Name: Adoptywny transfer makrofagów stymulowanych przez IL-33 do modeli mysich indukowanych bleomycyną w celu zbadania ich wpływu na idiopatyczne zwłóknienie płuc in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj izolację makrofagów płucnych i adoptywny transfer po stymulacji IL-33 w modelu mysim. Ta metoda umożliwia badanie zwłóknienia płuc in vivo oraz roli cytokin w patologii płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy uznają Specjalny Temat Zarządzania Laboratorium Uniwersytetu Jiangnan: Budowa Cyfrowej Biblioteki Warstw na Podstawie Próbek Patologicznych (JDSYS202223) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81800065).

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Dobrostanu Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Jiangnan (JN No. 20211130m1720615[501]).
UWAGA: W sumie w tym badaniu wykorzystano 10 samców myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni i wadze 20-25 g. Trzy grupy eksperymentalne w badaniu obejmowały po trzy myszy biorców, a do izolacji IM wykorzystano jedną mysz gospodarza.
1. Zubożenie mysich makrofagów płucnych
<ol>
	<li>Wyjmij fiolkę z liposomami klodronianu (patrz tabela materiałów) z lodówki 30 minut wcześniej, podgrzej ją do temperatury pokojowej i kilkakrotnie odwróć, aby zapewnić równomierne wymieszanie. 
	UWAGA: Liposomy klodronianu otaczają hydrofilowe cząsteczki dichlorometylenobisfosfonianu. Kiedy te liposomy są konsumowane przez makrofagi, klodronian jest stopniowo uwalniany przez działanie fosfatazy lizosomowej, a jego akumulacja w konsekwencji wyzwala apoptozę komórek i wyczerpanie makrofagów7.</li>
	<li>Znieczulij myszy 3% izofluranem. Sprawdź głębokość znieczulenia, szczypiąc jedną stopę, aby sprawdzić przytomność. Nałóż maść weterynaryjną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu.</li>
	<li>Odessać 60 μl liposomów klodronianu za pomocą pipety ze sterylną końcówką ssącą. Podawać lek kroplami do jamy nosowej znieczulonej myszy, tak aby podczas wdychania myszy lek był wdychany do tchawicy. Po każdej kropli upewnij się, że mysz całkowicie wdycha lek i oddycha równomiernie. Podawaj liposomy zawierające sam PBS jako kontrolę8 (Rysunek 2).</li>
	<li>Umieść myszy na stole o stałej temperaturze 38 °C w celu ponownego rozgrzania, aby przyspieszyć ich regenerację. Monitoruj myszy, aż się obudzą. Gdy myszy dobrze się zregenerują i osiągną pozycję leżącą mostka, przenieś je do klatki.</li>
	<li>Do eksperymentu transferowego należy użyć myszy ze zubożonymi makrofagami pęcherzykowymi 2 dni po leczeniu liposomami klodronianowymi jako myszy biorcze. 
	UWAGA: W tym badaniu wyczerpanie makrofagów pęcherzykowych zostało potwierdzone poprzez sprawdzenie ekspresji markerów makrofagów, jak opisano wcześniej8,9 po podaniu liposomów klodronianu przez inhalację (patrz rysunek uzupełniający 1).</li>
</ol>
2. Izolacja i kultura komunikatorów
<ol>
	<li>Znieczulić mysz gospodarza wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (120 mg/kg) i ksylazyny (16 mg/kg). Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez utratę odruchu szczypania palca u nogi. Nałóż maść weterynaryjną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu. Następnie zdezynfekuj skórę znieczulonej myszy 75% alkoholem i jodem. Użyj nożyczek, aby przeciąć skórę i odsłonić tkankę krążeniowo-oddechową</li>
	<li>Odessać 10 ml 1x PBS do strzykawki z igłą 20 G i włożyć końcówkę igły do prawego przedsionka myszy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). Przetnij żyłę główną dolną myszy nożyczkami chirurgicznymi, a następnie ręcznie perfunduj mysz PBS ze stałą prędkością (10-20 ml / min), aż tkanka płucna zmieni kolor na biały. Wyciąć tkankę płucną i przenieść ją do lodowatego PBS w naczyniu hodowlanym (<silna klasa="xfig">Ryc. 3B).</li>
	<li>Pokrój tkankę płucną na fragmenty o wymiarach około 2 mm x 2 mm x 2 mm. Następnie dodaj 15 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 1% kolagenazy A do tkanki płucnej w celu wyizolowania makrofagów. Inkubować z prędkością 100 obr./min przez 30 minut na stole wytrząsającym o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zawiesinę tkanki płucnej należy odessać przez strzykawkę o pojemności 10 ml co najmniej 20 razy, aby była jak najdrobniejsza. Przefiltrować tę zawiesinę przez sitko o wielkości 40 μm. Odwirować filtrat o sile 400 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Poddać lizie czerwone krwinki w osadku, dodając 3 ml buforu do lizy RBC (patrz tabela materiałów) na lodzie przez 2-3 minuty.</li>
