological research. Reliable CP isolation underpins translational continuity for CNS disease models and biomarker exploration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of CP structure and function for target validation in CNS research.
- Supports mechanistic de-risking by preserving tissue viability and minimizing contamination.
- Facilitates predictive confidence in early-stage neurobiological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides validated CP tissue for quantitative downstream assays, including transcriptomics and proteomics.
- Ensures reproducibility and standardization by maintaining structural integrity during isolation.
- Prepares samples suitable for high-resolution imaging and scalable analytical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Enables investigation of disease-relevant morphological changes in CP epithelial cells using SEM.
- Supports alignment of preclinical models with human CNS disease mechanisms.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking structural findings to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This microdissection and SEM protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, providing foundational tissue samples for molecular, cellular, and imaging analyses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating uncontaminated CP tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples for reproducible quantitative measurements.
- Analytics: Enables high-resolution morphological readouts and comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling disease-relevant structural studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Promotes reproducibility, standardization, and scalability in tissue preparation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and SEM sample preparation.
- Needs access to perfusion equipment, fixation reagents, and electron microscopy infrastructure.
- Demands strict cross-team standardization to avoid tissue contamination.
- Adaptable to other species with protocol modifications as needed.
- Careful handling is essential to preserve CP structure and downstream analytical quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:59
Microdissection of the Choroid Plexus Out of the Lateral and Fourth Ventricle
3:47
Morphological Analysis of Choroid Plexus Tissue Using Scanning Electron Microscopy (SEM)
4:48
Results: Isolation of Choroid Plexus and Analysis of Cellular Structure
5:49
Conclusion