	<li>Po odwirowaniu przy 150 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 ml DMEM (zawierającym 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Wysiewać komórki na 10 cm przylegających do siebie szalkach do hodowli komórkowych w proporcjach 2 x 107 komórek/szalkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Dzięki temu IMs płuc mogą przylegać do dish5. Po 1 godzinie odessać supernatant i pływające komórki i dodać 10 ml świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej (DMEM zawierającej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Inkubować dłużej niż 8 godzin lub przez noc.</li>
	<li>Określić czystość otrzymanych IM za pomocą cytometrii przepływowej z barwieniem dla markerów F4/80 i CD11c, jak opisano wcześniej5 (patrz rysunek uzupełniający 1).</li>
</ol>
3. Adoptywne przenoszenie IM do pęcherzyków płucnych
<ol>
	<li>Zastąpić pożywkę hodowlaną z płytki zawierającej izolowane IM płuc (etap 2.7) kompletną pożywką hodowlaną zawierającą 10 ng/ml IL-33 w celu stymulacji IM. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Użyj 1x PBS zamiast IL-33 jako kontrola.</li>
	<li>Oddziel IM płucne, lecząc je 1 ml 0,25% trypsyny przez 5 minut. Następnie wygasić trawienie, dodając 3 ml świeżej kompletnej pożywki hodowlanej i zebrać makrofagi płucne, odwirowując zawiesinę komórkową w temperaturze 150 x g i 4 °C przez 5 minut. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesić komórki w PBS do końcowego stężenia 5 x 105 komórek/50 μl.</li>
	<li>Znieczulić myszy biorcę 3% gazem izofluranowym. Poczekaj, aż mysz straci przytomność (jak w kroku 1.2), a następnie przymocuj kończyny znieczulonej myszy do pionowej płytki za pomocą taśmy medycznej. Delikatnie odciągnij język myszy na bok za pomocą bawełnianego wacika.</li>
	<li>Włącz lampę intubacyjną i poświeć nią gardło myszy, aby widać było tchawicę. Sprawdź, czy tchawica znajduje się blisko podstawy języka, przełyk znajduje się blisko tyłu szyi, ale otwór przełyku nie jest widoczny podczas operacji.</li>
	<li>Użyj lampy do intubacji (22 G), aby pomóc w intubacji myszy. Wprowadzić zastawioną kaniulę igłową do tchawicy za pomocą drutu doprowadzającego (o średnicy 0,4 mm). Usuń drut doprowadzający i wepchnij kaniulę do tchawicy myszy, aby zakończyć intubację.</li>
	<li>Po zaobserwowaniu, że kaniula dostaje się do tchawicy, wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórek (zawierającej 5 x 105 IM) myszy biorcy przez tchawicę.</li>
	<li>Umieść myszy na podkładce do stałego ogrzewania w temperaturze 38°C w celu ponownego rozgrzania, aby przyspieszyć regenerację. Monitoruj myszy, aż się obudzą. Po tym, jak dobrze się zregenerują i osiągną leżący mostek, przenieś je do klatki.</li>
	<li>Po 24 godzinach podać bleomycynę (BLM) przez tchawicę (zgodnie z procedurą opisaną w krokach 3.3-3.5) w dawce 1,4 j./kg masy ciała w celu wywołania IPF. Podaj równą objętość soli fizjologicznej grupie kontrolnej.</li>
	<li>Po 21 dniach określ stopień nasilenia zwłóknienia płuc dla różnych grup myszy, które zostały adoptywnie przeniesione z PBS lub zawiesiną IM stymulowaną IL-33, oceniając ekspresję markerów zwłóknienia i wyniki Ashcrofta10.
	<ol>
		<li>Ekstrahować całkowity RNA z tkanki płucnej za pomocą odczynnika do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Analizę ilościową przeprowadzono za pomocą czytnika mikropłytek. Jeśli stosunek OD260/OD280 wynosi 1,8-2,0, czystość RNA jest wysoka. Wszystkie próbki przechowywano w temperaturze -80 ° C.</li>
		<li>Wykonaj ilościowy fluorescencyjny PCR, aby ocenić ekspresję aktyny α mięśni gładkich (SMA) i fibronektyny przy użyciu określonych starterów. 
		UWAGA: Starterami stosowanymi do α-SMA były forward 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' i reverse 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', a starterami stosowanymi do fibronektyny były forward 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' i reverse 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGGG-3'.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj immunohistochemię zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Odwodnić lewe płuco, zanurzyć je i pokroić krajalnicą do parafiny na grubość 4 μm.</li>
		<li>Ułożyć skrawki chusteczek na szkiełkach i piec je w piekarniku w temperaturze 65-70 ° C przez 30 min do 1 h. Odwoskować szkiełka z malejącą zawartością alkoholu (tj. 100%, 95%, 90%, 80% i 70% alkoholu) przez 5 min.</li>
		<li>Wybarwić szkiełka w roztworze barwnika hematoksyneliny (analitycznie czystym) przez 5 min. Następnie umyj szkiełka wodą z kranu. Namocz szkiełka w 1% alkoholu kwasu solnego przez 3 s, zmyj pływający kolor i moczyć w płynącej wodzie przez 5 minut. Sekcje zmienią kolor na niebieski.</li>
		<li>Zanurz w roztworze eozyny na 10 s do 1 minuty (określ czas barwienia w zależności od koloru), umyj wodą z kranu i umieść odpowiednio w 70%, 80%, 95%, 100% i 100% alkoholu na 5 minut każdy. Następnie umieść szkiełka w roztworach ksylenu I i ksylenu II na 3 minuty. Po wyschnięciu obserwuj i rób zdjęcia pod mikroskopem pionowym z neutralną samoprzylepną folią uszczelniającą.</li>
		<li>Wykonaj punktację Ashcrofta na sekcjach, aby wskazać stopień zwłóknienia płuc10. Przeprowadzić analizę statystyczną danych przy użyciu testu t na dwóch niezależnych próbach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immunity+in+IPF+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment.</a> Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+circular+RNA+expression+patterns+in+polarized+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).</li>
<li>Lee, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+the+development+of+acute+and+chronic+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases.</a> Cells. 10 (4), 897(2021).</li>
<li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-33+potentiates+bleomycin-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).</li>
<li>Nie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT2+regulates+pulmonary+inflammation+and+fibrosis+via+modulating+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation.</a> Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).</li>
<li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+PU.1+promotes+alternative+macrophage+polarization+and+asthmatic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).</li>
<li>Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes%3A+Advancements+and+innovation+in+the+manufacturing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+critical+for+broadly-reactive+antibody-mediated+protection+against+influenza+A+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 846(2017).</li>
<li>Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+alveolar+macrophages+attenuates+acute+ventilator+induced+lung+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats.</a> Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).</li>
<li>Hübner, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quantification+of+pulmonary+fibrosis+in+histological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples.</a> Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).</li>
<li>Tacke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+monocytes+acquire+antigens+from+other+cells+in+the+bone+marrow+and+present+them+to+T+cells+after+maturing+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).</li>
<li>Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophages%3A+A+new+therapeutic+pathway+in+fibrosing+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).</li>
<li>Wendisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+triggers+profibrotic+macrophage+responses+and+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis.</a> Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+Friend+or+foe+in+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 170(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Badanie to zapewnia skuteczną metodę zubożania, izolowania, hodowli i transferu makrofagów, co może pomóc w badaniu mechanizmów zwłóknienia płuc u myszy. Istnieje wiele metod zubożenia makrofagów myszy, takich jak podawanie tchawicy, wstrzykiwanie do żyły ogonowej i wdychanie do nosa11. W tym badaniu zoptymalizowano metodę inhalacji donosowej, która jest prosta w obsłudze i może skutecznie zubożyć makrofagi płucne 8,9. Po stymulacji IM IL-...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse&#160;with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

Idiopatyczne zwłóknienie płuc (IPF) jest rozlaną chorobą zapalną płuc spowodowaną wieloma czynnikami1. W mikrośrodowisku cytokin odpowiedzi immunologicznej Th1 i Th2 makrofagi mogą być spolaryzowane na klasycznie aktywowane makrofagi (M1) i alternatywnie aktywowane makrofagi (M2). Lipopolisacharydy (LPS) lub cytokina IFN-γ indukują makrofagi M1 do polaryzacji i produkcji cytokin prozapalnych, w tym iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α i IL-12. W przeciwieństwie do tego, cytokiny typu II IL-4 i IL-13 napędzają polaryzację makrofagów M2, które mogą wytwarzać różne czynniki promujące wzrost fibroblastów, takie jak TGF-β i PDGF, które sprzyjają zwłóknieniu płuc 2. Patologicznemu procesowi IPF towarzyszy aktywacja i infiltracja makrofagów. IPF pośredniczy w naprawie urazów, stanach zapalnych i zwłóknieniach poprzez uwalnianie cytokin3. Ponieważ dostępne są tylko ograniczone opcje terapeutyczne, badanie molekularnych mechanizmów patologicznych IPF ma ogromne znaczenie dla opracowania nowych strategii zapobiegania i leczenia IPF. Poprzednie badania przeprowadzone przez naszą grupę i innych badaczy4,5 potwierdziły zwiększone uwalnianie IL-33 u pacjentów z IPF oraz w modelach mysich z IPF indukowanym przez bleomycynę (BLM). IL-33 jest uwalniana przez komórki nabłonka i śródbłonka podczas zwłóknienia i bierze udział w aktywacji makrofagów, co skutkuje nieprawidłową proliferacją fibroblastów, infiltracją leukocytów i ostateczną utratą funkcji płuc5. Obecny protokół opisuje adoptywny transfer makrofagów śródmiąższowych (IM) stymulowanych przez IL-33 do pęcherzyków płucnych jako sposób na badanie rozwoju IPF w modelach mysich. W tym przypadku IM wyizolowano z tkanki płucnej myszy gospodarza, wyhodowano in vitro, stymulowano IL-33 przez 24 godziny, a następnie adoptywnie przeniesiono do pęcherzyków płucnych myszy biorców przez wstrzyknięcie tchawicy. Stwierdzono, że bezpośrednie zbieranie stymulowanych makrofagów myszy i ich adoptywny transfer do pęcherzyków płucnych biorcy pogarsza stopień zwłóknienia płuc i może wyraźniej zilustrować wpływ czynników stymulujących na zwłóknienie w porównaniu z poprzednimi badaniami6. Technika opisana w tym artykule może umożliwić naukowcom zbadanie funkcji makrofagów stymulowanych przez potencjalne cytokiny w rozwoju IPF.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; DMEM</td><td>Life technologies Biotechnologia, USA</td><td>1508012</td><td></td></tr><tr><td>Igła do inflatingu tętniczego</td><td>B Braun Melsingen AG, Niemcy</td><td>21G15G8393</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Źródło&nbsp; C6 Plus</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleomycin</td><td>Biotang, USA</td><td>Ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator dwutlenku węgla</td><td>Thermo Forma, USA</td><td>Thermo Forma370</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>R& D Systems, USA</td><td>1124F</td><td></td></tr><tr><td>CD11c</td><td>R & D Systems,USA</td><td>N418</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Forma, USA</td><td>174926</td><td></td></tr><tr><td>Liposomy klodronianowe&nbsp;</td><td>Liposomy klodronianu, Holandia</td><td>CI-150-150</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>10103578001</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>R& D Systems, USA</td><td>521204</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy Falcon Cell Becton</td><td>, Dickinson and Company, USA</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Technologie życia, USA</td><td>1047571</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina Eozyna&nbsp;</td><td>Nanjing Jiancheng Technology, Chiny</td><td>06-570</td><td></td></tr><tr><td>System wykrywania PCR LightCycler 480</td><td>Roche, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysi czynnik rekombinowany IL-33</td><td>Peprotech, USA</td><td>210-33</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Nikon Corporation, Japonia</td><td>941185</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina, streptomycyna</td><td>Technologie życia, USA</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan bufor (PBS)</td> <td>Guangdong Huankai Microbial Technology, Chiny</td><td>1535882</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC</td><td>Beyotime Biotechnology Company, Chiny</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>RNA Isolater</td><td>Vazyme company, Chiny</td><td>R401-01-AA</td><td>Odczynnik do ekstrakcji całkowitego RNA</td></tr><tr><td>RWD Inhalacyjna maszyna anestezjologiczna</td><td>Shenzhen Rayward Life Technology, Chiny</td><td>R500</td><td></td></tr><tr><td>Półautomatyczna parafina krajalnica</td><td>Leica, Niemcy</td><td>LeicaRM2245</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara, Japonia</td><td>410800</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0.25%</td><td>Life Technologies, Stany</td><td>Zjednoczone 1627172</td><td></td></tr></tbody></table>

adoptywny transfer makrofagów stymulowanych przez il-33 do modeli mysich indukowanych bleomycyną w celu zbadania ich wpływu na idiopatyczne zwłóknienie płuc in vivo

Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

Reakcja zapalna spowodowana wczesnym uszkodzeniem płuc jest jedną z ważnych przyczyn rozwoju idiopatycznego zwłóknienia płuc (IPF), któremu towarzyszy aktywacja komórek zapalnych, takich jak makrofagi i neutrofile, a także uwolnienie czynników zapalnych, w tym TNF-α, IL-1β i IL-6. Wiadomo, że wczesne zapalenie wywołane przez aktywowane makrofagi śródmiąższowe płuc (IM) w odpowiedzi na stymulację IL-33 odgrywa istotną rolę w patologicznym procesie IPF. Protokół ten opisuje adoptywny transfer IM stymulowanych przez IL-33 do płuc myszy w celu zbadania rozwoju IPF. Obejmuje izolację i hodowlę pierwotnych IM z płuc myszy gospodarza, a następnie adoptywny transfer stymulowanych IM do pęcherzyków płucnych myszy biorców IPF wywołanych bleomycyną (BLM) (które zostały wcześniej pozbawione makrofagów pęcherzykowych przez leczenie liposomami klodronianu) oraz patologiczną ocenę tych myszy. Reprezentatywne wyniki pokazują, że adoptywny transfer makrofagów stymulowanych przez IL-33 pogarsza zwłóknienie płuc u myszy, co sugeruje, że ustanowienie eksperymentu adoptywnego transferu makrofagów jest dobrym technicznym środkiem do badania patologii IPF.

Protokół zastosowany w tej pracy został podsumowany na schemacie w rysunku 1. W celu usunięcia makrofagów płucnych u dorosłych myszy C57BL/6 wykorzystano inhalację liposomów z klodronianem przez nos (rysunek 2), co pozwoliło na stworzenie odpowiedniego modelu myszy biorcy. Makrofagi płucne (IM) wyizolowano z innej, nieleczonej myszy (dawcy) (rysunek 3A,B) i hodowano in vitro. Wyizolowane makrofagi stymulowa...

Ten protokół opisuje izolację makrofagów śródmiąższowych płuc (IM) i ich adoptywny transfer po stymulacji pęcherzyków płucnych przez IL-33 w modelu mysim, co może ułatwić badanie in vivo idiopatycznego zwłóknienia płuc (IPF).

Adoptywny transfer makrofagów stymulowanych przez IL-33 do modeli mysich indukowanych bleomycyną w celu zbadania ich wpływu na idiopatyczne zwłóknienie płuc in vivo

The inflammatory response caused by early lung injury is one of the important causes of the development of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), which is ...

Protokół opisuje izolację IMS płuc i transfer adoptywny po oznaczeniu IL-33 w modelu mysim, co może ułatwić badanie in vivo idiopatycznego włóknienia płuc. Technika ta umożliwia naukowcom zbadanie funkcji makrofagów, symulowanych przez tradycyjne cytokiny w rozwoju IPF. Aby rozpocząć, wyjmij fiolkę z liposomami klodronianu z lodówki.Pozwól mu się ogrzać przez 30 minut w temperaturze pokojowej i odwróć kilka razy, aby zapewnić równomierne mieszanie. Odessać 60 mikrolitrów liposomów klodronianu za pomocą pipety ze sterylną końcówką ssącą. Podawać kontrolę i lek kroplami do jamy nosowej znieczulonej myszy.Po każdej kropli upewnij się, że mysz całkowicie wdycha lek i oddycha równomiernie. Po wyczerpaniu makrofagów pęcherzykowych u myszy biorcy należy rozpocząć od dezynfekcji skóry znieczulonej myszy gospodarza 75% alkoholem i jodem. Użyj nożyczek, aby przeciąć skórę i odsłonić tkankę krążeniowo-oddechową.Odessać 10 mililitrów PBS do strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 20 i włożyć końcówkę igły do prawego przedsionka myszy. Następnie przetnij dolną żyłę główną myszy nożyczkami chirurgicznymi i ręcznie perfuj mysz PBS ze stałą prędkością od 10 do 20 mililitrów na minutę, aż tkanka płucna zmieni kolor na biały. Następnie wytnij tkankę płucną i przenieś ją do lodowatego PBS w naczyniu hodowlanym.Pokrój tkankę płucną na fragmenty i dodaj 15 mililitrów pożywki DMEM zawierającej 1% kolagenazy A w celu wyizolowania makrofagów, a następnie inkubuj ją z prędkością 100 obr./min przez 30 minut na stole do wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odessać zawiesinę tkanki płucnej około 20 razy przez 10-mililitrową strzykawkę, aby była w porządku. Przefiltrować zawiesinę przez sitko o średnicy 40 mikrometrów.Odwirować filtrat o stężeniu 400 G przez 10 minut. Po odrzuceniu supernatantu należy poddać lizie czerwoną krew za pomocą trzech mililitrów buforu do lizy komórek na lodzie przez dwie do trzech minut. Wirować przy 150 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach DMEM.Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru. Zasiej komórki w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórek z przylegającą roślinnością i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby przykleić makrofagi śródmiąższowe płuc do szalek. Po godzinie odessać komórki supernatantowe i pływające.Dodać 10 mililitrów świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej i inkubować przez ponad osiem godzin lub przez noc. Aby stymulować izolowane makrofagi śródmiąższowe, zastąp zużytą pożywkę hodowlaną kompletną pożywką interleukinami 33. Przygotuj również płytkę kontrolną, dodając PBS zamiast interleukiny 33.Inkubuj płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby oddzielić makrofagi śródmiąższowe płuc, potraktuj je jednym mililitrem 0,25% trypsyny przez pięć minut. Następnie dodaj trzy mililitry świeżej pożywki kompletnej hodowli, aby wygasić trawienie i odwirować zawiesinę komórkową w celu zebrania makrofagów płucnych.Po zliczeniu komórek ponownie zawieś komórki w PBS do końcowego stężenia pięć razy 10 do piątych komórek na 50 mikrolitrów. Aby rozpocząć przenoszenie makrofagów śródmiąższowych, przymocuj kończyny znieczulonej myszy biorcy do pionowej płytki za pomocą taśmy medycznej i delikatnie pociągnij język myszy na bok za pomocą bawełnianego wacika. Po włączeniu lampy intubacyjnej należy poświetlić nią gardło myszy, aby zobaczyć tchawicę, która powinna znajdować się blisko podstawy języka.Wprowadzić kaniulę igłową na stałe do tchawicy za pomocą lampy intubacyjnej o rozmiarze 22 i przewodu prowadzącego o średnicy 0,4 milimetra. Aby zakończyć intubację, usuń drut doprowadzający i wepchnij kaniulę do tchawicy myszy. Teraz wstrzyknij 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej myszy biorcy przez tchawicę, gdy okaże się, że kaniula dostaje się do tchawicy.Po 24 godzinach należy podać bleomycynę przez tchawicę w celu wywołania idiopatycznego zwłóknienia płuc. Podaj również równą objętość soli fizjologicznej grupie kontrolnej. Po 21 dniach określ stopień nasilenia zwłóknienia płuc, oceniając ekspresję markerów zwłóknienia i wyniki Ashcrofta.Barwienie HE wykazało, że adoptywny transfer makrofagów stymulowanych interleukinami 33 pogorszył stopień zniszczenia tkanki płucnej i zwiększył agregację fibroblastów u myszy stymulowanych bleomycyną w porównaniu z kontrolą. Wzrost skali Ashcrofta ilustruje również stopień zwłóknienia płuc. Poziomy ekspresji mRNA alfa SMA i fibronektyny w tkankach płucnych myszy biorcy zawierającej adoptywnie przenoszone makrofagi śródmiąższowe stymulowane interleukinami 33 i leczone bleomycyną były wyższe w porównaniu z myszami typu dzikiego leczonymi BLM.500 mikrolitrów powietrza należy natychmiast wprowadzić do płuc za pomocą jednomilimetrowej strzykawki, aby zapewnić, że zawiesina komórek w kaniuli może całkowicie dostać się do tkanki płucnej.

adoptive-transfer-il-33-stimulated-macrophages-into-bleomycin-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy nieinwazyjne podejście do obrazowania multimodalnego oparte na Micro-CT i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny modelu zwłóknienia płuc myszy wywołanego podwójnym wkropleniem dotchawiczym bleomycyny.

Multimodalne podejście do obrazowania oparte na mikrotomografii komputerowej i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną u myszy

Opisujemy metodę znacznego zwiększenia ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc do płuc myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych z uszkodzeniem. Podejście to może być również stosowane do badania interakcji zrębu w mikrośrodowisku płuc, rozsiewu przerzutów, chorób współistniejących raka płuc oraz do bardziej efektywnego generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny zwiększa skuteczność ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc

Tutaj prezentujemy skuteczną metodę badania aktywności przeciwzwłóknieniowej ludzkich mezenchymalnych komórek zrębu podawanych dożylnie, uzyskanych z całej pępowiny po indukcji uszkodzenia płuc przez wstrzyknięcie dotchawicze bleomycyny u myszy C57BL/6. Protokół ten można łatwo rozszerzyć na badania przedkliniczne innych środków terapeutycznych.

Indukcja uszkodzenia płuc myszy przez wstrzyknięcie dotchwiaczą bleomycyny

Różne modele zwierzęce zwłóknienia płuc zostały stworzone przy użyciu bleomycyny, aby wyjaśnić patogenezę zwłóknienia płuc i znaleźć nowe cele leków. Jednak większość modeli zwłóknienia płuc ukierunkowanych na tkankę płucną ma nierównomierne podawanie leków. W tym miejscu proponujemy model jednolitego zwłóknienia płuc wywołanego nebulizacją bleomycyny nosowej.

Mysi model zwłóknienia płuc wywołanego nebulizacją bleomycyny w nosie

W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) do ilościowego oznaczania wentylowanych regionów w jednostronnym modelu zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną poprzez wkroplenie dotchawicze po stronie zmiany.

Jednostronna analiza objętości płuc za pomocą mikrotomografii komputerowej w celu lepszej oceny zwłóknienia płuc w modelach przedklinicznych

Ten protokół demonstruje technikę aspiracji ustno-gardłowej do użycia w mysim modelu zwłóknienia płuc z bleomycyną.

Podawanie bleomycyny w jamie ustnej i gardłowej w mysim modelu zwłóknienia płuc

Terapia komórkowa oferuje obiecujące leczenie dla pacjentów z przewlekłą chorobą płuc poprzez zastosowanie komórek progenitorowych do naprawy uszkodzonych tkanek i poprawy funkcji płuc. Ponieważ obrazowanie odgrywa kluczową rolę w śledzeniu integracji komórek, opisujemy tutaj śledzenie in vivo terapii komórkowej dla przewlekłej choroby płuc w modelu mysim z wykorzystaniem obrazowania cząstek magnetycznych.

Zobrazenie in vivo sterydowane obrazem śledzenia przeszczepowanych komórek macierzystych nabłonka odległych płuc w przypadku zwłóknienia płuc przy użyciu obrazowania z zastosowaniem cząstek magnetycznych

Protokół ten określa metodę wywoływania zwłóknienia płuc u myszy poprzez wielokrotne podawanie bleomycyny do jamy ustnej i gardła, uzyskując cechy patologiczne bardzo podobne do idiopatycznego zwłóknienia płuc.

Wyrafinowany mysi model idiopatycznego włóknienia płuc

Przedstawiamy protokół modelowania włóknienia płuc u myszy z wykorzystaniem aerozozolizowanej bleomycyny podanej przez tchawicę. Ta zoptymalizowana metoda umożliwia jednolite, ilościowe i precyzyjne podanie bez nacięcia chirurgicznego, zwiększając powtarzalność i wiarygodność włóknienia wywołanego bleomycyną.

Udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc

Eksperymentalny mysi model przerzutów do płuc i immunoterapii CTL do analizy oddziaływań komórek nowotworowych z limfocytami T in vivo.

Model mysi eksperymentalnej przerzutowości oraz immunoterapii z adoptywnym transferem limfocytów CTL

Poznaj izolację makrofagów płucnych i adoptywny transfer po stymulacji IL-33 w modelu mysim. Ta metoda umożliwia badanie zwłóknienia płuc in vivo oraz roli cytokin w patologii płuc.

Adoptywny transfer makrofagów stymulowanych przez IL-33 do modeli mysich indukowanych bleomycyną w celu zbadania ich wpływu na idiopatyczne zwłóknienie płuc in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Adoptywny transfer makrofagów stymulowanych przez IL-33 do modeli mysich indukowanych bleomycyną w celu zbadania ich wpływu na idiopatyczne zwłóknienie płuc in vivo

Przeglądaj więcej filmów